【國家標(biāo)準(zhǔn)】GB 5413.14-2010 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定(發(fā)布稿.僅供參考-標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng))

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)010中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布 2010布 2010施食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素 of 12in 010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 幼兒食品和乳粉 維生素 本標(biāo)準(zhǔn)與 要變化如下： 標(biāo)準(zhǔn)名稱改為嬰幼兒食品和乳品中維生素 本標(biāo)準(zhǔn)附錄 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： 413 010 1 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中維生素 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3 原理 利用萊士曼氏乳酸桿菌（ 維生素 量測定出試樣中維生素 測定用培養(yǎng)基中供給除維生素 樣微生物生長產(chǎn)生的透光率就會同標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液及未知待測溶液中維生素 以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的透光率相對于各濃度水平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出試樣中維生素 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 6682 規(guī)定的二級水。 株：萊士曼氏乳酸桿菌（ 830。 生素 12或 準(zhǔn)品：分子式 度 99%。 養(yǎng)基 酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：見附錄 A。 酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：見附錄 A。 生素 附錄 A。 注： 一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進行配制。 g/L 氯化鈉溶液（生理鹽水） 稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 中，分裝于具塞試管，每管 10 121 滅菌 15 醇溶液：體積分?jǐn)?shù)為 25 %。 水磷酸氫二鈉（ 水偏重亞硫酸鈉（ 檬酸（含一個結(jié)晶水）（ 2O）。 準(zhǔn)溶液的制備 生素 10 g /精確稱取維生素 用乙醇溶液（ 容至維生素 0 g / 010 2 生素 100 ng/用乙醇溶液（ 5.0 生素 容至 500 生素 1 ng/用乙醇溶液（ 5.0 生素 容至 500 準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取兩個 5 生素 250 500量瓶中，用水定容至刻度。高濃度溶液的濃度為 ng/濃度溶液的濃度為 ng/ 注：所有標(biāo)準(zhǔn)溶液要儲存于冰箱內(nèi)。 存期三個月， 用前配制。 5 儀器和設(shè)備 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 平：感量為 0.1 5.2 ：精度 光光度計。 旋混合器。 心機：轉(zhuǎn)速 2000 轉(zhuǎn) /分鐘。 溫培養(yǎng)箱： 36 1 。 箱： 2 5 。 菌吸管： 10 0.1 度）或微量移液器和吸頭。 口分液器： 0 10 形瓶： 200 量瓶（ A 類）： 100 250 500 刻度移液管（ A 類）：容量 5 斗：直徑 90 量濾紙：直徑 90 管： 18 180 注： 準(zhǔn)備玻璃儀器時， 使用活性劑對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進行清洗， 清洗之后要求在 200 干熱 2 h。 6 分析步驟 試菌液的制備 萊士曼氏乳酸桿菌 （ 830） 的凍干菌株 （ 活化后， 接種到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （ ， 36 1 培養(yǎng) 24 h。再轉(zhuǎn)種 2 代 3 代來增強活力。置 2 5 冰箱保存?zhèn)溆?。?15 d 轉(zhuǎn)種一次。 活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（ ， 36 1 培養(yǎng) 18 h 24 h，以 2000 轉(zhuǎn) /分鐘離心 2 3 去上清液，加入 10 理鹽水（ 混勻，再離心 2 3 去上清液，再加入 10 理鹽水（ 混勻。如前離心操作，棄去上清液。再加 10 理鹽水（ 混勻。吸適量該菌懸液于 10 理鹽水（ ，混勻制成測試菌液。 分光光度計（ 以生理鹽水（ 空白，于 550 長下測測試菌液（ 透光率，使其透光率在 60 % 80 %之間。 樣的處理 010 3 取無水磷酸氫二鈉（ 1.3 g，無水偏重亞硫酸鈉（ 1.0 g，檸檬酸（含一個結(jié)晶水） （ .2 g，用 100 溶解。 一定量的樣品 (精確到 g)， 含維生素 0 100 用 10 上述溶液 （ 合后，再加 150 ，于 121 水解 10 卻后調(diào) 用水定容至 250 濾。移取濾液 5 入水 20 30 水定容至 100 終溶液中維生素 ng/ng/重亞硫酸鈉的質(zhì)量濃度小于 mg/ 準(zhǔn)曲線的制作 按表 1 順序加入水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（ 維生素 培養(yǎng)管中，一式三份。 表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 試管號 2 4 6 8 10 水（ 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 ng/ 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 ng/ 0 0 0 0 0 0 0 3 4 5 培養(yǎng)基（ 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 測液的制作 按表 2 順序加水、樣品溶液（ 維生素 培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。 表2 待測液的制作 試管號 1 2 3 4 水（ 4 3 2 1 待測液（ 1 2 3 4 培養(yǎng)基（ 5 5 5 5 菌 將 所有的試管蓋上試管帽， 121 滅菌 5 品培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進行滅菌） 。 種 將上述試管迅速冷卻至 30 以下。用滴管或移液器向上述試管中各滴加 1 滴（約 50 L）測試菌液（ （其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中空白 外） 。 養(yǎng) 將試管放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)， 36 1 培養(yǎng) 19 h 20 h。 定 培養(yǎng)結(jié)束后，對每支試管進行目測檢查，未接種試管 培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則測定無效。 接種空白管做對照，測定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的透光率， 2 h 后重新測定。兩次結(jié)果透光率差值若小于 2 %，則取出全部檢驗管測其透光率。 未接種空白試管（ 空白，將分光光度計透光率調(diào)到 100 %（或吸光度為 0），讀出接種空白試管（ 讀數(shù)。再以接種空白試管（ 空白，調(diào)節(jié)透光率為 100 %（或吸光度為 0），依次讀出其他每支試管的透光率（或吸光度）。 010 4 渦旋混合器（ 分混合每一支試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)進行測定，波長為 550 讀數(shù)穩(wěn)定 30 s 后，讀出透光率，每支試管穩(wěn)定時間要相同。以維生素 光率為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 據(jù)待測液的透光率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得該待測液中維生素 根據(jù)稀釋因子和稱樣量計算出試樣中維生素 光率超出標(biāo)準(zhǔn)曲線管 S 3 S 10 范圍的試樣管要舍去。 每個編號的待測液的試管，用每支試管的透光率計算每毫升該編號待測液維生素 計算該編號待測液的維生素 支試管測得的該濃度不得超過該平均值的 15 %，超過者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有的四個編號的待測液的總管數(shù)的 2/3，用于計算試樣含量的數(shù)據(jù)是不充分的 , 需要重新檢驗。如果符合要求的管數(shù)超過原來管數(shù)的 2/3，重新計算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液中維生素 此平均值計算全部編號試樣管的總平均值為用于計算試樣中的維生素 注： 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，既可讀取透光率（ T %） ，也可讀取吸光度（ A） 。 7 分析結(jié)果的表述 試樣中維生素 (1) 計算： 1001000= (1) 式中： X試樣中維生素 位為微克每百克表示（ g/100 g） ； 計算所得的總平均值，單位為納克（ ； m 試樣的質(zhì)量，單位為克（ g） ； f稀釋倍數(shù)。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的 10 %。 9 其他 本標(biāo)準(zhǔn)檢出限為 g/100g。 010 5 附錄 A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑 酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 分 番茄汁 100 號蛋白胨 7.5 g，酵母浸膏 7.5 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，瓊脂 14.0 g，水 1000 25 5 ）。 法 先將除瓊脂以外的其他成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) 加入瓊脂，加熱煮沸至完全溶解?；旌暇鶆蚝蠓盅b試管，每管 10 121 高壓滅菌 15 用。 酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 分 番茄汁 100 號蛋白胨 7.5 g，酵母浸膏 7.5 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，水 1000 25 5 ）。 法 先將上述成分（ 解于水中，調(diào)節(jié) 熱煮沸，混合均勻后分裝試管，每管 10 121 高壓滅菌 15 用。 生素 成分 無維生素酸水解酪蛋白 15.0 g，葡萄糖 40.0 g，天門冬酰胺 0.2 g，醋酸鈉 20.0 g，抗環(huán)血酸 4.0 g，.4 g， .4 g，硫酸腺嘌呤 20.0 酸鳥嘌呤 20.0 嘧啶 20.0 嘌呤20.0