【基金標(biāo)書】2010CB912200-基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能及作用機(jī)制研究

項(xiàng)目名稱： 基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能及作用機(jī)制研究 首席科學(xué)家： 尹玉新 北京大學(xué) 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門： 教育部 一、研究?jī)?nèi)容 （ 一）擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題 面對(duì)我國(guó)生命和健康科學(xué)的重大需求和癌癥等重大疾病研究的挑戰(zhàn)，結(jié)合我們前期的研究基礎(chǔ)，本項(xiàng)目將圍繞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性這一中心課題，選擇細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的各個(gè)環(huán)節(jié)，從蛋白質(zhì)群入手解決如下關(guān)鍵科學(xué)問題： 1. 蛋白質(zhì)群在 細(xì)胞生長(zhǎng)分裂過程中細(xì)胞周期各個(gè)階段的調(diào)控機(jī)制和相互作用。相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路在 細(xì)胞增殖過程中如何維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。 細(xì)胞異常增殖過程中相關(guān)蛋白質(zhì)群的變化規(guī)律及其對(duì)細(xì)胞周期和基因組穩(wěn)定性的影響。 2. 癌基因 細(xì)胞增殖和凋亡的分子調(diào)控機(jī)制， 其中發(fā)揮的作用。 （ 二）主要研究?jī)?nèi)容 1. 研究真核細(xì)胞 定 相互作用蛋白及闡明它們的生化功能；大規(guī)模確定新的明 定的機(jī)理以及 示檢驗(yàn)點(diǎn)在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用；從 S 期細(xì)胞中鑒定新的受 挑選適當(dāng)?shù)墓δ芑蚧虻鞍祝诩?xì)胞水平和整體水平（動(dòng)物模型）分析、驗(yàn)證，且探討其機(jī)制及意義。 2. 檢測(cè)有絲分裂期間 定更多檢測(cè) 用；通過基因敲除小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型評(píng)價(jià)有絲分裂破壞與腫瘤發(fā)生的關(guān)系；深入探討 網(wǎng)絡(luò)。 3. 以癌癥和衰老模型為主要研究對(duì)象，對(duì)前期已鑒定出的，與癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移及衰老密切相關(guān)蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能及蛋白質(zhì)糖基化修飾研究，探究其相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從蛋白質(zhì)水平上揭示腫瘤或衰老細(xì)胞增殖異常的分子機(jī)制。研究調(diào)控細(xì)胞周期 期的新蛋白 過對(duì)其所調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)群的相互作用研究，揭示其調(diào)控細(xì)胞周期和腫瘤侵襲性生長(zhǎng)的分子機(jī)制。 4. 篩選 路上游調(diào)節(jié)蛋白及下游靶基因，探索該通路已知蛋白之間的動(dòng)態(tài)互作及通路激活機(jī)制，檢測(cè) 而影響基因組穩(wěn) 定性的分子機(jī)制；探索 微管結(jié)合蛋白之間的關(guān)系， 解析上述各蛋白協(xié)同或獨(dú)立調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、影響基因組穩(wěn)定性的分子機(jī)理。 二、預(yù)期目標(biāo) （一）總體目標(biāo) 瞄準(zhǔn)國(guó)家戰(zhàn)略需求和國(guó)際腫瘤相關(guān)科學(xué)研究前沿，從與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群這一關(guān)鍵科學(xué)問題出發(fā)，在細(xì)胞周期的各個(gè)環(huán)節(jié)探討相關(guān)蛋白質(zhì)群的分子調(diào)控機(jī)制以及相互作用網(wǎng)絡(luò)。在此基礎(chǔ)上，鑒定一批新的與細(xì)胞正常、異常增殖調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)群，建立全細(xì)胞水平的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)；確定一些與維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定 性相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)群的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用和一些重要靶蛋白的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制，并研究它們的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，還將探索一些與細(xì)胞周期失調(diào)后決定細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。通過本課題的實(shí)施將使我國(guó)在細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白研究的相關(guān)領(lǐng)域達(dá)到或領(lǐng)先國(guó)際水平。同時(shí)，以本項(xiàng)目的實(shí)施為契機(jī) , 促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科研究的銜接和集成，培養(yǎng)一批交叉學(xué)科新型研究隊(duì)伍。 （二）五年目標(biāo) 1. 確定 規(guī)模確定新的 闡明 示檢驗(yàn)點(diǎn)在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。鑒定 期細(xì)胞中新的受 2. 評(píng)價(jià) 定更多與有絲分裂調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)群。揭示抑癌基因 臨床診斷和化療提供理論基礎(chǔ)。 3. 揭示蛋白質(zhì)群在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移及衰老中的生物學(xué)功能，著重研究調(diào)控細(xì)胞周期的新蛋白 過對(duì)其所調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)群的研究，揭示其調(diào)控細(xì)胞周期的分子機(jī)制。通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記建立細(xì)胞核蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)表達(dá)分析鑒定的實(shí)驗(yàn)方法，并由此獲得新的標(biāo)志蛋白；針對(duì)所發(fā)現(xiàn)的新的相互作用蛋白，驗(yàn)證其與靶蛋白的相互關(guān)系并確定其生物功能并鑒定出關(guān)鍵核蛋白質(zhì)修飾類型與可用于新藥開發(fā)的重要靶標(biāo)，并探討其在腫瘤治療、延緩衰老和保護(hù)細(xì)胞方面應(yīng)用的可能性。 4. 闡明 定新的靶蛋白及其在定 示 心分子對(duì)基因組穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制； 分析 探討 管結(jié)合蛋白質(zhì)群 的關(guān)系及其 在調(diào)控細(xì)胞分裂和誘發(fā)凋亡中的作用 。 5. 取得具有國(guó)際影響的原創(chuàng)性成果，在國(guó)際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文 50篇以上。其中，在影響因子大于 10的刊物發(fā)表 15養(yǎng)一批從事腫瘤基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的交叉學(xué)科人才。 三、研究方案 （一）總體研究思路、技術(shù)路線及可行性分析 1. 總體研究思路 在細(xì)胞增殖過程中遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性有賴于細(xì)胞周期的系統(tǒng)調(diào)節(jié)， 復(fù)制和 白質(zhì)群在此過程中的相互作用使細(xì)胞周期的精密調(diào)控成為可能。 機(jī)體通過細(xì)胞周期調(diào)控維持基因組穩(wěn)定性，這一過程是經(jīng)由細(xì)胞周期的各個(gè)環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞周期分為 S、 期，研究細(xì)胞周期的調(diào)控應(yīng)該分解到細(xì)胞周期自然過程的各個(gè)環(huán)節(jié)中。細(xì)胞周期調(diào)控的正常進(jìn)行以及遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性與腫瘤的發(fā)生以及衰老等生命重大事件密切相關(guān)。因此，鑒定參與調(diào)控細(xì)胞周期各個(gè)環(huán)節(jié)的蛋白質(zhì)群并且評(píng)價(jià)這些蛋白質(zhì)群在調(diào)控細(xì)胞周期的各個(gè)階段、維持基因組穩(wěn)定性中所發(fā)揮的作用機(jī)制以及蛋白質(zhì)群之間的相互作用對(duì)于癌癥等重大疾病研究 至關(guān)重要。對(duì)我們認(rèn)識(shí)與了解這些疾病發(fā)生的機(jī)理，有效防治這些疾病具有重大意義。 基于以上思路，本課題重點(diǎn)圍繞細(xì)胞周期的各個(gè)環(huán)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)群開展研究，闡明這些蛋白質(zhì)群在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期： 成、有絲分裂期的調(diào)控機(jī)制。評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)群對(duì)于細(xì)胞周期調(diào)控正常進(jìn)行，維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。在此基礎(chǔ)上，我們將利用一個(gè)大型高通量蛋白質(zhì)分析平臺(tái)，大規(guī)模鑒定和分析與細(xì)胞周期調(diào)控和維持基因組穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白質(zhì)群， 探究其相互作用蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 此外，我們還將研究多細(xì)胞生物如何處理細(xì)胞周期失調(diào)而發(fā)生遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定的情況 下而對(duì)細(xì)胞命運(yùn)進(jìn)行調(diào)節(jié)，探討細(xì)胞生存、死亡與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的綜合關(guān)系，即在細(xì)胞周期失調(diào)、基因組不穩(wěn)定的情況下通過何種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)，對(duì)細(xì)胞生存和死亡進(jìn)行決斷。這將不僅闡釋機(jī)體清除癌細(xì)胞的機(jī)制，還將為癌癥治療提供更多的靶向藥物選擇。 細(xì)胞生長(zhǎng)和 制相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題 1有 絲分裂 和 復(fù)相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題 2細(xì)胞 異 常增殖相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題 3調(diào)節(jié) 細(xì)胞 增殖 和凋亡蛋白 質(zhì) 群課題 4細(xì)胞生長(zhǎng)和 復(fù) 制相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題細(xì)胞生長(zhǎng)和 復(fù) 制相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題課題有 絲分裂 和 修 復(fù)相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題有 絲分裂 和 修 復(fù)相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題課題細(xì)胞 異 常增殖相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題細(xì)胞 異 常增殖相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題課題調(diào)節(jié) 細(xì)胞 增殖 和凋亡蛋白 質(zhì) 群課題調(diào)節(jié) 細(xì)胞 增殖 和凋亡蛋白 質(zhì) 群課題課題附圖：主要技術(shù)途徑流程圖 2. 技術(shù)路線 根據(jù)我們的學(xué)術(shù)思路，本項(xiàng)目的總體研究技術(shù)途徑如附圖所示。研究細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期相關(guān)蛋白質(zhì)群的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控機(jī)制和相互作用，并且闡述細(xì)胞正常增殖過程中遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的維持。還將研 究細(xì)胞異常增殖中蛋白質(zhì)群的變化和細(xì)胞凋亡的程序控制。主要途徑為：【課題一】 用遺傳的方法篩選 接從細(xì)胞內(nèi)分離 蛋白親和層析的方法分離 用生化，遺傳及熒光單分子技術(shù)闡明一些已知及一些新確定的 明 基因干擾技術(shù)（ 示該通路相關(guān)的檢驗(yàn)點(diǎn)在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。采用基因表達(dá)譜芯片或蛋白組學(xué)的方法，與課題二和課題三合作，篩選受 定 期細(xì)胞中新的受 課題二】確定 用基因芯片技術(shù)鑒定出新的 采用染色質(zhì) 法確定 用蛋白質(zhì) 通過傳統(tǒng)的蛋白 質(zhì) 定向誘變、熒光素酶 分析等方法 檢測(cè) 用，利用課題組三的蛋白質(zhì)分析平臺(tái)鑒定 過建立小鼠動(dòng)物模型從活體角度綜合評(píng)價(jià) 持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的重要性。最后利用這一動(dòng)物模型揭示抑癌基因 課題三】 以癌癥和衰老模型為主要研究對(duì)象， 探討在細(xì)胞異常增殖過程中相關(guān)蛋白質(zhì) 群，如 變化規(guī)律。通過對(duì)目的基因進(jìn)行表達(dá)干預(yù)（過表達(dá)或沉默），從體外到體內(nèi)深入研究候選蛋白質(zhì)群對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控的影響。結(jié)合信號(hào)通路的特異性抑制藥物等分析目的基因表達(dá)干預(yù)后導(dǎo)致的新差異蛋白及所涉及的信號(hào)通路。采用 用穩(wěn)定同位素標(biāo)記并結(jié)合高靈敏度的生物質(zhì)譜鑒定技術(shù)，研究細(xì)胞核蛋白質(zhì)和 飾位點(diǎn)，闡明其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其在衰老過程中的功能。 采用 在體鑒定快速腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，提高甄 別在細(xì)胞周期中調(diào)控異常增殖蛋白質(zhì)群的效率。選擇調(diào)控細(xì)胞異常增殖的代表性新蛋白，建立其與腫瘤病人的相關(guān)性?！菊n題四】研究 示 析 全基因組水平上通過干擾基因的表達(dá)（ 選 結(jié)合微陣列分析鑒定 過上位分析（ 過質(zhì)譜分析鑒定蛋白修飾，特別是磷酸化修飾調(diào)控 統(tǒng)分析 析 胞增殖以及基因組穩(wěn)定性之間的關(guān)系；通過蛋白共定位研究探討 而探討多細(xì)胞生物在細(xì)胞周期失調(diào)而發(fā)生遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定的情況下如何對(duì)細(xì)胞命運(yùn)進(jìn)行調(diào)節(jié) 。各課題組還將充分利用課題組三具備的大型蛋白質(zhì)鑒定分析技術(shù)平臺(tái)對(duì) 更多參與維持基因組穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)群進(jìn)行大 規(guī)模鑒定和分析。 3. 可行性分析 (1) 本項(xiàng)目的科研隊(duì)伍以從事生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)等國(guó)家和部門重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、教育部 985創(chuàng)新平臺(tái)為主體，集中了目前從事基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)群研究的優(yōu)勢(shì)科研團(tuán)隊(duì)。其中，各課題負(fù)責(zé)人都是本領(lǐng)域的專家，親自設(shè)計(jì)各自的課題并將指導(dǎo)項(xiàng)目的具體實(shí)施。 (2) 本項(xiàng)目著眼于大規(guī)模蛋白質(zhì)組（群）而非單個(gè)蛋白的研究。 2007年 10月召開的國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)組織大會(huì)標(biāo)志著從大規(guī)模技術(shù)性研究向差異和動(dòng)態(tài)組學(xué)研究的趨勢(shì)。但迄今已有的技術(shù)幾乎都限于檢測(cè) 和比較蛋白的累積量。課題三近期自主建立的 術(shù)對(duì)蛋白真正表達(dá)水平差異的測(cè)定提供了更敏感和更精密的手段，并且保持了高通量的能力。另一方面利用穩(wěn)定同位素同時(shí)摻入細(xì)胞核蛋白質(zhì)和 些新技術(shù)方法都是針對(duì)細(xì)胞調(diào)控中的蛋白質(zhì)組（群）動(dòng)態(tài)研究而開發(fā)的。本研究具備扎實(shí)的前期研究工作基礎(chǔ)和創(chuàng)新技術(shù)平臺(tái)，以及用于功能研究的基因敲除動(dòng)物模型和高精確度的質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)表達(dá)和蛋白質(zhì)修飾平臺(tái)。良好的工作基礎(chǔ)和強(qiáng)大的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)為本課題研究計(jì)劃的順利 進(jìn)行提供了有力的保障。 (3) 參加本項(xiàng)目研究的各實(shí)驗(yàn)室具備優(yōu)良的研究條件。同時(shí)，各課題間早已經(jīng)形成了緊密的協(xié)作關(guān)系，各方面的研究相互交叉、組成了一個(gè)有機(jī)的整體。 課題二中建立的基因敲除小鼠模型以及轉(zhuǎn)基因小鼠模型在國(guó)際上也具有領(lǐng)先地位，為其他課題順利實(shí)施提供了珍貴的活體動(dòng)物模型。課題三的高通量蛋白質(zhì)鑒定和分析平臺(tái)為其他各個(gè)課題組的研究分析提供了可靠、高效的技術(shù)平臺(tái)。 （二）創(chuàng)新點(diǎn) 1. 本項(xiàng)目瞄準(zhǔn)國(guó)際前沿，面向國(guó)家需求，綜合利用多學(xué)科優(yōu)勢(shì)，集中針對(duì)遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和相互作用，展開多層 面更又互相關(guān)聯(lián)的研究。 2. 本項(xiàng)目將細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期有機(jī)地整合在一起，通過研究各個(gè)環(huán)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)群及其調(diào)控和相互作用機(jī)理而探討這些蛋白質(zhì)群對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制，評(píng)價(jià)其作為有機(jī)整體和分子網(wǎng)絡(luò)對(duì)遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上大規(guī)模鑒定和分析與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的各種蛋白質(zhì)群，并探索這些蛋白質(zhì)群之間的相互作用，構(gòu)建與細(xì)胞周期調(diào)控和基因組穩(wěn)定性維持相關(guān)的蛋白質(zhì)組分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，還進(jìn)一步研究當(dāng)細(xì)胞周期失調(diào)發(fā)生遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定后，多細(xì)胞生物作為有機(jī)整體利用何種機(jī)制對(duì)細(xì)胞命運(yùn)進(jìn)行決斷，從而綜合性評(píng)價(jià)細(xì)胞周期 調(diào)控與基因組穩(wěn)定性的內(nèi)在聯(lián)系和相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能和相互作用。 3. 本項(xiàng)目 在研究?jī)?nèi)容方面具有完全創(chuàng)新性： 孔道春實(shí)驗(yàn)室在裂殖酵母 S. 們證明 鐵邦教授在細(xì)胞周期和 現(xiàn)了一條新的調(diào)控通路（ 該通路在 1玉新課題組研究設(shè)想 這種調(diào)節(jié)在國(guó)際上也是全新發(fā)現(xiàn)。 張宏權(quán)課題組發(fā)現(xiàn)跨膜 受體整合素結(jié)合蛋白 絲分裂 中期（ 必須的，并證明這一作用是通過一個(gè)全新的 肖雪媛和紀(jì)建國(guó)課題組以腫瘤和衰老為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究新發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞增殖異常相關(guān)蛋白的生物學(xué)功能及組蛋白修飾變化規(guī)律。而以此為基礎(chǔ)構(gòu)建靶蛋白表達(dá)干預(yù)后的交替多輪差異蛋白篩選策略。 4. 本項(xiàng)目在研究方法方面也具有獨(dú)到之處，在國(guó)際上處于領(lǐng)先水平。 尹玉新課題組 在多年的研究基礎(chǔ)上，發(fā)展了一系列體內(nèi)、體外活體研究模型，例如小鼠基因敲除模型系統(tǒng)：他們已經(jīng)成功敲除 且建立了一系列 過這些模型檢測(cè) 究 這些作用可與特定小鼠模型的腫瘤發(fā)生直接關(guān)聯(lián)，從而更加直觀地評(píng)價(jià) 外，他們正在建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型預(yù)測(cè)某些重要蛋白過度表達(dá)是否可促進(jìn)腫瘤發(fā)生。 張宏權(quán)課題組首次在斑馬魚 模型中建立了在 3 7天內(nèi)在體鑒定腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，為增殖異常的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模體內(nèi)評(píng)價(jià)提供了快速、經(jīng)濟(jì)和方便 的最新方法。 肖雪媛課題組則首次提出使穩(wěn)定同位素同時(shí)摻入細(xì)胞核蛋白質(zhì)和 而可以快速、定量鑒定表觀遺傳修飾的動(dòng)態(tài)變化，這將有助于組蛋白修飾密碼及其作用機(jī)制的確定。 （三）課題設(shè)置 課題一： 真核細(xì)胞 研究目標(biāo)： 本課題將研究真核細(xì)胞 定 定人細(xì)胞的 規(guī)模確定新的 明 明 示檢驗(yàn)點(diǎn)在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。闡明 示檢驗(yàn)點(diǎn)在維持復(fù)制叉穩(wěn)定的作用；鑒定 研究?jī)?nèi)容： 1. 確定 采用下面三種方法確定 是用遺傳的方法篩選 是直接從細(xì)胞內(nèi)分離 是用蛋白親和層析的方法分離 2. 確定新的 在裂殖酵母 S. 果另一個(gè)復(fù)制蛋白由于突變使得它的活性降低，該蛋白就能拮抗 該方法已經(jīng)篩選到了幾百個(gè)突變株，現(xiàn)正確定它們的突變基因，并進(jìn)一步與課題組三合作，利用高通量蛋白質(zhì)鑒定分析平臺(tái)研究新的 3 闡明 已發(fā)現(xiàn) 也發(fā)現(xiàn) 暗示 用生化和遺傳的方法確定該蛋白，并最終闡明 4 鑒定新的 其機(jī)理和調(diào)控機(jī)制 本課題組最近發(fā)現(xiàn)，在 期的調(diào)控中也起重要作用。將用 基因表達(dá)譜芯片或蛋白組學(xué)的方法， 鑒定新的 受 挑選適當(dāng)?shù)墓δ芑蚧虻鞍?，在?xì)胞水平和整體水平（動(dòng)物模型）進(jìn)行分析、驗(yàn)證，并探討其作 用機(jī)制及意義。同時(shí)，本課題組還發(fā)現(xiàn) 而調(diào)控有絲分裂的過程 。本課題擬鑒定 被 討 承擔(dān)單位：中山大學(xué)、北京大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人：康鐵邦， 特聘教授， 42歲 , 中山大學(xué)腫瘤防治中心 學(xué)術(shù)骨干：孔道春、張麗君等 預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 課題二： 研究目標(biāo)： 本課題旨在探討 首先了解 后研究 三建立活體動(dòng)物模型以評(píng)價(jià) 后揭示 研究?jī)?nèi)容： 1. 檢測(cè)有絲分裂期間 示著絲粒中 體外和體內(nèi)的 絲粒 察 色體錯(cuò)排和分離錯(cuò)誤，以及恢復(fù)著絲粒功能和關(guān)卡應(yīng)答。 利用基因芯片技術(shù)鑒定出新的 采用染色質(zhì) 法確定 2. 鑒定與 我們已建立了成熟的蛋白質(zhì) 且成功地發(fā)掘出與有絲分裂相關(guān)的蛋白激酶，如 課題將利用這一成熟的系統(tǒng)通過標(biāo)記 有絲分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)群。通過傳統(tǒng)的蛋白質(zhì) 定向誘變、熒光素酶 分析等方法 檢測(cè) 用并且利用課題組三的蛋白質(zhì)分析平臺(tái)鑒定 3. 建立 評(píng)價(jià) 前期研究中已成功地建立了條件性 些 利用這些模型評(píng)價(jià) 絲分裂及其維持基 因組穩(wěn)定性的作用，并且衡量基因組不穩(wěn)定性與腫瘤發(fā)生的因果關(guān)系。 4. 揭示 課題組的前期研究結(jié)果顯示： 失去 致自發(fā)性細(xì)胞死亡。我們將利用已建立的組織特異性 此評(píng)價(jià)抑癌基因之間的分子網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系及對(duì)化療藥物敏感性的影響，為臨床化療、藥物的篩選提供理論依據(jù)。 承擔(dān)單位：北京大學(xué)、中山大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 尹玉新，教授， 49歲 , 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 學(xué)術(shù)骨干： 張輝等 預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 課題三： 細(xì)胞增殖異常模型中的相關(guān)蛋白質(zhì)群及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究 研究目標(biāo)： 本課題以腫瘤和衰老模型為主要研究對(duì)象，對(duì)前期已鑒定出的，與癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移及衰老密切相關(guān)蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能的研究，鑒定新的參與細(xì)胞周期 期的蛋白并研究其在細(xì)胞異常增殖過程中的作用。從蛋白質(zhì)群調(diào)控網(wǎng)絡(luò)水平上揭示細(xì)胞增殖調(diào)控失常的分子機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容： 1、對(duì)已初步選定的一些與異常增殖特異相關(guān)的關(guān)鍵蛋白， 如 和 用基因干擾技術(shù)和 課題二中所建立的轉(zhuǎn)基因小鼠和 條件性基因敲除 等平臺(tái)，從體外培養(yǎng)細(xì)胞到體內(nèi)動(dòng)物模型驗(yàn)證并研究其在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移以及衰老過程中的生物功能及其變化規(guī)律。 2、利用 選鑒定腫瘤或衰老相關(guān)蛋白的相互作用蛋白及其在干預(yù)靶蛋白情況下的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。結(jié)合信號(hào)通路特異性抑制劑等手段探索和確定其所參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是與 路的關(guān)系。闡明其導(dǎo)致調(diào)控異常的分子機(jī)制。 3、利用前期研究所建立的體內(nèi)快速檢驗(yàn)異常增殖的與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)群的斑馬魚 技 術(shù)平臺(tái) ，鑒定出調(diào)控腫瘤細(xì)胞異常增殖的重要蛋白質(zhì)群，并在臨床病人中建立相關(guān)性驗(yàn)證，以明確其在腫瘤診斷、預(yù)防和治療中的意義，以及作為潛在藥物靶標(biāo)的可能性。 4、進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化已初步建立的，可對(duì)組蛋白基因調(diào)控區(qū)的甲基化等修飾及修飾位點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)性定量鑒定的新技術(shù)，進(jìn)而探索特殊修飾在細(xì)胞增殖調(diào)控異常中的作用。力求發(fā)現(xiàn)和鑒定個(gè)關(guān)鍵核蛋白質(zhì)修飾類型及有可能用于新藥開發(fā)的重要靶標(biāo)。 承擔(dān)單位：北京師范大學(xué)、北京大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人：張宏權(quán)，教授， 46歲，北京大學(xué) 學(xué)術(shù)骨干：肖雪媛、紀(jì)建國(guó)等 預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 課題四： 調(diào)控細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究 研究目標(biāo)： 本課題將主要研究 析微 研究?jī)?nèi)容： 1、 過上位分析（ 過質(zhì)譜分析鑒定 別是激酶 2、鑒定新的靶蛋白。利用已有的 過 定新的 通過上位分析（ 定其在 3、鑒定 課題組三合作，利用高通量蛋白質(zhì)分析平臺(tái)和已制備的 過小分子定新的 別是上游調(diào)控分子并分析其功能，分析通路的激活機(jī)制。 4、系統(tǒng)分析 速離心分離細(xì)胞組分，確定 胞質(zhì)、細(xì)胞核以及細(xì)胞器的定位；在細(xì)胞整體水平上觀察通路蛋白的定位與轉(zhuǎn)位，分析引起蛋白轉(zhuǎn)位的因素與意義； 可以調(diào)控中心體的復(fù)制與染色體的分離，從而影響基因組的穩(wěn)定性。我們將與課題組二合作，探討三者之間的相互關(guān)系，為 5、探索 析上述各蛋白協(xié)同或獨(dú)立調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)理 。 承擔(dān)單位：南開大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 吳世安 ，教授， 40歲， 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院特聘教授 學(xué)術(shù)骨干：周軍、朱玉山等 預(yù)算經(jīng)費(fèi)： （四）各課題間的相互關(guān)系，以及與項(xiàng)目總體目標(biāo)和五年目標(biāo)的關(guān)系 根據(jù)總體目標(biāo)的要求，本項(xiàng)目的中心思想是維持細(xì)胞增殖與分裂過程中遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，而這一穩(wěn)定性的維持有賴于細(xì)胞周期的精細(xì)調(diào)節(jié)，在此過程中不同蛋白組群相互作用、相互影響和相互調(diào)節(jié)。本課題組將根據(jù)這個(gè)原則進(jìn)行分解、設(shè)計(jì)，了解與探索在細(xì)胞周期各個(gè)階段蛋白質(zhì)活動(dòng)的規(guī)律 ，探索信息傳導(dǎo)在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)過程中的重要作用，評(píng)價(jià)細(xì)胞生存和死亡調(diào)控機(jī)制的價(jià)值。各個(gè)項(xiàng)目圍繞細(xì)胞周期的不同階段或不同檢驗(yàn)點(diǎn)，選擇特定的研究渠道進(jìn)行機(jī)制研究和探索。各個(gè)課題之間相互聯(lián)系、互相促進(jìn)，旨在實(shí)現(xiàn)本項(xiàng)目的總體目標(biāo)，即從與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群這一關(guān)鍵科學(xué)問題出發(fā)，在細(xì)胞周期的各個(gè)環(huán)節(jié)探討相關(guān)蛋白質(zhì)群的分子調(diào)控機(jī)制以及相互作用網(wǎng)絡(luò)。 本項(xiàng)目五年目標(biāo)的完成則具體表現(xiàn)在以上所述四個(gè)課題的研究計(jì)劃中：課題一、著重研究 時(shí)研究 作用 ；課題二、了解有絲分裂過程中 將進(jìn)一步探討 上兩個(gè)課題主要探討細(xì)胞正常生長(zhǎng)分裂過程中的兩個(gè)重要事件： 題三則利用現(xiàn)有的蛋白質(zhì)分析技術(shù)平臺(tái)來對(duì)細(xì)胞異常增殖中涉及的各種蛋白質(zhì)群進(jìn)行系統(tǒng)的大規(guī)模的鑒定和分析，以達(dá)到全面理解細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中各個(gè)系統(tǒng)蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制和形式。此外，細(xì)胞周期的完善與精細(xì)調(diào)節(jié)體現(xiàn)在遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的保持。如果細(xì)胞周期不能進(jìn)行正確調(diào)節(jié)，多細(xì)胞系統(tǒng)將通過信號(hào)傳遞及 細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的存亡。課題四將研究不同細(xì)胞信號(hào)通路如何對(duì)細(xì)胞的生存和死亡進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。因而，以上四個(gè)課題相互關(guān)聯(lián)，層次遞進(jìn)，從作為中心的遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性，到細(xì)胞周期各階段的精確調(diào)節(jié)，到細(xì)胞周期失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，再到異常增殖導(dǎo)致的細(xì)胞信號(hào)通路的改變對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。這些從細(xì)胞周期衍生出來的變化，讓細(xì)胞必須做出抉擇：生或死；正常增殖或發(fā)生腫瘤。 課題組間在技術(shù)平臺(tái)層面還存在廣泛的聯(lián)系和互助。課題一的高精度蛋白分離技術(shù)將會(huì)用于所有課題所面臨的蛋白質(zhì)純化和分析的需求；課題二的基因敲除小鼠模型系統(tǒng)和課 題三的斑馬魚腫瘤轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)可為其它課題組提供珍貴的活體動(dòng)物模型，同時(shí)課題三建立的快速鑒定調(diào)控細(xì)胞異常增殖蛋白質(zhì)群的動(dòng)物在體技術(shù)平臺(tái)，將大大加速對(duì)四個(gè)課題研究的與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能研究，并結(jié)合不同信號(hào)通路的在體研究，有助于快速揭示這些蛋白質(zhì)群的作用機(jī)制；課題四的果蠅細(xì)胞快速增殖模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于測(cè)試各個(gè)課題組鑒定出的新的蛋白質(zhì)群的功能。 四、年度計(jì)劃 第一年： 研究?jī)?nèi)容 1. 篩選與 互作用的蛋白，并且大規(guī)模鑒定和 制有關(guān)的蛋白。 2. 建立穩(wěn)定高表達(dá) 3. 確定 便最大限度地純化出 4. 基因芯片法篩選出差異基因群，該基因群可能在轉(zhuǎn)錄水平直接或間接受 5. 著手研究 其意義。 6. 創(chuàng)建一系列 使其在結(jié)構(gòu)上具有 這些 體轉(zhuǎn)染 + 胞。對(duì)細(xì)胞周期中不同時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行分析以獲得 7. 在含有野生型 系中對(duì)動(dòng)粒功能進(jìn)行分析。 8. 建立 除 統(tǒng)和 導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。通過 9. 通過基因表達(dá)干預(yù)等方法從體內(nèi)外系統(tǒng)研究與肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)蛋白 10. 建立神經(jīng)細(xì)胞衰老和衰老模型，制備不同發(fā)育或分化階段的樣品材料，進(jìn)行亞細(xì)胞器分級(jí)實(shí)驗(yàn)，提取關(guān)鍵蛋白質(zhì)組分。 11. 在 并在腫瘤病人標(biāo)本上建立相關(guān)性。 12. 利用微陣列方法鑒定 13. 合成雙鏈 建果蠅 14. 完成 路主要已知組成蛋白如 及微管結(jié)合蛋白蛋白 析上述蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位、共定位與轉(zhuǎn)位情況。 15. 分析微管結(jié)合蛋白對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，檢測(cè)微管結(jié)合蛋白在腫瘤和對(duì)照組織中表達(dá)水平的變化及其表達(dá)對(duì)反映細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡的克隆形成率的影響，并通過 析微管結(jié)合蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的 影響。 16. 制備并純化 預(yù)期目標(biāo) 1. 質(zhì)譜確定和 互作用的候選蛋白。篩選得到一些和 互作用的蛋白。篩選得到 100個(gè)突變株。并開始突變株的形態(tài)分析、開始突變株突變基因的確定。 2. 分別得到 3株以上穩(wěn)定高表達(dá) 3. 初步確定 4. 篩選出干擾 5. 確定 步確定 6. 揭示動(dòng)粒中 7. 確定 集和集合障礙，動(dòng)粒 8. 完成不同 定 9. 確認(rèn) 或發(fā)展中的生物學(xué)作用。 10. 獲得不同發(fā)育和衰老階段的亞細(xì)胞器樣品。 11. 選擇 2 調(diào)的與腫瘤增殖和侵襲有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，闡明其調(diào)控機(jī)制。 12. 得到 量表達(dá)后靶蛋白表達(dá)增加與減少的順序列表，分析得到 3候選蛋白用于進(jìn)一步分析。 13. 完成約 5， 000個(gè)果蠅基因雙鏈 14. 獲得 定位和轉(zhuǎn)位情況，完成對(duì) 15. 獲得微管結(jié)合蛋白對(duì)參與調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡機(jī)制的了解。 16. 得到 第二年： 研究?jī)?nèi)容 1. 用體外生化方法，驗(yàn)證和 手開展這些蛋白基因的突變株的篩選。開始篩選人細(xì)胞的 2. 對(duì)第一年篩選的突變株進(jìn)行形態(tài)分析，確定突變株的突變基因。 列對(duì)比分析這些基因表達(dá)的蛋白及可能的功能域。 3. 體外驗(yàn)證和 互作用的蛋白。 研究 路的中間蛋白。著手開始篩選這些蛋白的突變株并開始功能分析。 4. 利用生物信息學(xué)找出其中與細(xì)胞周期、 5. 利用 用 6. 以 規(guī)模純化 胞系與對(duì)照 胞系裂解蛋白， 及生物信息學(xué)鑒定出差異蛋白群。 7. 深入探討 8. 將 過免疫熒光法和活細(xì)胞成像對(duì)上述細(xì)胞中的染色體排列和分離進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 9. 采用 略從人類乳癌 胞中分離純化在核內(nèi)與 所得蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析后 搜索蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。 10. 采用染色質(zhì)免疫共沉淀法（ 測(cè) 動(dòng)子 理上的關(guān)聯(lián)。熒光素酶分析法檢測(cè) 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。進(jìn)行 指紋圖譜分析，通過核心指紋圖譜系統(tǒng)精確限定 動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域。在 動(dòng)子區(qū)域構(gòu)建一系列的缺失來縮小 合的最小的必需序列。 11. 在第一年工作的基礎(chǔ)上，采用 100對(duì)獲得的候選蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。通過免疫共沉淀等方法對(duì)其中感興趣的候選蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。 12. 對(duì)不同階段細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定同位素定量標(biāo)記研究，收集研究材料進(jìn)行亞細(xì)胞器分級(jí)，初步分析標(biāo)記效率和蛋白質(zhì)表達(dá)情況，利用質(zhì)譜鑒定部分蛋白質(zhì)。 13. 通過免疫共沉淀并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)新的 互作用蛋白質(zhì)、制備抗體 ，揭示 14. 通過免疫組化分析的方法在體內(nèi)驗(yàn)證 路調(diào)控新靶蛋白的表達(dá)并確定其參與的生物學(xué)過程。 15. 合成雙鏈 建果蠅 16. 利用果蠅 過 預(yù)期目標(biāo) 課題一： 1. 確定和 到 1或 2個(gè)和 到和人細(xì)胞 2. 完成突變株的形態(tài)分析。 完成突變株的突變基因的確定。 完成序列對(duì)比分析及蛋白功能域的確定。 3. 確定 除它們的基因。完成突變株的形態(tài)分析。 4. 驗(yàn)證出 3 5. 6. 確定 7. 確定在 陷型細(xì)胞中過度表達(dá) 否能校正染色體錯(cuò)排和分離錯(cuò)誤，以及恢復(fù)動(dòng)粒功能和檢驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)答。 8. 分離純化若干個(gè)與 互作用的有絲分裂相關(guān)蛋白，并查詢其基本生物功能。 9. 確 定 10. 獲得若干個(gè) 其中一些蛋白將申請(qǐng)專利。 11. 將穩(wěn)定同位素標(biāo)記進(jìn)入細(xì)胞各亞細(xì)胞器，獲得蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)表達(dá)數(shù)據(jù)。 12. 獲得 13. 確定 3 14. 完成另外約 5， 000個(gè)果蠅基因雙鏈 15. 完成 析選擇 3 16. 培養(yǎng)研究生 8名， 培養(yǎng)博士后 4名 。 發(fā)表 0的論文 4篇， 的論文 16篇。申請(qǐng)專利 4項(xiàng)。 第三年： 研究?jī)?nèi)容 課題一： 1. 開始 證和人細(xì)胞 2. 研究這些蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的動(dòng)態(tài)變化。研究它們是否是 制必需的蛋白。研究它們是作用于 3. 著手開展研究 互作用蛋白在維持 制叉穩(wěn)定性中的作用。 4. 研究 3因芯片篩選的個(gè)蛋白在翻譯水平上受 控的方式及其機(jī)理（直接調(diào)控還是間接調(diào)控）。 5. 評(píng)價(jià)該 3 對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。 6. 細(xì)胞水平驗(yàn)證 疫共沉淀實(shí)驗(yàn)、 7. 從 + 轉(zhuǎn)錄為 用生物素標(biāo)記探針對(duì)芯片進(jìn)行雜交。比較整體基因表達(dá)譜與 8. 采用細(xì)菌表達(dá)的蛋白（ 行體外 立 該細(xì)胞系中，或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 及 9. 構(gòu)建含有 酸酶活性失活的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒，檢測(cè) 產(chǎn)生是否依賴于 時(shí)檢測(cè)存在或缺失 用免疫沉淀（ 測(cè) 10. 采用免疫共沉淀等方法對(duì)候選的相互作用蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，從中選取 1感興趣蛋白或是功能未知蛋白，通過基因轉(zhuǎn)染等方法對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)功能分析。 11. 利用多種質(zhì)譜系統(tǒng)如 S 和 定不同衰老階段的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)表達(dá)和修飾，鑒定修飾位點(diǎn)和修飾類型，進(jìn)行氧化修飾和組蛋白質(zhì)及和蛋白質(zhì)修飾分析。 12. 通過蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)，結(jié)合使用抑制劑和細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像技術(shù)，揭示 13. 路候選調(diào)控蛋白體內(nèi)外功能分析。構(gòu)建候選蛋白轉(zhuǎn)基因和敲基因動(dòng)物模型，觀察其表型特點(diǎn)；利用免疫共沉淀等方法確定候選蛋白與 路已知蛋白之間的相互作用。 14. 通過細(xì)胞共轉(zhuǎn)染、蛋白分離純化和質(zhì)譜分析鑒定 建關(guān)鍵位點(diǎn) 突變的轉(zhuǎn)基因和敲入（ 蠅模型，分析磷酸化位點(diǎn)的功能。 15. 分析 號(hào)通路主要蛋白與線粒體功能的相互關(guān)系，如 路蛋白與線粒體蛋白的共定位情況、 路對(duì)線粒體功能的影響、線粒體對(duì) 16. 整理分析數(shù)據(jù)，撰寫論文。 預(yù)期目標(biāo) 1. 確定 互作用蛋白是否在 制起始中起必需作用。 驗(yàn)證和確定人細(xì)胞 人細(xì)胞 2. 確定這些和 3. 確定 4. 初步闡明 5 5. 初步闡明 3對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。 6. 驗(yàn)證出 3 7. 完成基因芯片篩選分析，鑒定出若干由 8. 驗(yàn)證第二年通過分離純化鑒定的若干 關(guān)蛋白與 相互作用是否為直接的。 9. 完成 定 10. 初步探究 或發(fā)展的分子機(jī)理。 11. 獲得細(xì)胞核蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)修飾、修飾類型、修飾位點(diǎn)信息，為進(jìn)一步功能分析打下基礎(chǔ)。 12. 闡明 13. 得到 3選調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)基因與敲基因果