雙特異性抗體通過FcαR介導(dǎo)的中性粒細胞生物學(xué)效應(yīng)

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文雙特異性抗體通過fcr介導(dǎo)的中性粒細胞生物學(xué)效應(yīng)姓名：邢宇坤申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：張偉20040601中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)傾仁學(xué)位論文摘要雙特異性抗體（）是一種能夠同時識別兩種抗原表位的抗體分子，通過與細胞膜表面分子結(jié)合，它可以將靶細胞和免疫效應(yīng)細胞橋連起來，促進效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷作用。本課題以細胞來源的永生化細胞為靶細胞，以人外周血中性粒細胞（）為效應(yīng)細胞，應(yīng)用人工構(gòu)建的各種雙特異性分子在細胞水平上初步探討了由介導(dǎo)的雙特異性抗體的生物學(xué)效應(yīng)。首先，我們從家兔免疫血清中純化出針對病毒轉(zhuǎn)化的細胞膜表面（）的多克隆抗體，并以胄蛋白酶去除段生成（）片段，

2、再用化學(xué)交聯(lián)劑將其與識別中性粒細胞膜表面的單克隆抗體（）片段連接起來制成雙特異性抗體。分析表明純化后的能夠同時識別這兩種細胞。隨后，利用分析了在中性粒細胞的分布情況，發(fā)現(xiàn)該受體除了在的細胞膜有表達外，在細胞內(nèi)部亦有儲存。同時，我們還證明免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng)依賴于鈣離子，但是不完全依賴鎂離子。另外，單核吞噬細胞對于該反應(yīng)有增強作用。這些結(jié)論為后續(xù)的雙特異性分子的細胞功能研究奠定了理論與實驗基礎(chǔ)。為了探索介導(dǎo)的的生物學(xué)效應(yīng)，我們首先構(gòu)建了一個能夠模擬的細胞反應(yīng)模型。它是先在細胞表面標記生物素，同時將（）片段也標記生物素，這樣加入鏈親和素后就可形成既能結(jié)合靶細胞，又能結(jié)合效應(yīng)細胞的橋梁。結(jié)果表

3、明，在的指引下，對細胞產(chǎn)生了較強的脫顆粒反應(yīng)。將兩種細胞分別用和標記后進行的分析證實了對細胞的作用，而激光共聚焦熒光分析則使我們直接觀察到這現(xiàn)象。該模型的成功為基于的雙特異性抗體研究提供了有力的實驗依據(jù)。最后，我們將化學(xué)合成的雙特異性抗體用于對病毒轉(zhuǎn)化的細胞的反應(yīng)當中，在的橋聯(lián)下，病毒轉(zhuǎn)化的細胞誘發(fā)了的脫顆粒反應(yīng)，但是我們用的方法并沒有檢測到的作用，這與細胞表達量低致使架橋能力較弱有關(guān)。綜上所述，借助，中性粒細胞能夠有效清除細胞來源的永生化細胞，但中國坼和醫(yī)科人學(xué)砸學(xué)位論文是該反應(yīng)的強弱還依賴于所識別的靶細胞膜表面分子的表達水平。將成為抗體免疫治療中的新的靶點分子，具有應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：雙特異

4、性抗體中性粒細胞脫顆粒中圍協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩卜學(xué)位論義（），），（）（。）（），”，（），【，（），中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)傾十學(xué)位論文：，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)壩學(xué)位論文四皿埯丑衛(wèi)瑤匝英文縮略語（、目（、，堍一聯(lián)氯般（乙基苯并噻唑啉磺酸）抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用抗體依賴的細胞介導(dǎo)的吞噬作用疊氮化鈉牛血清白蛋自雙特異性抗體分化簇二：甲基皿砜二硫蘇糖醇試劑乙二胺凹乙酸乙一醇雙醚，叫乙酸酶鏈免疫吸附試驗二十四烷四烯酸抗原結(jié)合區(qū)熒光激活細胞分選免疫球噩的恒定區(qū)受體受體胎牛血清異硫氰酸熒光素平衡鹽溶液辣根過氧化物酶免疫復(fù)合物免疫球蛋：。免疫受體酪氨酸活化基序三烯羥基琥珀酰啞胺光密度聚丙烯酰胺凝膠電泳外周血怛個核細

5、胞磷酸緩沖鹽溶液十四酸佛波酯乙酸鹽巾性粒細胞十一烷基磺酸鈉，四甲基乙胺三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷?。患谆惲蚯杷釟q丹明中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)顧十學(xué)位論文前言雙特異性抗體（）是同時具有兩種特異性的人工抗體。它一方面可以與機體自身異常的靶細胞膜表面抗原結(jié)合，另一方面通過識別免疫效應(yīng)細胞表面受體協(xié)助免疫效應(yīng)細胞選擇性的清除這些異常細胞并使機體正常組織免受損傷。正因為有此特性，雙特異性抗體在免疫治療方面受到了人們的關(guān)注【】。目前己經(jīng)得到應(yīng)用的免疫效應(yīng)細胞主要有髓系的單核吞噬細胞、中性粒細胞以及淋巴系的細胞和細胞【，】。細胞和細胞是最早用于雙特異性抗體治療的兩種效應(yīng)細胞。識別的細胞靶點分子主要是復(fù)合物或

6、分子，通過與靶細胞接觸，（細胞毒性細胞）可以引發(fā)顆粒外排、細胞因子釋放、誘導(dǎo)的細胞凋亡等多種細胞效應(yīng)。由于細胞的活化需要協(xié)同刺激分子和粘附分子（如、等）的輔助，因此等人曾將針對的和針對的聯(lián)合起來使用，并在體內(nèi)試驗中取得了良好的效果【。細胞表面最具細胞毒效應(yīng)的分子是（）和，已有文獻報道，經(jīng)由分子，能夠指引細胞有效清除淋巴瘤、乳腺癌以及卵巢癌細胞，而且該過程無需細胞因子（如）的輔助，】。此外，細胞和細胞表面的分子也被證實對于表達的腫瘤細胞具有細胞毒作用【】。近年來，髓系的吞噬細胞因其活化快、動員迅速的特點正逐漸受到人們的關(guān)注。其中，中性粒細胞（）主要存在于正常人外周血中，數(shù)目眾多，是人體非特異性免

7、疫防御系統(tǒng)的重要保護屏障】，許多雙特異性抗體研究均將其作為效應(yīng)細胞，也因此在特異性免疫防御中顯示了卓越的效力【】。所識別的靶點主要是中性粒細胞膜表面的受體，經(jīng)由受體，能夠發(fā)揮多種細胞效應(yīng)，包括：（抗體依賴的細胞介導(dǎo)的吞噬作用）、（抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用）、呼吸爆發(fā)、脫顆粒等。根據(jù)這些效應(yīng)是否需要我們可將其分成兩個途徑：氧依賴途徑和非氧依賴途徑。氧依賴途徑是指氧化酶和髓過氧化物酶催化生成活性氧和，這些分子具有很高的反應(yīng)性，可以與病原體的細胞膜、核酸分子及蛋白質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)使其損傷或死亡，由于該過程耗氧量激增，因此也稱該反應(yīng)為呼吸爆發(fā)。非氧依賴途徑是指顆粒組分中的各種蛋白酶利抗菌蛋中國

8、協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩學(xué)位論殳白釋放到吞噬小體或細胞外的過程，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，。根據(jù)所識別抗體種類的不同，中性粒細胞膜表面的受體有兩類，分別是結(jié)合免疫球蛋白的體（）和結(jié)合的（），】。又可分成三個亞型：（），（）和（），其中，已經(jīng)在雙特異性抗體的臨床試驗中顯示出良好的效果，但是它主要存在于單核、巨噬細胞表面，只有在（粒細胞集落刺激因子）、吖（干擾素）等細胞因子的刺激下能夠在中性粒細胞表面誘導(dǎo)表達，。有和），兩種，前者是活化性受體，后者是抑制性受體，表達于表面的是活化性受體。目前，以為靶點的是尢法區(qū)分這兩種亞型的，在治療中如果它們與免疫效應(yīng)細胞（如單核吞噬細胞）的結(jié)合反而會下調(diào)這些細胞免疫反應(yīng)，這與設(shè)

9、計的初衷是相悖的。此外，該受體還存在于細胞和血小板表面，它們是不具有細胞毒效應(yīng)的，以上諸多因素使的應(yīng)用逐漸受到了限制。與細胞的不同，以的形式錨定在膜表面，不能介導(dǎo)對靶細胞的殺傷作片。同時，以，為靶點的還有可能與血清中的可溶性形成免疫復(fù)合物引起炎癥反應(yīng)等副作用，】。隨著（）結(jié)構(gòu)與功能研究的不斷深入，該受體開始進入人們的視線，成為雙特異性抗體研究中的靶點分子。定位于號染色體，是分子量為的多鏈跨膜糖蛋白，與和有中等親和力（約為。），組成性的表達于中性粒細胞、單核巨噬細胞及嗜酸性粒細胞表面，其鏈能夠與受體的鏈結(jié)合，引起鏈的（免疫受體酪氨酸活化基序）磷酸化，將活化信號由胞外傳遞到胞內(nèi)。與不同，既沒有起抑

10、制作用的亞型，又不表達在細胞、血小板這類對于自身異常細胞沒有直接殺傷效力的細胞表面，因此，該受體在雙特異性抗體的免疫治療中具有一定的優(yōu)勢。許多報道已證明，能夠介導(dǎo)非常強的抗腫瘤效應(yīng)，等人還將針對與的與聯(lián)合起來應(yīng)用于小鼠模型并取得了非常理想的效果?！臼荏w在腫瘤治療上的良好前景使我們想到可以將其抖于清除在自身免疫病中分泌自身抗體的病理性細胞，以阻斷由自身抗體引發(fā)的各種病理后果。本研究是在上述設(shè)想的基礎(chǔ)上展開的，為此，我們選擇了人外周血來源的細胞作為靶細中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩上學(xué)位論文胞，并將作為的識別靶點，在體外細胞水平考察了介導(dǎo)的對細胞產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。中網(wǎng)協(xié)年兀醫(yī)科大學(xué)碩學(xué)位論文第一部分：雙特異性

11、抗體的制備與純化雙特異性抗體的制備方法有很多，概括起來可分為三類：雙雜交瘤法、鼠源性單克隆抗體的化學(xué)交聯(lián)法以及基因工程，】。其中，化學(xué)交聯(lián)法是將交聯(lián)劑與兩種抗體片段的活性基團分別發(fā)生共價反應(yīng)從而達到連接的目的。這種方法制備周期短，操作過程簡單，非常適合早期體外細胞水平的研究，缺點是抗體的需求量大，產(chǎn)率低，成本高。隨著抗體工程和重組技術(shù)的逐漸成熟，基因工程開始取代雙雜交瘤法成為制備雙特異性抗體的主流技術(shù)。與前兩者相比，基因工程具有較低的免疫原性和較好的組織穿透能力，特別是近年來出現(xiàn)的技術(shù)，它能夠引導(dǎo)異源聚體的正確配對，有效提高了的產(chǎn)量與質(zhì)量。雖然基因工程優(yōu)點很多，但是它需要大量的前期投入以及冗長

12、的開發(fā)周期，而本課題旨在探討將用于雙特異性抗體免疫治療的可行性，尚處于體外細胞水平階段，因此制各方法仍然采用化學(xué)交聯(lián)法。一材料（一）細胞系病毒轉(zhuǎn)化的人外周血細胞：由本室趙青老師提供，以含的培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)。細胞（本室保存）：人單核巨噬細胞的前體細胞系，以含的培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)。小鼠雜交瘤細胞（本室保存）：分泌抗的單克隆抗體，以含的培養(yǎng)基培養(yǎng)。（二）實驗動物近交系小鼠，一周，雌性；新西蘭大白兔，蛞重，購自中國藥品和生物制品檢定所嚙齒類實驗動物中心。以動物均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心。中國和醫(yī)科人學(xué)碩士學(xué)位論文（三）主要試劑及抗體細胞培養(yǎng)用和為公司產(chǎn)品；交聯(lián)劑為產(chǎn)品：親和柱、

13、級凝膠過濾介質(zhì)為公司產(chǎn)品；親和柱、超濾離心管為公司產(chǎn)品；胃蛋白酶、弗氏完全佐劑和不完全佐劑、降植烷、標記山羊抗兔多克隆抗體、半胱氨酸、碘乙酰胺、內(nèi)烯酰胺、，甲叉雙丙烯酰胺為公司產(chǎn)品；人、標記山羊抗小鼠多克隆抗體（）片段由本室提供。（四）儀器設(shè)備臺式高速離心機（上海醫(yī)用分析儀器廠）培養(yǎng)箱（美國公司）型紫外可見分光光度計（上海分析儀器廠）流式細胞儀（，美國公司）恒壓恒流電泳儀（北京東方儀器廠）蛋白電泳儀及電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）多通道電子蠕動泵（浙江象山電子儀器廠）恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械七廠）超純水裝置（美國公司）酶標儀（美國公司）激光共聚焦熒光顯微鏡（，美國公司）倒置熒光顯微鏡（，日本公司）（

14、五）溶液胃制制備抗原、抗體親和柱主要試劑的配制稀鹽酸：于去離子水中加幾滴濃鹽酸至值。交聯(lián)緩沖液：，以調(diào)節(jié)值到后定容至。封閉液：，值。中罔協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩十學(xué)位論文堿清洗液：封閉液中含有。酸清洗液：冰醋酸，以調(diào)節(jié)值到后定容至。交聯(lián)雙特異性抗體主要試劑的配制（）：，調(diào)節(jié)值后加水至。還原緩沖液：中含有。親和層析主要試劑的配制結(jié)合緩沖液：，以調(diào)節(jié)值到后定容至。洗脫緩沖液：檸檬酸，以調(diào)節(jié)值至。洗脫緩沖液：檸檬酸，以調(diào)節(jié)值至?；罨挠H和層析主要試劑的配制平衡緩沖液：中含有。洗脫緩沖液：中含有。洗脫緩沖液：甘氨酸，滴加少許濃鹽酸至值。免疫熒光染色用試劑的配制洗液：中含有以及。沈液：中含有。細胞固定液：將多聚甲

15、醛置于。左右的去離子水中，加入滴促進溶解，之后再與混合均勻，。保存。主要試劑的配制內(nèi)烯酰胺儲存液：每升中含有丙烯酰胺，甲叉雙內(nèi)烯酰胺，待其溶解后過濾除去顆粒物質(zhì)?？捡R斯亮藍染色液：將考馬斯亮藍溶于甲醇：水（：）和冰醋酸中，過濾除去不溶物。中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文脫色液：甲醇，冰醋酸，加水至。蛋白電泳緩沖液：，甘氨酸，定容至。血清除脂緩沖液的配制，冰醋酸，以調(diào)節(jié)值至，定容至。溶液的配制儲存液：的乙醇，的磷酸，考馬斯亮藍，避光保存。工作液：去離子水，的乙醇，的磷酸，儲存液，號濾紙過濾，保存于棕色瓶中可使用數(shù)周，但在使用前需要再過濾。、溶液的配制反應(yīng)緩沖液：磷酸緩沖液中含有（）。溶液：試劑溶于反

16、應(yīng)緩沖液中，可保存數(shù)月。二方法（一）多克隆抗體片段的制各與純化抗體（）片段的制備將抗體溶液對檸檬酸緩沖液（）透析，離心去除雜質(zhì)，于上清中按照蛋白：酶：的比例加入新鮮配制的胃蛋白酶溶液（咖），?？视?，最后加入（）調(diào)節(jié)蛋白溶液值到終止反應(yīng)，以濾膜過濾除雜，保存?？贵w（）片段的純化）以結(jié)合緩沖液平衡親和柱約個柱體積，流速為。）以的流速使抗體的胄蛋白酶消化液通過親和柱，接收穿出液，管，測量值，將值大于的組分合并，對透析四次，次，濃縮后測量值，。保存，留取少量樣品進行鑒定。）使用洗脫緩沖液將結(jié)合到親和柱上的段碎片以及完整的抗體分子沈脫下中同協(xié)和醫(yī)科人學(xué)碩：學(xué)位論文來，流速為。）使用的鹽酸清洗柱子約個柱體

17、積，流速為。）以平衡緩沖液平衡柱子約個柱體積，流速為。免疫家兔初次免疫前，從兔耳緣靜脈取正常血留作陰性對照。首次免疫使用抗原與弗氏完全佐劑混合后背部皮下多點注射，共一點。分別在、天使用同樣的抗原與弗氏不完全佐劑混合后皮下免疫家兔。三次免疫后第天從耳緣靜脈取血以免疫雙擴法測定抗體效價。抗體效價如未達到要求則繼續(xù)加強免疫，直至達到所需滴度。最后從頸動脈放血，從采集的血液中分離血清，分裝后。保存待用。瓊脂糖凝膠雙向擴散法測定免疫動物血清中多克隆抗體的滴度配一的瓊脂糖凝膠，煮沸后鋪在載玻片上，待其白凝后用打孔器打孔，使孔間徑為，孑徑為。分別加入相應(yīng)抗原和抗體，于濕盒中放置過夜觀察有無沉淀線?？乖?、抗體

18、親和柱的制備）將抗原或抗體對交聯(lián)緩沖液透析以。）稱取干粉溶于的稀鹽酸中，溶脹。在砂芯漏斗中繼續(xù)用的稀鹽酸清洗溶脹好的層析介質(zhì)。）待層析介質(zhì)中的稀鹽酸抽干后將其迅速轉(zhuǎn)入蛋白溶液中，比例為，室溫下混合旋轉(zhuǎn)，之后置于混合旋轉(zhuǎn)過夜。離心，吸盡上清，冉以封閉液清洗層析介質(zhì)兩次，測量上清中的吸收值以確定溶液中殘留蛋白質(zhì)濃度并計算交聯(lián)效率。）加入封閉液，室溫下混合旋轉(zhuǎn)。在砂芯漏斗中以酸、堿清沈液交替清洗層析介質(zhì)四次，次。）以平衡緩沖液清洗層析介質(zhì)，脫氣后裝柱。從抗血清中純化多克隆抗體將兔抗血清對除脂緩沖液透析。中國協(xié)和醫(yī)科犬學(xué)順卜學(xué)位論文）離心，去除沉淀后將血清繼續(xù)對透析兩次，次。）抗血清用濾膜過濾除雜，再

19、以的流速通過抗原親和柱。）以洗脫緩沖液清洗柱子直至穿出液的值降到以下。）以的流速用沈脫緩沖液洗脫目的蛋白，分管收集洗脫液，管，為了防止蛋白變性，于每管中預(yù)先加入（）。將值大于的組分合并，對透析四次，次，濃縮后測量值，保存，留取少量樣品進行鑒定。）以平衡緩沖液平衡親和柱，流速為。（二）單克隆抗體的镥備與純化腹水的制備取一周齡的健康雌性小鼠，腹腔注射降植烷，只。周后，雜交瘤細胞離心后，以清洗細胞三次，調(diào)節(jié)細胞密度至左右，每只小鼠注射。天后，待小鼠腹部增大處死小鼠，收集腹水。離心取上清，加入至終濃度，分裝后。保存。腹水的純化）將腹水與等體積的結(jié)合緩沖液混合，放置過夜。）離心去除沉淀，上清用濾膜過濾除

20、雜。）以結(jié)合緩沖液平衡親和柱約個柱體積，流速為。以的流速上樣，之后繼續(xù)用結(jié)合緩沖液平衡柱子直至穿出液的值降到以下。以的流速用洗脫緩沖液沈脫目的抗體，收集方法同上。用的鹽酸清洗柱子約個柱體積，流速為。）劇平衡緩沖液平衡柱子約個柱體積，流速為。（三）雙特異性抗體的制備與純化（）片段生成條件的確定、將抗體溶液對透析四次，次。取適量半胱氨酸溶于還原緩沖液制成的儲液。中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位淪文）按一定的濃度將半胱氨酸儲液加入抗體溶液中，。溫育。）反應(yīng)結(jié)束后，于每管中加入新鮮配制的的碘乙酰胺溶液至終濃度，避光放置。）每份留取少量樣品進行鑒定以確定最佳還原條件。雙特異性抗體的交聯(lián)與純化）將兩種抗體溶液對透

21、析四次，。于一種抗體溶液中加入的半胱氨酸儲液至終濃度為，。溫育。）反應(yīng)結(jié)束后將還原的抗體溶液（約）通過的柱子，分步接收流出液，管，取加入到溶液中以確定蛋白分布，取，溶液加入到后繼管中檢測還原劑的清除效果，收集無半胱氨酸的抗體片段用于隨后的雙特異性抗體的交聯(lián)。取的溶于。）將溶解完全的加入到另一種抗體溶液中，室溫下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后以同樣方法過一柱子去除未反應(yīng)的交聯(lián)劑。）將兩種抗體片段按摩爾比：迅速混合起來，用超濾離，管濃縮至，放置過夜。）將交聯(lián)的抗體混合物依次通過人抗原親和柱以及山羊抗小鼠抗體親和柱，經(jīng)過兩次洗脫，最后產(chǎn)物即為雙特異性抗體，對透析后，以濾膜過濾除菌，保存。（四）法檢測抗體與細胞膜表

22、面受體的結(jié)合情況收集待測細胞，以沈液清洗細胞三次，調(diào)節(jié)細胞密度至，。在調(diào)零管中加入細胞懸液，其余各管加入，于每管中分別加入一抗，冰上孵育。離心，以沈液清洗細胞三次，加入熒光標記的抗，冰上避光孵育。離心，以洗液清洗細胞兩次，洗液清沈細胞飲，重懸細胞于沈液中，加入洗液，細胞固定液，室溫放置。在流式細胞儀上進行常規(guī)分析。中國辦年醫(yī)科大學(xué)壩學(xué)位論點（薊蛋白質(zhì)的梯度凝膠電泳梯度凝膠電泳采硝連續(xù)電泳系統(tǒng)（，），分離膠魏積層膠蛉配割按照和（）的修改方法。實驗中通常餿爆、一、一、一五種方案，配制方法如下：表的配制（單位：）實驗步驟：）疆兩袋予凈靜羧璃平綴裙墊板綴裝奄泳裝置中翡玻璃平板美滋，薺以鐵央固定。）按二

23、表黼匍薪需的分離膠，然蕊加入的，撬合均勻：予高濃度的分離膠中加入的蔗糖，待其充分溶鰓后將其注入到靠近梯度混和器出口的容器內(nèi)，低濃度的注入到另一邊，在攪拌的情況下加入，打開梯度混和器的連通裝置，迅速姆混合好的膠溶滾注入到玻璃扳內(nèi)，上覆正丁黲，矚甍窆氣，室溫放置。）溪去覆藏揚，綴隸紙啜：殘餐液體，捶入援予，小心注入蠛翡軟層膠，避免氣泡產(chǎn)生，室溫聚合。）蔣釋鑫與上釋緩沖滾弱合，沸水耱熱，上樣，整流宅溶至溴酚蘭抵達分離膠底部。、卸去玻璃板，將凝膠先浸泡予潮定液中振蕩，簿轉(zhuǎn)入考瑪斯亮蘭染液中染色，脫色液脫色過設(shè)至出現(xiàn)清晰條帶。中國脅捌醫(yī)科大學(xué)顴士學(xué)位論：三結(jié)果本章制備的雙特異性抗體由兩部分組成：一部分為

24、識別病毒轉(zhuǎn)化的人細胞的多交癱拭俸片段，另一部分為識裂程熬（）片段。我們蹩透過分離、酶切和純化獲得這兩種抗體片段，再利用化學(xué)交聯(lián)劑將二者連接起來形成雙特異瞧撬體。（一）兔挽人細胞多克隧抗體片段的制餐與鑒定抗原（）片段的制備久盤潼是繒庭戇分泌形式，我們秘備靜多克隆抗體與靜維合位點應(yīng)該位于它的部分，因此，須將人血清片胃蛋白酶切成（），冉用親和柱嗷收去除段。酶切前菇躺入血清綴娥泳鑒定，結(jié)果顯示：酶切作用完全，（）片段的純度達到以上，約有的片段被蛋白柱吸收掉（圖）。（）垂，天（）：薏袋麴薹寵（一蝴）入簿弼越螽鵑，“物（饕避藤黢）；人：酶切后的（）與段碎片；經(jīng)蛋牲吸收后的（）片段。人酶切前后的，“物（還原

25、艘）：經(jīng)舞一棒吸收焉的（片段：酶切后的（與段碎片：人。中同協(xié)和醫(yī)科人學(xué)碩士學(xué)位論文多抗血清的制備與檢測將人（）片段免疫只家兔，每次蛋白用量為只，共免疫四次?？寡宓牡味炔捎妹庖唠p擴的方法檢測，中心抗原的濃度為，血清按倍比關(guān)系稀釋。結(jié)果見表。表免疫雙擴法測定抗體滴度注：分別為用于免疫的家兔編號；表示有沉淀線出現(xiàn)，一表示無沉淀線出現(xiàn)兔抗人多克隆抗體及其（）片段的純化與鑒定將人偶連到層析介質(zhì)上，制成人親和柱，兔多抗血清經(jīng)該親和柱純化后，電泳效果理想，純度可達以上。為了避免段在后繼的細胞實驗中引起補體反應(yīng)和非特異性結(jié)合，純化的多克隆抗體以胃蛋白酶消化成（）片段（圖）。分析結(jié)果證明，兔抗人（）片段能夠與

26、病毒轉(zhuǎn)化的細胞膜表面結(jié)合（圖）。中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩十學(xué)位論殳（）（）圈兔抗人多克隆抗體及其）：片段的鑒定為電泳結(jié)糶：還原狀態(tài)下的兔抗人多克隆抗體：還原狀態(tài)下的兔抗人（）片段；非還原狀態(tài)下的兔抗人（）片段；非還原狀念下的兔抗人多克隆抗體。為流式細胞分析，；，的抗為免疫前兔血清中的；實驗組中的抗為純化的兔抗人（）片段。（二）單克隆抗體及其（片段的制備與鑒定取生長良好的雜交瘤細胞注射到雌性小鼠腹腔內(nèi)，天后小鼠腹部開始增大，收集腹水，天結(jié)束。腹水中除了目的抗體外，還混有少量小鼠自身抗體，屬于小鼠類，與親和柱親和力較低，沈脫條件為，而其余無關(guān)抗體（如、等）與親和柱親和力較高，在的條件下不能被洗脫下來，它

27、們的洗脫條件一般為。因此，選擇的洗脫液可以提高單克隆抗體的質(zhì)量。及其（）片段經(jīng)電泳雨分析結(jié)果表明，腹水經(jīng)純化后，的含量達以上，胃蛋白酶切后約有的段被蛋白柱吸收，（）片段的純度為（圖），能夠與中性粒細胞膜表面受體結(jié)合（圖）。中國協(xié)和醫(yī)科人學(xué)碩士學(xué)位論文（）（）勰贏簦？：圈及其（）片段的鑒定為電泳結(jié)果：經(jīng)蛋白柱吸收后的（。）片段（還原態(tài)）；酶切后的（與段碎片混合物（還原態(tài)）；酶切后的（）與段碎片混臺物（非還原態(tài)）；經(jīng)蛋柱吸收后的（片段（非還原態(tài)）。為的（）片段與中性粒細胞表面結(jié)合情況的流式細胞分析，對照組中的一抗為涮型陰性對照抗體（犁）；實驗組中的抗為純化的（彬）片段。（三）雙特異性抗體的制備、純

28、化及其性質(zhì)鑒定（）片段生成條件的確定（）是（）片段兩條重鏈之間的硫鍵被還原劑打開后形成的產(chǎn)物，除了這一對外，抗體分子在輕、重鏈內(nèi)以及輕、重鏈之間也存在二硫鍵，如果這些化學(xué)鍵也被同時打開會造成輕、重鏈的分離，進而破壞可變區(qū)的結(jié)構(gòu)使抗體無法識別抗原表位（圖）。因此，在本實驗中我們選用性質(zhì)比較溫和的半胱氨酸作為還原劑，以、四種使用濃度還原抗體片段，后立即加入碘乙酰胺終止反應(yīng)，所得產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，結(jié)果表明半胱氨酸在的濃度下能夠只作用于重鏈間的一二硫鍵得到左右的（片段，其含量可達以上（圖）。！里塑塑墮登莖蘭！墨竺蘭篁堡苧圈抗體分予在不同還原條件下形成的片段圈兔抗人（）片段以及姍（）片段還原反應(yīng)條件的鑒定

29、（一隊非還原膠）：兔抗人（）片段；泳道足該抗體片段在定濃度還原劑作用之后的反席，一物，按編號前后順序依次為，、和；泳道是（）片段在一定濃度還原劑作用之后的反應(yīng)產(chǎn)物，按編號前后順序依次為、和：（）片段。中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩卜學(xué)位論文化學(xué)交聯(lián)法制備純化雙特異性抗體是一種雙功能交聯(lián)劑，具有兩種活性基團，其中，羥基磺酸基琥珀酰亞胺（）能夠與蛋白質(zhì)的氨基（）反應(yīng)將上的馬來酰亞胺基團引入到該分子上，同時，引入的馬來酰亞胺基團又可以結(jié)合另一蛋白的游離巰基從而達到連接兩種蛋白的目的（圖）。利用這一性質(zhì)，我們先將兔抗人（）片段與作用引入馬來酰亞胺，接著再用半胱氨酸還原（）生成（），最后利用馬來酰亞胺與巰基的共價結(jié)

30、合反應(yīng)把兩種抗體片段連接起來。經(jīng)電泳鑒定，交聯(lián)后的產(chǎn)物為一組混合物，這主要是由于兔抗人（）片段上結(jié)合了不同數(shù)目的（）片段造成的。一般來講，除了抗體分子輕、重鏈氨基末端的外，許多氨基酸殘基（如精氨酸、賴氨酸等）的側(cè)鏈也含有基團，能夠被修飾，因此，還原后的（）一與兔抗人（）片段的結(jié)合位點是隨機選擇的，它既呵位于恒定區(qū)，又可位于可變區(qū)，既可以是一對一的結(jié)合，也可以是多對一的結(jié)合。不過，如果兔抗人（）片段（尤其是它的可變區(qū)）結(jié)合的（）片段過多，會使它們與的結(jié)合能力降低甚至喪失。我們制備的應(yīng)該是那些既達到交聯(lián)目的又保留了抗原結(jié)合能力的交聯(lián)產(chǎn)物（圖）。此外，交聯(lián)產(chǎn)物中還含有一定量的母本抗體，包括（）片段、

31、兔抗人（）片段以及（）片段（圖），為了去除這些分子，先用人抗原親和柱吸收交聯(lián)產(chǎn)物獲得針對的抗體，接著再將山羊抗小鼠多克隆抗體偶連到層析介質(zhì)上制成能夠結(jié)合這類鼠源性抗體的親和柱，吸收從人抗原親和柱洗脫下來的產(chǎn)物，經(jīng)過二次沈脫，所得產(chǎn)物即為雙特異性抗體（圖）。旦塑竺墮型查蘭堡主蘭竺堡苧圈交聯(lián)蛋白的示意圖圈兩種抗體片段變聯(lián)后可能形成的幾種產(chǎn)物中田協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩：學(xué)位論文（）（）圖雙特異性抗體純化產(chǎn)物的鑒定）為雙特異性抗體的交聯(lián)產(chǎn)：物：（）片段與兔抗人（）片段等摩爾比的混合物（還原憊）：兩種抗體交聯(lián)后形成的交聯(lián)產(chǎn)物（還原態(tài)）；兩種抗體交聯(lián)后形成的變聯(lián)產(chǎn)物（非還原態(tài)）；（）片段（非還原憊）：兔抗人（）片

32、段（非還原態(tài)）。為雙特異性抗體的純化產(chǎn)物：（）片段與兔抗人（）片段等摩爾比的混臺物（還原態(tài)）；從山羊抗小鼠親和柱洗脫下來的雙特異性抗體（還原態(tài)）：從山羊抗小鼠親和桿洗脫下米的雙特異性抗體（非還原態(tài)）；兩種抗體交聯(lián)后形成的混合物經(jīng)人親和柱吸收后留下的上清，主要包括（）片段、（）片段以及少最已經(jīng)喪失與結(jié)合能力的雙特異性抗體（非還原態(tài)）；（）片段（非還原態(tài)）；兔抗人（）片段（非還原態(tài)）。雙特異性抗體的流式細胞分析我們選用病毒轉(zhuǎn)化的人外周血細胞和細胞作為檢測雙特異性抗體與、結(jié)合能力的細胞模型。為了提高在細胞表面的表達量，檢測前以的刺激細胞。結(jié)果顯示，與（）片段相比，純化的雙特異性抗體仍然保持對于的結(jié)合

33、（圖），如果將標記的抗由羊抗鼠換成羊抗兔并以兔抗人（）片段作為陰性對照的抗，染中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)預(yù)士學(xué)位論文色結(jié)果為強陽性（圖），從而證明純化的雙特異性抗體能夠很好的與結(jié)合。在病毒轉(zhuǎn)化的細胞檢測中，雙特異性抗體也保持了對叫的結(jié)合（圖），如果將標記的抗由羊抗兔換成羊抗鼠并以（）片段作為陰性對照的一抗，染色結(jié)果仍為陽性（圖），說明雙特異性抗體也能和細胞結(jié)合。（）（）圈雙特異性抗體與細臆衰面，以及病毒轉(zhuǎn)化的人井周細臆的鰭合情況、為細胞：其中的陰性對照抗體為同型的（型），二二抗為標記的山羊抗小鼠；的陰性對照抗體為兔抗人（）片段，抗為標記的山羊抗兔。、為病毒轉(zhuǎn)化的人外周血細胞：其中的陰性對照抗體為免疫前兔

34、血清的，？抗為標記的山羊抗兔：的叭性塒照抗體為（）片段，抗為標記的山羊抗小鼠。中阿協(xié)和醫(yī)科大學(xué)顧十學(xué)位論文四討論自等人于年將用于制備雙特異性抗體獲得成功以來，已有多種交聯(lián)荊被日入該領(lǐng)域。其中，使用最為廣泛、方法最為成熟的當算是，它是一種草功能交聯(lián)劑，含有兩個馬來酰亞胺基團，能夠同時和兩個抗體（片段重鏈鉸鏈區(qū)上的游離巰基反應(yīng)（圖），經(jīng)此法連接而成的除了在鉸鏈區(qū)多出個雙馬來?；鶊F外與天然抗體十分相似，抗體親和力的保留效果也比較理想。本課題最初使用的也是這種交聯(lián)劑，交聯(lián)后有生成，但是效率非常低，只占到混合物的，如果考慮到抗體在胃蛋白酶消化過程中的產(chǎn)率以及后續(xù)純化過程中親和層析或凝膠過濾的損失，最后的

35、收率應(yīng)該在以下，也就是說，若要得到的，所需的母本抗體至少要或者更高，可見，這種方案并不經(jīng)濟。隨后我們又嘗試了，它是通過分子內(nèi)部一對硫鍵與抗體鉸鏈區(qū)游離巰基的兩次交換來達到交聯(lián)的目的（圖）。由于這種交換是隨機進行的，交聯(lián)產(chǎn)物中具有多種同源、異源分子且分子量相近，這樣會增加后面純化工作的難度，此外，它的交聯(lián)效率也沒有達到要求。鑒于上述兩種交聯(lián)劑并沒有取得預(yù)期效果，我們開始將注意力轉(zhuǎn)移到、這類雙功能交聯(lián)劑上，雖然它們將兩個以上的（）片段連接到兔抗人（）片段的氨基末端會降低與細胞的親和力，但是它們的交聯(lián)效率一般都會高于，從胃蛋白酶消化開始，的收率可以達到以上，這樣不但大幅度的降低了制備成本與工作量，也

36、使小量制備用于體外細胞水平的研究成為可能。經(jīng)過逐一嘗試與比較，在權(quán)衡了交聯(lián)效率、抗體活性、下游純化方案三種因素之后，我們最后選擇制備并且獲得了比較理想的效果，產(chǎn)率約為。圈交聯(lián)蛋自的廳德圈中圉協(xié)和醫(yī)科欠學(xué)頤學(xué)位論文圖交秩蛋白的亍壤圈除了尋找合適的交聯(lián)劑外，在制備過程中還有兩點比較重要。首先是還原法生成（）時還原劑的篩選。理論上，抗體（）片段重鏈鉸鏈區(qū)的二硫鍵因為暴露在外易于接近還原劑，所以只要微環(huán)境適合，還原劑是可以只作用于這對二硫鍵的，但是任何化學(xué)反應(yīng)都不會以全或無的方式進行，副反應(yīng)是不可避免的，為了保護鏈內(nèi)以及輕、重鏈之間的二硫鍵不受到破壞，它要求整個還原過程必須非常溫和。這期間我們曾經(jīng)嘗試

37、過、巰基乙醇以及它的鹽酸鹽，并對各種還原劑的使用濃度、反應(yīng)溫度和作用時間做了不同程度的調(diào)整，盡管有文獻報道應(yīng)用上述還原劑獲得成功，但在我們的實驗中并沒有得到滿意的效果，（）片段的產(chǎn)量均低于。最后我們在的文獻中看到半胱氨酸也可以還原抗體片段，在確定了合適的反應(yīng)時間與濃度之后，實驗結(jié)果顯示，約有以上的抗體分子被半胱氨酸還原成（）片段。這一步的成功既為下一步的交聯(lián)提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)，又降低了后續(xù)工作的純化難度。其次是制各（）片段時胃蛋白酶切條件的確定】。它會因抗體的種屬來源或亞型的不同而各異，一般情況下，多克隆抗體的酶切時間較短，在四小時之內(nèi)就可消化完全；單抗（如小鼠）所需的時間相對較長，通常在八

38、小時以上；某些類型的抗體（如小鼠和）會被胄蛋白酶切成碎片無法形成（）片段，因此，對于實驗中的每一種抗體片段，在大量制各之前都應(yīng)取小樣進行胃蛋白酶消化以尋找最佳酶切時間。綜上，在本節(jié)中我們應(yīng)用化學(xué)交聯(lián)法制備純化了，經(jīng)過鑒定，所得產(chǎn)物確實能夠與中性粒細胞以及病毒轉(zhuǎn)化的細胞結(jié)合，毫無疑問，這為后面引發(fā)的的生物學(xué)效應(yīng)研究提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。中同協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩一學(xué)位論文第二部分：的細胞定位及其脫顆粒反應(yīng)機制的研究本課題是以細胞來源的細胞系為靶細胞，以人外周血中性粒細胞為效應(yīng)細胞，借助雙特異性抗體將者橋連起來進而考察對靶細胞產(chǎn)生的細胞效應(yīng)。我們在制備雙特異性抗體時選擇的靶點分子為中性粒細胞的，在探討其生

39、物學(xué)效應(yīng)之前，我們首先對效應(yīng)細胞的的表達情況和其介導(dǎo)的脫顆粒能力進行了觀察。本章的研究方法和結(jié)果將為接下來的功能檢測提供理論依據(jù)并奠定實驗基礎(chǔ)。一材料（一）主要試劑及抗體干粉（無鈣鎂）、小牛血清白蛋白（無內(nèi)毒素）、細胞松弛素、乳鐵蛋白、多聚賴氨酸為公司產(chǎn)品；分離液、為公司產(chǎn)品；、為公司產(chǎn)品；兔抗人乳鐵蛋白多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的兔抗人乳鐵蛋白多克隆抗體由本室自制；一為公司產(chǎn)品；為公司產(chǎn)品；由英國劍橋大學(xué)分子免疫病理研究所提供，抗的抗體是種嵌合抗體，其可變區(qū)是鼠源性的，而恒定區(qū)已經(jīng)替換成人，與人類的結(jié)合，是該抗體與按適當比例混合后形成的免疫復(fù)合物。（二）溶液的配制無無無酚紅的將干粉溶于去

40、離子、去熱原的水中，冉加入，待其充分溶解后以或訓(xùn)節(jié)值到左右，定容至，岬濾膜過濾除菌，保存。中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩學(xué)位論文（、）、（）和（）（、）：在上述的中加入和。（）：在上述的中加入。（）：在上述的中加入。將的和的加入的去離子水中，待其充分溶解后高壓滅菌，。保存。溶液的配制：體積的原液與體積的混合。：體積與體積的混合。：體積與體積的混合。的非常難溶，在劇烈攪拌的同時加入助溶，其間片計監(jiān)測值，在恰好溶解的，測其值在即可。白細胞計數(shù)液的配制染液：染料，甘油，甲醇，待其全部溶解后以號濾紙過濾，室溫保存。白細胞計數(shù)液：去離子水，冰醋酸，染液，室溫放置過夜后以濾膜過濾去除雜質(zhì)，室溫保存。紅細胞裂解液的配制

41、，加去離子、去熱原的水定容至，用濾膜過濾除菌，保存。法檢測細胞胞漿內(nèi)蛋白所崩試劑的配制固定液：于中加入的多聚甲醛，在加熱攪拌的同時滴入幾滴助溶，配好后崩濾膜過濾去除雜質(zhì)，保存。中胃協(xié)和醫(yī)科犬學(xué)碩學(xué)位論文細胞膜打孔液：，甲醇，去離子水，混勻后保存。其余溶液同第一部分所述。激光共聚焦免疫熒光檢測所用試劑的配制固定液：中含有的多聚甲醛。細胞膜打孔液：中含有（）的。封閉液：中含有以及（）。洗液：中含有（）。所用試劑的配制包被液：，（）。封閉液：中含有，（，），清洗液：中含有（）。顯色液：溶于的檸檬酸緩沖液（），臨用前加入過氧化氫至終濃度為。封片劑：對苯二胺溶于冰冷的中，加入甘油，以的碳酸緩沖液（）調(diào)節(jié)

42、至，一保存。標記抗體所用試劑的配制標記緩沖液（）：，加入蒸餾水定容至。二方法（一）標記抗體將待標記的抗體對標記緩沖液透析兩次，次。取適最溶于中，濃度為。每次標記使用的均應(yīng)新鮮配制，避光保存。按：的比例將加入到抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻。室溫下避光反應(yīng)，之后轉(zhuǎn)到繼續(xù)作用。加入終濃度的溶液終止反應(yīng)。將標記好的抗體對透析若干次，直至液體清亮為止。中國協(xié)和醫(yī)科人學(xué)碩上學(xué)位論文標記產(chǎn)物的鑒定蛋白濃度：（）（）一（）】比例：（）【（）一（）】該值應(yīng)介于之間。標記產(chǎn)物的保存標記好的抗體溶液中含有以及。（二）酶聯(lián)免疫吸附實驗（）將過量的純化抗原抗體包被在孔酶標板上，進行抗體抗原捕獲實驗，利用

43、酶標記的第一抗體（如：羊抗鼠）與相應(yīng)底物反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，通過測定對應(yīng)的吸光度可以半定量地指示抗體，抗原的產(chǎn)生水平。）將純化抗原或抗體用包被液稀釋至斗，按每孔包被酶標板（過量包被，每空加入抗原，高于酶標板每孔的最大吸附量抗原，形成飽和吸附），封口膜封口，置于濕盒中包被過夜。）次日，倒掉包被液，用清洗液清洗酶標板四次，快洗一次，慢洗三次，次。）每孔加入“封閉液，封閉反應(yīng)孔中的非特異吸附位點，置于濕盒中室溫孵育。）若待測抗體抗原濃度高，則用封閉液按照倍比稀釋后，每孔加入，濕盒中室溫孵育。）倒掉包被液，用清洗液清洗酶標板四次，快洗一次，慢洗三次，次。）每孔加入辣根過氧化酶標記的二抗（預(yù)先用清洗液稀釋

44、至合適比例），濕盒中室溫孵育。）倒掉包被液，片清沈液清沈酶標板四次，快洗一次，慢洗三次，次。）每：底物液，避光處靜置分鐘，用酶標儀在處測定光吸收值。（三）外周血中性粒細胞的分離整個細胞分離過程嚴格遵守無菌操作規(guī)程。新鮮外周血來自健康獻血者，抽取靜脈血，加入適量肝素（單位）抗凝。中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)傾學(xué)位論文）將抗凝血與等體積液混合，如表所示，依次加入的至終濃度，的使其最終占總體積的，上下顛倒混勻，室溫靜置沉降紅細胞。表沉降紅細胞時的溶液配制全血體積吸取匕清，離心，棄掉上清，打散離心管底的細胞團，重懸于液中。）在另一離心管中加入，然后在的底部緩慢加入，使兩種密度的分層。將細胞懸液加于上，動作要盡量輕

45、緩，不能攪動上層的液面。離心。離心后可見兩條細胞帶，其中位置較低的細胞帶即是中性粒細胞。用吸管小心吸取中性粒細胞，加液混合清洗兩次，最后懸于含十、的中。取斗細胞懸液與自細胞計數(shù)液混合，鏡檢計數(shù)。（四）外周血白細胞的分離整個細胞分離過程嚴格遵守無菌操作規(guī)程。新鮮外周血來自健康獻血者，抽取靜脈血，加入適量肝索（單位）抗凝。于抗凝血中加入倍體積的紅細胞裂解液，上下顛倒混勻。待懸液開始清亮后以離心。棄去上清，迅速加入的低內(nèi)毒素，打散細胞團，再以清洗細胞三次，去除殘留的少量紅細胞及血紅蛋白。最后將細胞重懸于含：、的中，取細胞懸液與白細胞計數(shù)液混合，鏡檢計數(shù)。（五）法檢測細胞膜表面受體的表達同第一部分所述

46、。（六）法檢測細胞內(nèi)受體的表達收集待測細胞，以冰冷的沈液清洗細胞三次，重懸細胞于沈液中，其中中國協(xié)和醫(yī)科人學(xué)碩士學(xué)位論文調(diào)零管為個細胞，其余各管為。于各管中加入固定液，室溫下放置。反應(yīng)結(jié)束后以洗液清洗細胞兩次。加入冰冷的細胞膜打孔液，冰上孵育。以洗液清洗細胞三次。對于直接免疫熒光染色，加入標記的抗，冰上避光孵育，最后以洗液清洗三次待測：對于間接免疫熒光染色，加入的一抗，冰上孵育，洗液清洗三次后加入標記的二抗，冰上避光孵育，最后以洗液清洗細胞三次待測。（七）激光共聚焦免疫熒光檢測在中性粒細胞的分布）將高壓滅菌的載玻片放于孔板中，在其上加入濃度為咖的多聚賴氨酸，室溫放置。）吸去玻片上多余的多聚賴氨

47、酸，室溫干燥。）調(diào)節(jié)細胞濃度至，將細胞懸液均勻涂于處理好的玻片上，孵育，光鏡下檢查細胞在介質(zhì)上的粘附情況。）吸盡細胞懸液，以清洗玻片兩次，加入固定液，室溫下固定。）以清洗玻片三次，加入到細胞膜打孔液，室溫下作用。）吸盡打孔液，加入封閉液，室溫下封閉。）吸盡封閉液，以適當?shù)南♂尡壤尤霕擞浀目贵w，室溫下孵育。）以洗液清洗玻片三次，次，封片劑封片后避光保存。（八）中性粒細胞脫顆粒反應(yīng)的測定）當用于激活中性粒細胞時，（咖）與先以最適比例在（）、（、）、（”）或（）中混合，孵育。）于的中性粒細胞懸液中加入細胞松弛素至終濃度，按“孔鋪于孔培養(yǎng)板中，。孵育。）將加入的中性粒細胞懸液中，。孵育。）反應(yīng)結(jié)束后

48、將的清液轉(zhuǎn)移到孔酶標板中，離心，重復(fù)三次，去盡殘留的細胞。）上清液中乳鐵蛋白的含量用雙抗體法檢測。酶標板先用兔抗人乳鐵蛋白多克隆抗體包被，辣根過氧化物酶（）標記的抗乳鐵蛋白抗體作為第抗中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩學(xué)位論文體。由已知濃度的乳鐵蛋白繪制標準曲線。實驗數(shù)據(jù)各點均為三個平行孔的平均值，每個實驗重復(fù)三次，結(jié)果為實驗結(jié)果中有代表性的一次。中國協(xié)和醫(yī)科人學(xué)螄學(xué)位論文三結(jié)果（一）在中性粒細胞的分布在細胞膜上以及細胞內(nèi)部分布情況的分析以抗的抗體對健康人外周血分離的進行間接免疫熒光染色，結(jié)果表明，在細胞膜上有表達（圖），這與前人的報道是一致的，】。為了觀察是否也儲存于細胞內(nèi)部，我們用甲醇處理細胞膜形成孔洞讓

49、進入細胞內(nèi)部染色，結(jié)果顯示，的平均熒光強度顯著增強（圖），說明也存在于內(nèi)部。為了進一步驗證結(jié)果的真實性，以標記，先用未標記的封閉細胞膜表面，再對進行直接免疫熒光染色，檢測與細胞孵育后平均熒光強度的變化。分析結(jié)果顯示，若先用未標記的封閉細胞膜上的之后，再用標記的對細胞膜染色，結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性，說明的封閉效果理想（圖）：將封閉后的用甲醇打孔并以標記的進行胞內(nèi)的直接免疫熒光染色，與陰性對照相比，平均熒光強度仍為強陽性（圖），從而證明確實分布于內(nèi)部。田在中性粒細胞膜以及細胞內(nèi)部情況的流式細臆分析用劃膜上的進行問接免疫熒光染色，性對照為問型的（犁），抗為標記的山羊抗小鼠多抗。用標記的對膜上和細胞內(nèi)部的進行商

50、接熒光染包。膜表面用術(shù)標記的封閉后用染色的熒光變化情況，陰性對照為問比例熒光強度的刮犁對照抗體（犁）。的膜表面被封閉后進行的胞內(nèi)染也陰性塒照為問比例熒光強度的州型塒照抗體（型）。中同協(xié)和醫(yī)科大學(xué)順卜學(xué)位論文激光共聚焦免疫熒光檢測在細胞內(nèi)部的分布在用流式細胞分析證明了存在于內(nèi)部后，我們又用激光共聚焦免疫熒光分析觀察了的分布。將健康人外周血分離的鋪于多聚賴氨酸處理的載玻片上進行直接免疫熒光染色，以標記的（）對打洞后的細胞染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。結(jié)果顯示，標記的可使細胞內(nèi)部染上很強的熒光（圖，），而陰性對照的抗體則熒光很弱（圖）；在每組中隨機選取個細胞測量平均熒光強度，一者相差倍（圖），

51、說明【除了在膜上有表達外，在細胞內(nèi)部亦有儲存。，、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩學(xué)位論文（二）中性粒細胞脫鄹盤反應(yīng)機制的研究鈣鎂離子對介導(dǎo)的中性粒細胞脫顆粒反應(yīng)的影響實驗中使用只有鈣沒有鎂，只有鎂沒有鈣利鈣鎂同時存在的液以觀察鈣鎂離子對介導(dǎo)的中性粒細胞的脫顆粒反應(yīng)的影響。此外，我們還在反應(yīng)體系中加入了，可以同時絡(luò)合鈣鎂兩種離子。實驗結(jié)果表明，介導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng)是依賴于鈣離子的，在沒有鈣離子存在的情況下（加入或只有鎂沒有鈣），釋放的乳鐵蛋白顯著降低，與未受任何刺激的釋放量相當。從對鎂離子的需求來看，盡管介導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng)受到鎂離子的影響，但是這一反應(yīng)并不完全依賴鎂離子，在只有鈣離子沒有鎂離子存在時，的乳鐵蛋白釋

52、放量有所降低，但并沒有降到本底水平（圖）。一：”圈鈣鎂離予對于介導(dǎo)的脫曩粒反應(yīng)的影響：組：液中含有和斗；組：液中含有：抖組：液中含有：組：液巾含有：組：無）的液。單核吞噬細胞對介導(dǎo)的中性粒細胞脫顆粒反應(yīng)的影響盡管體外實驗可以將分離純化的作為研究對象，但在體內(nèi)正常生理條件下，處于一種多細胞的復(fù)雜環(huán)境，其它細胞的反應(yīng)也可能對產(chǎn)生影響?？紤]到這一點，我們將外周血破除紅細胞得到白細胞，它是和單個核細胞（）組成的混合物，中主要有單核吞噬細胞和淋巴細胞。其中，單核吞噬細胞與中性粒細胞同屬于髓系的免疫細胞，膜上表達有，能夠吞噬；淋巴細胞不表達，無法吞噬，因此，在白細胞中對于介導(dǎo)的脫顆粒反如舳蚰中國協(xié)和醫(yī)科大

53、學(xué)碩學(xué)位論文應(yīng)有影響的主要是單核吞噬細胞。如圖所示，與分離的相比，在單核吞噬細胞的輔助下，乳鐵蛋白的釋放量升高了一倍，而未加任何刺激物的空白組只有少量上升。鑒于不同的分離方法會在本底上造成一定的差異，我們使用分離，并將上層的單個核細胞按比例回加到中，結(jié)果顯示，本身受誘導(dǎo)后無乳鐵蛋白可以測出，接近于本底：與混合后，的乳鐵蛋白釋放量升高（圖）。隨后，我們將與作片后的上清液取出，用截留分子量為的濃縮離心管去除殘留細胞以及高分子量的蛋白，并將離心下來的上清液加入到中觀察其效應(yīng)，結(jié)果，這種上清依然對的脫顆粒反應(yīng)有促進作削，說明在其中發(fā)揮效應(yīng)的是單核細胞與作用后釋放的活性物質(zhì)，此外，這種物質(zhì)對于未經(jīng)誘導(dǎo)的

54、不起作削（圖）。（）（）：、三：警一”中國協(xié)和醫(yī)科火學(xué)碩學(xué)位論文四討論中性粒細胞是免疫防御系統(tǒng)中的重要效應(yīng)細胞，許多與炎癥相關(guān)的蛋白酶、抗菌多肽均被包裹成顆粒小泡的形式堆積在胞漿中，當受到外界刺激活化后，這些顆粒組分能夠迅速動員起來，或與吞噬小體融合，或轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上將內(nèi)容物釋放到細胞外。與其它蛋白的合成途徑相似，顆粒小泡的發(fā)生始于早幼粒細胞的反面高爾基體，這些蛋白在細胞精細的調(diào)控下從其膜上出芽形成轉(zhuǎn)運囊泡，之后轉(zhuǎn)運囊泡進行同源融合，待增大到一定體積后便形成初級顆粒。初級顆粒一般呈球形或橄欖形，含有髓過氧化物酶、絲氨酸蛋白酶以及一些對微生物有破壞作用的蛋白，功能類似于溶酶體，也稱髓過氧化物酶顆粒

55、。當細胞分化到晚幼粒細胞期，含有乳鐵蛋白和膠原酶的次級顆粒以及后面出現(xiàn)的含有明膠酶的三級顆粒開始在胞漿中大量積累直至細胞成熟，它們的形狀并不規(guī)則，多呈棒狀，在啟動發(fā)揮炎癥效應(yīng)方面具有重要作用，。第四種顆粒是分泌小泡，出現(xiàn)于成熟的內(nèi)，屬于一類只有簡單膜狀結(jié)構(gòu)的小泡，組分與質(zhì)膜相近，上面有功能各異的受體及蛋白酶，如、等。當細胞內(nèi)：濃度升高達到定閩值后，受信號的刺激這些顆粒會動員起來。由于四種顆粒對的敏感程度不同，因此它們的動員速度也不盡相同，按先后順序依次為：分泌小泡、明膠酶顆粒、乳鐵蛋白顆粒以及髓過氧化物酶顆粒，這主要與其各自功能相關(guān)，。通常，捕捉到病原體后會向胞內(nèi)傳遞一個活化信號，受該信號的誘

56、導(dǎo)分泌小泡及其膜上的受體如等也一并轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，的粘附性開始增強，隨后明膠酶顆粒由胞內(nèi)釋放到胞外，協(xié)助降解基底膜的型膠原，接著乳鐵蛋白顆粒也開始動員起來，進一步升高質(zhì)膜上一的水平，一是的受體，這樣可以提高的吞噬功能，最后髓過氧化物酶顆粒與吞噬小體融合，釋放活性氧分子和各種蛋白酶殺傷病原體。由此可見，顆粒組分并不僅僅是一些包裹了蛋白酶以及炎癥介質(zhì)的大口袋，更是一個輸送各種受體和膜蛋白的發(fā)動機，它們與質(zhì)膜的融合賦予了新的功能，就如同給細胞增添了新的武器使它們能夠更好的應(yīng)對外界的“敵人”，這也是活化快，反應(yīng)靈活的重要原因，】。本實驗中，我們通過方法證明了在的質(zhì)膜和細胞內(nèi)部均有分中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)顫學(xué)位

57、論文布并用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察到了這一現(xiàn)象，前人的研究也證實用刺激會在短時間內(nèi)迅速上調(diào)的水平】，因此我們推測，與一相似，在靜息狀態(tài)時儲存于內(nèi)部顆粒小泡的膜上，當活化后，它可以伴隨顆粒小泡一同轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，提高在質(zhì)膜上的數(shù)量，進而增強經(jīng)由該受體介導(dǎo)的各種細胞反應(yīng)，如、氧化爆發(fā)、脫顆粒反應(yīng)、細胞因子的釋放和胞內(nèi)濃度的增加等。同時，這也為我們將作為雙特異性抗體研究的靶點分子提供了非常有利的理論依據(jù)，與接受細胞因子刺激后需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯的過程相比，在介導(dǎo)細胞反應(yīng)時將更為迅速而有效。鑒于的顆粒小泡分四種類型，因此我們下一步的工作是確定究竟分布于哪一類顆粒上，相信這一現(xiàn)象的揭示將有助于該受體功能的理

58、解與認識。有了上面的發(fā)現(xiàn)，接下來我們又對的脫顆粒反應(yīng)行為做了一定的研究。首先我們考察了鈣鎂離子的作用，發(fā)現(xiàn)脫顆粒反應(yīng)完全依賴于鈣離子，這與前人的結(jié)論是一致的】，究竟鈣離子在顆粒動員的過程中起到什么作用目前還不清楚，有報道稱，會在鈣離子的誘導(dǎo)下從的胞漿轉(zhuǎn)移到顆粒上，其中可能只結(jié)合乳鐵蛋白顆粒，而且，對于不同的顆粒，各種蛋白轉(zhuǎn)移時需要的鈣離子濃度也不相同，這樣或許可以解釋各種顆粒在動員速度上的差異】。與鈣離子不同，脫顆粒反應(yīng)不完全依賴于鎂離子，在沒有鎂離子只有鈣離子的情況下，反應(yīng)依然可以進行，只是程度較二者同時存在時要低，由此推斷，鎂離子在脫顆粒反應(yīng)中不是一個信號分子，可能只起到調(diào)節(jié)作崩。隨后，我

59、們觀察了單核吞噬細胞對于脫顆粒反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)單核吞噬細胞在吞噬后會釋放活性物質(zhì)，而這些活性物質(zhì)能夠增強的脫顆粒反應(yīng)，比較有趣的是如果將這些活性物質(zhì)加入到?jīng)]有接受刺激的中則不能誘導(dǎo)脫顆粒反應(yīng)?？梢姡@種物質(zhì)應(yīng)該有別于、或這類的強激活劑，后者本身就可直接激活產(chǎn)生非常強的脫顆粒反應(yīng)，鑒于這種活性物質(zhì)曲勺分子量不大，我們推測它們應(yīng)該與的類似物比較相近，已知只有在細胞因子或其它誘導(dǎo)物的協(xié)助才能引發(fā)的脫顆粒反應(yīng)，這些設(shè)想還有待于后續(xù)工作的進一步證明。總之，免疫系統(tǒng)應(yīng)該是個相互協(xié)作的整體，細胞與細胞之間有著千絲，縷的聯(lián)系，在單核吞噬細胞的輔助下，能夠更好的發(fā)揮細胞效應(yīng)，中國協(xié)和醫(yī)科人學(xué)碩士學(xué)位論文這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)給后面的雙特異性抗體細胞功能研究以極大的啟示，在介導(dǎo)的實驗中，為了充分調(diào)動的功能，我們使用的免疫效應(yīng)細胞均為外周血白細胞，同時，這種反應(yīng)系統(tǒng)也可以比較好的模擬體內(nèi)條件。中國孫和醫(yī)科人學(xué)碗士學(xué)位論文第三部分：雙特異性抗體模型的建立及其功能研究本節(jié)的主要目的是探討介導(dǎo)的的生物學(xué)效應(yīng)，由于病毒轉(zhuǎn)化的細胞以及制備、純化的存在許多不確定的因素，因此，在研究之前，我們首先利用生物素一鏈親和素系統(tǒng)構(gòu)建了能夠模擬雙特異性抗體的細胞反應(yīng)模型，以觀察由雙特異性分子引發(fā)的，介導(dǎo)的對靶細胞的效應(yīng)。最后，在該模型的基礎(chǔ)之上我們對化學(xué)交聯(lián)法制備的進行了相應(yīng)的功能檢測。一材料（一）細胞株細胞（本室保存）：淋巴