細(xì)菌表面展示技術(shù)講稿(詳細(xì)版)

1、.細(xì)菌表面展示（bacterial cellsurface display）技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用各位同學(xué)大家好，今天我們?yōu)榇蠹規(guī)淼氖牵杭?xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)定義是：指通過重組 DNA 技術(shù)，將外源功能蛋白表達(dá)并定位于特定細(xì)菌細(xì)胞的表面，以達(dá)到一定的研究與應(yīng)用目的是一項新的蛋白質(zhì)應(yīng)用技術(shù)。這句話該怎么理解：一般基因工程需要把蛋白提取出來，最好是菌體可以把蛋白分泌到菌體外，表面展示技術(shù)是把目的蛋白表達(dá)在細(xì)胞表面，外源蛋白的這種表面錨定有4個好處：1.可以使特定的反應(yīng)在細(xì)胞表面直接發(fā)生而提高反應(yīng)效率，2.能克服某些大分子底物不能穿越細(xì)胞膜而進入胞內(nèi)，3客服某些反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)不能進行特定的構(gòu)

2、型折疊等弊端，4.使產(chǎn)物的提取純化過程簡化。接下來，我組將從發(fā)展史，菌體構(gòu)建，技術(shù)應(yīng)用，未來展望4各方面為大家介紹。1. 發(fā)展史大多數(shù)生物技術(shù)都是經(jīng)歷了噬菌體細(xì)菌真核（酵母菌）的三個發(fā)展應(yīng)用階段，表面展示技術(shù)也不例外。包括：1985年Smith等人創(chuàng)建噬菌體表面展示技術(shù)，次年， Freudl 報道細(xì)菌表面展示技術(shù)，以及近年來興起的酵母菌表面展示技術(shù)與桿狀病毒表面展示系統(tǒng)。噬菌體表面展示技術(shù)：該展示系統(tǒng)是最早發(fā)展起來的,歷經(jīng)20多年發(fā)展,現(xiàn)在最常用的噬菌體表面展示系統(tǒng)主要有:絲狀噬菌體、K噬菌體、T4噬菌體和T7噬菌體展示系統(tǒng)。噬菌體表面展示技術(shù)具有表面展示技術(shù)的基本優(yōu)點,而且技術(shù)發(fā)展相對成熟,

3、但由于載體自身的限制,使得該展示系統(tǒng)存在著很大缺點。比如,外源蛋白的插入可能影響噬菌體的裝配,使其失去感染力;多肽或蛋白質(zhì)與噬菌體外殼蛋白融合表達(dá)時存在不可預(yù)測的偏差性等。酵母菌表面展示系統(tǒng)：酵母表面展示系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一種重要的真核蛋白表面展示系統(tǒng)。釀酒酵母是具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核微生物,是目前常見的酵母表面展示系統(tǒng)載體蛋白來源。根據(jù)交配型的差異分為MATa和MATA兩種單倍體,其細(xì)胞表面分別表達(dá)a或A凝集素,它們是酵母細(xì)胞壁上的兩種甘露糖蛋白,可介導(dǎo)細(xì)胞間的性黏附使細(xì)胞融合。目的蛋白可分別與a或A凝集素融合,展示于酵母細(xì)胞表面。與細(xì)菌相比,釀酒酵母在表面展示技術(shù)上的應(yīng)用具有許多優(yōu)勢:(

4、1)具有公認(rèn)的安全性;(2)其蛋白質(zhì)折疊和分泌方式與哺乳動物相似,展示哺乳類蛋白優(yōu)于細(xì)菌系統(tǒng);(3)具有眾所周知的發(fā)酵特性;(4)展示的蛋白質(zhì)可通過糖基磷脂酰基醇(GPI)錨定或二硫鍵綁定在細(xì)胞壁上。因此,酵母表面展示系統(tǒng)是一種更為安全、高效的表面展示系統(tǒng)。但該系統(tǒng)也存在一些缺陷,例如酵母生長適溫范圍窄,主要的蛋白質(zhì)后加工過程與哺乳動物細(xì)胞差異較大,重組酵母缺少選擇標(biāo)記等。2006年有人報道酵母的質(zhì)量控制系統(tǒng)并不能區(qū)分表達(dá)完整折疊的蛋白和折疊結(jié)構(gòu)缺陷型蛋白4,這也進一步表明了酵母表面展示系統(tǒng)在蛋白表達(dá)上還不完善,篩選出來的蛋白應(yīng)用前可能還需要進一步分析研究。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)：屬于高等真核生

5、物展示系統(tǒng)。該展示系統(tǒng)以桿狀病毒為載體,外源基因插入病毒的衣殼蛋白基因或囊膜蛋白基因后經(jīng)過加工處理,與衣殼蛋白或囊膜蛋白進行融合表達(dá)并在病毒粒子或感染細(xì)胞表面進行展示。作為一種真核生物展示系統(tǒng),桿狀病毒表面展示系統(tǒng)允許大片段外源基因的插入,能有效地在病毒粒子表面展示外源蛋白,而且可以對外源蛋白進行糖基化加工和折疊等翻譯后修飾,尤其適合需進行特異的翻譯后加工才能有效折疊和具有生物活性的高等真核生物細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白的展示。目前研究及應(yīng)用最為廣泛的桿狀病毒表面展示系統(tǒng)是苜蓿尺蠖核型多角體病毒和家蠶核型多角體病毒表面展示系統(tǒng)5。相對于前幾種展示系統(tǒng),該展示系統(tǒng)可能具有更大的發(fā)展和應(yīng)用空間。2.

6、細(xì)菌表面展示體系的構(gòu)成細(xì)胞表面展示體系通常由運載蛋白（carrier protein）、靶蛋白（又稱乘客蛋白，passenger protein）和受體菌三者組成，其中運載蛋白與靶蛋白以融合蛋白的方式交聯(lián)， 根據(jù)運載蛋白與靶蛋白融合位置的不同，一般分為 N 端融合、C 端融合和三夾板式融合等 3 種交聯(lián)方式。2.1運載蛋白運載蛋白的功能是將靶蛋白引導(dǎo)并錨定于細(xì)胞表面特定部位，因此一般應(yīng)具有以下特性：在結(jié)構(gòu)上具有錨定單元，使靶蛋白能固定在細(xì)胞表面；一般具有信號肽或轉(zhuǎn)運信號，藉此引導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白穿越細(xì)胞質(zhì)膜； 與外源蛋白融合后其本身的錨定特性不發(fā)生改變； 展示的靶蛋白不易被胞內(nèi)蛋白酶降解。 目前

7、已證實多種具有上述特性的細(xì)菌細(xì)胞蛋白，按其結(jié)構(gòu)部位與功能，可分為細(xì)胞膜孔道蛋白、冰晶核蛋白、細(xì)胞壁相關(guān)蛋白、S層蛋白、細(xì)胞表面附屬物蛋白和其他類型蛋白等。接下來重點介紹兩個應(yīng)用最廣的冰晶核蛋白和我們稍微熟悉的細(xì)胞表面附屬物蛋白，兩個運載蛋白。2.1.1冰晶核蛋白冰晶核蛋白（INP）是存在于丁香假單胞菌等細(xì)菌中的一種可誘發(fā)生物冰核形成的分泌蛋白， 也是目前應(yīng)用最為廣泛的運載蛋白已從丁香假單胞菌克隆到 inaK、inaV 和 inaZ 等基因均位于染色體上，其編碼產(chǎn)物的大小為 1 2001 500 個氨基酸。在結(jié)構(gòu)上，inaK 等基因均為單一開放閱讀框，其編碼蛋白由 3 個典型的結(jié)構(gòu)域組成：N 端

8、結(jié)構(gòu)域（約占序列的 15），其中含有34 個與膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的結(jié)構(gòu)單元，但是均未發(fā)現(xiàn)有分泌信號序列存在于這個區(qū)域中。 此結(jié)構(gòu)域含有較為豐富的 Asp 和親水性氨基酸 Ser 和 Thr。 Asp 殘基可與細(xì)胞壁上的糖基磷脂酰肌醇通過N聚糖連接方式進行連接， 而 Ser 和 Thr 殘基則可通過 O聚糖連接方式與外膜多糖中的甘露糖相結(jié)合，從而將該蛋白錨定固著在外膜表面。 C 端結(jié)構(gòu)域（占 4），其主要的生理功能是參與冰晶形成。中間的疏水結(jié)構(gòu)域（占 81），其序列中周期性地出現(xiàn) 8 個、16 個和 48 個氨基酸殘基的重復(fù)序列， 其功能主要是起“晶核”的作用而誘導(dǎo)冰晶的形成。 在 C 端結(jié)構(gòu)域和中間疏

9、水結(jié)構(gòu)域也均未發(fā)現(xiàn)分泌信號序列。INP 分子結(jié)構(gòu)的這一特征為靶蛋白的轉(zhuǎn)運提供了更多的可行選擇。 已報道采用 INP 的 N端加上少數(shù)中間重復(fù)單元、或僅采用其前 175 個氨基酸殘基的N 端，均能有效轉(zhuǎn)運和展示外源蛋白。2.1.2細(xì)菌表面附屬物細(xì)菌表面附屬物，如鞭毛和菌毛（性毛）等也可以作為運載蛋白。 鞭毛主要由若干拷貝 FliC 蛋白與其他成分構(gòu)成，其兩端高度保守， 而中間超變區(qū)則可以用外源蛋白代替用來構(gòu)建表面展示體系，同時鞭毛保持原有的功能不變。 但是由于中間超變區(qū)的大小有限，插入的外源基因的大小有一定的限制。菌毛是長細(xì)絲狀的細(xì)菌附著物， 由約 1 000 個主要的亞基菌毛蛋白和一些對附著和

10、組裝有重要作用的小蛋白組成， 形成一個螺旋筒狀結(jié)構(gòu)。 每個細(xì)胞含有約 500 個拷貝，菌毛蛋白含有超變區(qū)可用于插入靶蛋白。 型菌毛含有甘露糖殘基，介導(dǎo)結(jié)合到大腸桿菌上皮受體，由于其在細(xì)胞表面數(shù)量巨大，可產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，具有附著和易于純化的特性，在疫苗開發(fā)和文庫構(gòu)建上具有優(yōu)勢2.2靶蛋白靶蛋白是在細(xì)胞內(nèi)合成后經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運和在細(xì)胞表面固定并展現(xiàn)功能的特定蛋白， 其活性大小直接決定著展示系統(tǒng)性能的優(yōu)劣。 并非所有內(nèi)源或外源合成蛋白都適合于用作靶蛋白，一般要求靶蛋白分子內(nèi)不能形成二硫鍵或者在發(fā)揮活性時需要進行特殊的折疊、 靶蛋白一級結(jié)構(gòu)中帶電荷的氨基酸不能對融合蛋白在細(xì)胞表面的錨定產(chǎn)生干擾、靶蛋白功

11、能活性區(qū)域（如酶的活性中心）的位置通常不能太靠近融合位點等。23 宿主菌宿主菌的遺傳背景也是影響展示系統(tǒng)性能的關(guān)鍵因素。 宿主菌應(yīng)對異源蛋白具有很好的兼容性和較低的蛋白酶降解活性，同時應(yīng)具有容易培養(yǎng)或某種有利于展示性能發(fā)揮的特性，如惡臭假單胞菌的強抗逆性能。 革蘭陰性菌是研究較早和目前報道較多的宿主菌，近年也開發(fā)了多種革蘭陽性菌表面展示系統(tǒng)。3. 技術(shù)應(yīng)用：經(jīng)歷近30年的發(fā)展，細(xì)菌表面展示技術(shù)廣泛應(yīng)用于疫苗開發(fā)，蛋白質(zhì)文庫與肽文庫的篩選，全細(xì)胞催化劑，全細(xì)胞吸附劑及降解劑，和其他應(yīng)用等5個方面。其中蛋白質(zhì)文庫與肽文庫的篩選是：從龐大的隨機文庫中篩選出目標(biāo)蛋白或肽片段， 對于得到高活性的突變酶或

12、提高抗原決定簇的免疫能力具有重要意義。將靶蛋白展示到細(xì)菌表面， 不但可以利用熒光活性分選技術(shù)進行篩選，而且直接得到純化的單克隆。Daugherty 等通過在大腸桿菌表面展示 scFv 和進行點突變建立突變體庫， 再使用流式細(xì)胞儀分選系統(tǒng)進行篩選， 建立了一種高效篩選突變文庫的方法Kim 等采用 DNA shuffling 技術(shù)對枯草芽孢桿菌 BSE616 的纖維素酶基因進行改造，建立了大于 1106的文庫，通過菌落形態(tài)進行篩選，得到的最優(yōu)菌株的纖維素酶活性比對照高 5 倍采用免疫學(xué)技術(shù)對大的文庫進行篩選具有較高的效率和靈敏性。Bessette 等將 15 個氨基酸的肽插入大腸桿菌外膜蛋白 Om

13、pA上，構(gòu)建了含有 51010克隆的大文庫，通過篩選得到 7 個氨基酸的保守序列，對人血清白蛋白、抗 T7 抗原決定簇、人 C 反應(yīng)蛋白、HIV1 gp120 和堿性磷酸酶等都有很高的親和性。近年來， 有關(guān)細(xì)菌表面展示技術(shù)新的應(yīng)用途徑仍然不斷出現(xiàn)。 如表面展示技術(shù)和固定化技術(shù)相結(jié)合而開發(fā)的生物過濾器，不僅可以從混合的物質(zhì)中分離出特異的蛋白和抗原決定簇，而且也可以用于生物吸附污水中的重金屬， 在水處理和環(huán)境監(jiān)測上具有應(yīng)用前景。 用表面展示 OPH 的大腸桿菌修飾的 pH 電極， 開發(fā)了一種直接測量有機磷神經(jīng)毒劑的電位式微生物生物傳感器。 此外，對將新型納米技術(shù)整合到細(xì)菌表面展示的技術(shù)也進行了研究，可望促進生物醫(yī)學(xué)工程的發(fā)展。4未來展望：近 20 年來， 細(xì)胞表面展示技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)大為拓展，但這一技術(shù)也存在一些尚未解決的問題，如：目前能夠在細(xì)菌表面展示的均為一些分子相對較小的蛋白質(zhì)， 對于超過 500 個氨基酸的蛋白質(zhì)展示效率很低， 這往往是由于與運載蛋白組建的融合蛋白的跨膜分泌活性較低所致； 目前所展示的主要是一些水解酶類或在結(jié)構(gòu)上無須進行折疊的簡單蛋白質(zhì)， 對于在分子內(nèi)部有二硫鍵結(jié)構(gòu)或需要進行折疊的蛋白質(zhì)往往不能實現(xiàn)功能性的展示； 目前所報道的細(xì)菌表面展示系統(tǒng)主要是利用大腸桿菌這樣