防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)

1、第一部分 防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)調(diào)研結(jié)果1 實(shí)驗(yàn)樣品樣本要求新鮮，沒有被微生物污染，一般每個(gè)樣本為300g。2 微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)2.1實(shí)驗(yàn)菌株不同國(guó)家、組織、企業(yè)對(duì)挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)選擇的測(cè)試菌種有一定差異（如表1），國(guó)內(nèi)參照美國(guó)化妝品、香精和洗滌劑協(xié)會(huì)（CTFA）推薦的菌種（因其較具代表性，如表2所示），所以更為恰當(dāng)。（注意菌株來源問題：同屬一個(gè)種的細(xì)菌來源不同，菌株不同，MIC值不同）表1 某些國(guó)家、組織、企業(yè)用于化妝品微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)的測(cè)試菌株菌株美國(guó)(藥典)美國(guó)(ISP公司)英國(guó)(藥典)德國(guó)(Henkel公司)德國(guó)(S&M公司)白假絲酵母黑曲霉紅色青霉綠色木霉繩狀青霉大腸埃希氏菌鎘綠假單胞菌金黃色葡萄球菌糞

2、腸球菌產(chǎn)氣腸桿菌表皮葡萄球菌日勾維腸桿菌洋蔥假單胞菌肺炎克雷伯氏菌惡臭假單胞菌熒光假單胞菌表2 CTFA化妝品微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)的菌株選擇種類菌株數(shù)量革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌至少選一種表皮葡萄球菌發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌肺炎克雷伯氏菌至少選兩種陰溝腸桿菌大腸埃希氏菌變形菌屬日勾維腸桿菌非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌銅綠假單胞菌至少選一種洋蔥假單胞菌熒光假單胞菌惡臭假單胞菌黃桿菌屬不動(dòng)桿菌屬酵母白假絲酵母至少選一種近平滑假絲酵母霉菌黑曲霉至少選一種黃綠青霉產(chǎn)芽孢菌枯草芽孢桿菌供選用生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)分離菌適當(dāng)菌株一種以上2.2 培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基2.3 試驗(yàn)用菌液的配置（1）標(biāo)準(zhǔn)懸液的配制1%硫酸9.9m

3、l與1%氯化鋇0.1ml，混合后配制成的懸液濃度為3108cfu/ml，此懸液再做3倍稀釋。（2）細(xì)菌菌懸液的配制實(shí)驗(yàn)前將菌株接種到各個(gè)培養(yǎng)基斜面上，36攝氏度恒溫培養(yǎng)48小時(shí)。將已培養(yǎng)好的活性菌種，用滅菌生理鹽水清洗到滅菌錐形瓶中，充分振蕩搖勻。用移液槍從錐形瓶中吸取菌液作稀釋，濁度和標(biāo)準(zhǔn)懸液的濁度（3108cfu/ml）相同為止；此時(shí)的稀釋菌液再做3倍稀釋，即為所需的1108cfu/ml的菌懸液，做細(xì)菌總數(shù)確定細(xì)菌數(shù)。（3）霉菌菌懸液的配制將已培養(yǎng)好的活性菌種，用滅菌的生理鹽水清洗到滅菌錐形瓶中，充分振蕩搖勻；用移液槍從錐形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀釋，每次的稀釋用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，必須5

4、個(gè)中格的霉菌總數(shù)在190210，落在此范圍內(nèi)的菌懸液為我們所需的1108cfu/ml的霉菌菌懸液，做霉菌總數(shù)確定霉菌數(shù)。2.4 接種2.4.1接種方式（1）單菌接種：每種測(cè)試菌株單獨(dú)做一個(gè)挑戰(zhàn)試驗(yàn)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是容易了解每種微生物對(duì)防腐體系的敏感性，在篩選產(chǎn)品的防腐體系時(shí)有較好的參考價(jià)值，但工作量大、費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，和產(chǎn)品的實(shí)際污染菌情況也有差距（因來自自然界的微生物常常不是單一的種類）。（2）混合菌接種：西歐、德國(guó)等的許多國(guó)家和企業(yè)多采用這種方式，除了因工作量相對(duì)較小外，這種接種方法更能代表污染的狀況。2.4.2接種次數(shù)和時(shí)間（1）一次接種：只是在試驗(yàn)開始時(shí)接種一次，整個(gè)試驗(yàn)周期28天。（一次

5、加菌的28天微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)）（2）多次接種：在試驗(yàn)開始接種一次后（重復(fù)加菌的微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)）a法：第21天再接種一次，試驗(yàn)周期為28天。（有實(shí)驗(yàn)表明，第21天接菌和不接菌時(shí)，第28天時(shí)的微生物含量并無顯著的差別，評(píng)定結(jié)果也相同）b法：每隔兩周接種一下，連續(xù)三次（即第1、3、5周接菌，每?jī)芍芙泳胺蛛x一次），試驗(yàn)周期為49天；c法：每周接種一次，連續(xù)5次，試驗(yàn)周期為35天。（S&M公司的資料介紹，采用此種方法評(píng)價(jià)認(rèn)可的防腐體系，可保證產(chǎn)品30個(gè)月內(nèi)的防腐安全）2.4.3操作方法稱取待測(cè)樣品30g，對(duì)應(yīng)加入0.3ml濃度為11071108cfu/ml的細(xì)菌懸液及霉菌懸液，用干凈的無菌勺子攪拌均勻后

6、蓋上保鮮膜，細(xì)菌在32.52.5的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，霉菌在22.52.5的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。a.水溶性樣品10g加入90ml無菌生理鹽水，稀釋后取1ml樣品液，加入9ml滅菌生理鹽水中，做依次稀釋，分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀釋度；取三個(gè)合適稀釋度的樣液，分別吸取1ml樣液加入已滅菌的平皿中，做菌落計(jì)數(shù)，并做兩個(gè)平行。b.油溶性樣品取10g樣品，加入10ml無菌吐溫-80和10ml無菌白礦油，再加70ml無菌生理鹽水，用無菌玻棒充分混勻；吸取1ml已稀釋的樣品液，加入9ml滅菌生理鹽水中，做依次稀釋，分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-

7、5、10-6、10-7等稀釋度；取三個(gè)合適稀釋度的樣液，分別吸取1ml加入已滅菌的平皿中，做菌落計(jì)數(shù)，并做兩個(gè)平行。2.5培養(yǎng)細(xì)菌放在32.52.5的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；霉菌在22.52.5的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；混合菌在28的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.6菌落計(jì)數(shù)分別在0、7、14、21、28天分離計(jì)算樣品中活的細(xì)菌、霉菌；每次計(jì)算完細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)后將平皿放回培養(yǎng)箱，以待下次觀察用，觀察中切勿打開平皿，以免燃菌而使下次無法觀察。菌落計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法：先選取平均菌落數(shù)在30300之間的平皿作為細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定范圍，選取平均菌落數(shù)在550之間的平皿作為霉菌菌落總數(shù)測(cè)定范圍；有兩個(gè)稀釋度在30300之間，求比值。若比值

8、2，報(bào)告平均數(shù)；若比值2，以其中較小的稀釋度計(jì)算細(xì)菌總數(shù)；所有稀釋度都大于300，以稀釋度最高的平均菌落數(shù)計(jì)算；所有稀釋度都小于30，以稀釋度最低的平均菌落數(shù)計(jì)算；所有稀釋度均在30300之外，其中一個(gè)大于300，而相鄰的加一稀釋度小于30，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)計(jì)算；若平皿中有連成片狀或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，不宜計(jì)算；若片狀菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均勻，則可將此平皿菌落計(jì)數(shù)后2，以報(bào)告全皿菌落數(shù)。2.7評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)2.7.1 CTFA推薦的一次加菌防腐挑戰(zhàn)性試驗(yàn)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)CTFA的方法初始的霉菌和細(xì)菌的接種量分別為10000cfu/g（ml）和cfu/g（ml）（CFU為

9、菌落單位），要求在第7天時(shí)霉菌降低90%，細(xì)菌降低99.9%，并且在28天內(nèi)菌數(shù)持續(xù)下降。2.7.2 美國(guó)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)在CTFA評(píng)價(jià)方法的基礎(chǔ)上提出的標(biāo)準(zhǔn)，如表3所示。表3 美國(guó)所用一次加菌的微生物防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)一次加菌的28天微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)防腐效果優(yōu)良若單菌接種的三個(gè)平行試驗(yàn)中任何一種微生物數(shù)量的平均值，在第七天時(shí)下降到100 cfu/g（ml）以下，第28天全部為0。防腐效果勉強(qiáng)通過若單菌接種的三個(gè)平行試驗(yàn)中任何一種微生物數(shù)量的平均值，在第七天時(shí)下降到1000 cfu/g（ml）以下。防腐效果無效若單菌接種的任何一種微生物，任何一個(gè)平行樣達(dá)不到上述標(biāo)準(zhǔn)，也達(dá)不到CTFA的要求。2

10、.7.3國(guó)內(nèi)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)國(guó)內(nèi)參照CTFA加菌防腐挑戰(zhàn)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。表4 國(guó)內(nèi)所用微生物防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)一次加菌的28天微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)加菌的微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)防腐效果優(yōu)良（W）第28天化妝品中存貨的細(xì)菌數(shù)量10CFU/ml，說明該樣品防腐體系對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑殺效果。在三次加菌后，在每次加菌的第14天樣品中存貨的細(xì)菌數(shù)100CFU/ml防腐效果尚可（M）第28天化妝品中存貨的細(xì)菌數(shù)量100CFU/ml，說明該樣品防腐體系對(duì)細(xì)菌有一定的抑殺效果。在三次加菌后，在每次加菌的第14天樣品中存貨的細(xì)菌數(shù)100CFU/ml，說明該樣品防腐體系對(duì)細(xì)菌有較差的抑殺效果。在三次加菌后，在每次加菌的第14天樣

11、品中存貨的細(xì)菌數(shù)1000CFU/ml第二部分 實(shí)驗(yàn)室可采取的方案1 實(shí)驗(yàn)樣品2 微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)2.1實(shí)驗(yàn)菌株金黃葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母、枯草芽孢桿菌2.2 培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2.3 試驗(yàn)用菌液的配置實(shí)驗(yàn)前，將各菌株接種于合適的培養(yǎng)基中，于37（細(xì)菌）和28（霉菌）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)2天，霉菌培養(yǎng)5天后，挑選典型的菌落于滅菌的生理鹽水中，制成一定濃度的混合細(xì)菌（108CFU/ml）和霉菌懸液（106CFU/ml），置于4冰箱儲(chǔ)藏備用。2.4一次加菌的28天微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)量取樣品30ml分別加0.3ml混合菌懸液，使得細(xì)菌濃度為106107CF

12、U/ml，霉菌濃度為104105CFU/ml，充分混勻。將樣品在28攝氏度下保存，在接菌0、7、14、21、28d取樣品分析含菌量（培養(yǎng)計(jì)數(shù)法）。2.6評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)一次加菌的28天微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)防腐效果優(yōu)良（W）第28天化妝品中存貨的細(xì)菌數(shù)量10CFU/ml，說明該樣品防腐體系對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑殺效果。防腐效果尚可（M）第28天化妝品中存貨的細(xì)菌數(shù)量100CFU/ml，說明該樣品防腐體系對(duì)細(xì)菌有較差的抑殺效果。附：實(shí)驗(yàn)中所需的儀器和藥品設(shè)備名稱需求數(shù)量要求用途1冰箱1易清潔消毒存放菌種、標(biāo)準(zhǔn)懸液2電子秤1易清潔消毒樣品重量測(cè)試3濁度儀1易清潔消毒檢測(cè)細(xì)菌菌懸液之濃度4無菌操作臺(tái)1易清潔消毒微生物實(shí)驗(yàn)用，要求等級(jí)10000級(jí)5生化培養(yǎng)箱3易清潔消毒細(xì)菌、霉菌培養(yǎng)各1臺(tái)；保存瓊脂為液體狀態(tài)及緊急烘干器皿，需用1臺(tái)6顯微鏡1易清潔消毒霉菌總數(shù)觀測(cè)用7移液槍21001000 uL移取菌液用；備用8恒溫水浴鍋1易清潔消毒用于油性樣品之充分溶解，規(guī)格待定9自動(dòng)滅菌鍋1自動(dòng)物品滅菌用10牛角勺100稱取樣品用；備用11酒精燈2無菌操作臺(tái)配套用；備用12200ml燒杯10盛裝樣品用；備用13500ml燒杯10盛裝樣品用；備用14150ml三角燒瓶10盛裝樣品用；備用1510ml試