實驗九食品中蛋白質(zhì)含量的測定lyd

1、實驗十二 食品中蛋白質(zhì)含量的測定（一）微量凱氏定氮法 李亞東 一、 實驗原理蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機物，主要是由碳、氫、氧、氮、硫五種元素組成，由20種氨基酸通過酰胺鍵（肽鍵）以一定的方式結(jié)合而成。不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含量也不同，蛋白質(zhì)中的氮含量一般為15-17.6%，按16%計算，氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為6.25。如玉米、蕎麥、青豆、高粱、雞蛋、肉及肉制品為6.25；乳制品為6.38；面粉為5.70；花生為5.46；大米為5.95；大豆及其制品為5.71；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵為5.30。在食品和生物材料中，還包括有非蛋白質(zhì)氮的化合

2、物，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿、含氮類脂、啉和含氮色素等。因此，凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的同時，還包括非蛋白質(zhì)的含氮部分，故結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的有機氮與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后，堿化蒸餾使胺游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。稱為凱氏定氮法，由于1833年首先提出，經(jīng)長期改進已演變?yōu)槌Ａ糠?、微量法、自動定氮儀法及改良式微量凱氏法等多種。本法是測定食品中蛋白質(zhì)的標準方法。 消化NH2(CH2)COOH+H2SO4 NH2(CH2)OH+H2O+SO2NH2(CH2)OH+2H2

3、SO4 NH3+CO2+2SO4+3H2O2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸餾(NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+Na2SO4+2H2O2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O 滴定(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O 2NH4Cl+4H3BO3或(NH4)2B4O7+2H2SO4+5H2O (NH4)2SO4+4H3BO3二、實驗試劑所有試劑均用不含氮的蒸餾水配制。1 混合催化劑:硫酸銅10g，硫酸鉀100g，硒粉0.2g，在碾缽中碾細，過40目篩。2 標準硫酸氨溶液:準確稱取重結(jié)晶的硫酸銨1.414g，溶解并定容為1000mL。3 濃硫酸4硼酸溶液（2%）

4、:臨用前取100mL，滴加約1mL混合指示劑，搖勻后，溶液應(yīng)該呈酒紅色。5氫氧化鈉溶液（40%）6 混合指示劑:1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液混合均勻。7 0.01mol/L鹽酸標準溶液（需要標定）三、儀器1 （改良式）微量凱氏定氮儀2 凱氏燒瓶 250mL3 酸式微量滴定管 10mL四、 操作方法（一）消化精密稱取0.20.4g谷物樣品，置于消化管中內(nèi)，不能沾染瓶頸，加入0.5g混合催化劑及3mL硫酸，在放置于通風(fēng)櫥內(nèi)的消化爐中小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后（該過程大約需要23小時），再繼續(xù)加熱0.

5、5h。取下放置冷卻后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗凱氏燒瓶，洗掖并入容量瓶中，再加水至刻度，搖勻備用。同時做一空白實驗。（二）儀器的安裝和樣品的蒸餾、吸收與滴定1、微量凱氏定氮儀（1）蒸餾的準備工作凱氏定氮儀的安裝:按照圖181所示順序?qū)⑽⒘縿P氏定氮儀的各部件安裝好。要求裝得穩(wěn)妥端正。各部件之間以乳膠管相連，不得漏氣。吸收瓶的洗滌與檢查:用作吸收瓶的三角瓶，一定要洗滌干凈。先按一般方法洗凈，再按圖182的方法用蒸氣洗滌數(shù)分鐘，冷卻后加入2硼酸指示劑混合液5o或10Omi。若瓶中液體呈紫紅色(葡萄紫色)，用表面皿蓋好瓶口備用。若瓶中液體變綠色，則說明吸收瓶沒有洗凈，需用蒸氣重新洗滌后再用

6、。凱氏定氮儀的洗滌與檢查:在燒瓶(蒸氣發(fā)生器)內(nèi)裝半瓶蒸餾水，再加濃硫酸及混合指示劑各數(shù)滴將瓶中蒸餾水酸化。再加沸石少許。打開自由夾9關(guān)閉夾子11，12，冷凝管通進冷卻水，然后將燒瓶內(nèi)水煮沸，此時產(chǎn)生的蒸氣可充分地洗滌儀器。約十分鐘后，再換上吸收瓶。吸收瓶中加有l(wèi)OmL硼酸指示劑混合液，將冷凝管的出口浸沒在吸收瓶液面之下。繼續(xù)沖洗23分鐘，若吸收瓶內(nèi)溶液的顏色不變，則表明該儀器被沖洗干凈。然后先移去吸收瓶，關(guān)閉自由夾9，打開夾子12。此時，由于貯液瓶受到自然冷卻，其內(nèi)部形成負壓，反應(yīng)瓶內(nèi)的廢液，因受到從冷凝管出口傳來的大氣壓力，而自動地流人貯液瓶中。貯液瓶中的廢液，再經(jīng)打開活塞11即可排出。另

7、外在進行沖洗時，還須同時檢查儀器的各個連接部位，以免出現(xiàn)漏氣現(xiàn)象。蒸餾操作練習(xí):為了熟悉儀器的操作方法，用事先配制好的標準硫酸銨溶液代替樣品消化液，反復(fù)進行蒸餾、滴定和計算，直至完全熟練，再正式蒸餾試樣消化液。在夾子9關(guān)閉，12，11打開的情況下，用移液管準確量取5.0mL標準硫酸銨溶液，注入漏斗中。隨即打開夾子10，使硫酸銨溶液流入反應(yīng)瓶中。然后，每次用2mL水共3次沖洗漏斗，也全部放人反應(yīng)瓶中。在冷凝管出口處放上已盛有10.0mL 2硼酸指示劑混合液的三角瓶，并使冷凝管出口浸沒在吸收液中。用量筒取1012mL 40氫氧化鈉溶液，注入漏斗中。打開夾子10，當(dāng)堿液快流完時(留堿液約1mL)，立

8、即關(guān)閉夾子10。此時向漏斗中再注入約2mL水，起封閉作用，以防氨氣逸出。上述操作依次完成后，即可打開夾子9，關(guān)閉夾子11、12。這時蒸氣從燒瓶經(jīng)過貯液瓶進入反應(yīng)瓶中，瓶中所加的硫酸銨溶液受熱后迅速與堿液起反應(yīng),從而有氨氣放出。氨氣與水蒸氣一起通過定氮球進入冷凝管，最終以液滴形式進入吸收瓶，使吸收瓶硼酸液因吸收氨而變色。當(dāng)吸收液從酒紅色變?yōu)樗{綠色后，再繼續(xù)蒸餾23分鐘為蒸餾完全。這時將吸收瓶向下移，使液面離開冷凝管約1cm，然后用少量蒸餾水沖洗冷凝管出口，最后取下吸收瓶，用表面皿蓋好瓶口，準備滴定。每完成一次蒸餾后，對反應(yīng)瓶就要進行排廢液和洗滌。為了保證測定的準確性，每次蒸餾之后，起碼要沖洗3次

9、。滴定:用裝有0010molL的標準鹽酸溶液滴定上述吸收液，直至吸收液呈淡紫紅色(淡葡萄紫色)并在半分鐘內(nèi)不褪色為止，記錄消耗標準鹽酸的體積(m1)。消化液的蒸餾、吸收及滴定:用完成的消化稀釋液代替標準硫酸銨溶液依照上述的的操作方法，進行正式蒸餾、吸收和滴定操作。其方法與測定標準硫酸銨溶液時完全相同。2 熟悉改良式微量凱氏定氮儀。將自來水經(jīng)(11)注入到蒸餾瓶夾層(1)中，使水面稍低于蒸餾瓶頸部的轉(zhuǎn)彎處，把裝有2%硼酸溶液的接受瓶,置于冷凝器(8)的下方，冷凝器的出口尖端（9）插入酸液面以下，接收瓶內(nèi)須事先加入指示劑。將樣品由漏斗（7）注入到蒸餾瓶（2）中，并以少量水沖洗漏斗，并把氫氧化鈉溶液

10、由漏斗（7）注入到蒸餾瓶（2）中，并以少量的蒸餾水沖洗漏斗，然后用少量蒸餾水將漏斗封閉。最后加熱，將蒸餾夾層（1）內(nèi)的水煮沸，從蒸餾瓶（2）內(nèi)的水溶液沸騰開始計算時間，大約5分鐘即可蒸餾完畢，移開接收瓶后，再移去火源以防倒吸。接收瓶蒸餾瓶的洗滌:當(dāng)把火源移去后，蒸餾瓶內(nèi)的廢液立即流到蒸餾瓶的夾層（1）中，用手按?。?1）亦即可，并經(jīng)排水管（14）排出。再把裝有蒸餾水的三角瓶置于冷凝器尖端插入水的液面以下，再加熱至沸騰，然后移去火源，三角瓶中蒸餾水流到蒸餾瓶（3）內(nèi)，再倒流至蒸餾瓶的夾層（1）中，再由排水管（17）排出。按照上述方法將儀器洗滌2-3次。3 蒸餾向蒸餾瓶內(nèi)加入10mL2%硼酸溶液及

11、混合指示劑1滴，溶液呈酒紅色，使冷凝管（9）下端插入液面下。吸收5.0mL樣品消化稀釋液，由漏斗（7）入蒸餾瓶（2），并用少量水沖洗，再將10mL40%氫氧化鈉溶液由漏斗入蒸餾瓶，以少量水洗滌，夾緊螺旋夾，用少量水將漏斗封閉，此時蒸餾瓶中內(nèi)容物轉(zhuǎn)為深蘭色或產(chǎn)生褐色沉淀。開始蒸餾，蒸餾瓶夾層中水加熱傳導(dǎo)給蒸餾瓶（2）使氨揮發(fā)，沿著冷凝管（8）而入接收瓶，至硼酸接受液開始由酒紅色變?yōu)樗{綠色時起，繼續(xù)蒸餾約5min，將冷凝管尖端提出液面，再蒸餾1min，然后用水淋洗冷凝管尖端外部，取下接收瓶停止蒸餾。同時做試劑空白試驗。4 滴定用0.01mol/L鹽酸標準溶液滴定至溶液由藍綠色轉(zhuǎn)為微紅色為終點，記錄

12、滴定所用鹽酸標準體積。五 反應(yīng)式 消化NH2(CH2)COOH+H2SO4 NH2(CH2)OH+H2O+SO2NH2(CH2)OH+2H2SO4 NH3+CO2+2SO4+3H2O2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸餾(NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+Na2SO4+2H2O2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O 滴定(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O 2NH4Cl+4H3BO3或(NH4)2B4O7+2H2SO4+5H2O (NH4)2SO4+4H3BO3六 計算F100X= (V1-V2)mol/L0.014 W 5/100式中:X:樣品中蛋白質(zhì)的含量

13、，%；V1:樣品消耗鹽酸標準溶液的體積，mL;V2: 試劑空白消耗鹽酸標準液體積，mL；mol/L: 鹽酸標準液的摩爾濃度；0. 014: 1摩爾鹽酸標準液1相當(dāng)于氮數(shù)；W: 樣品的質(zhì)量，；F: 氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；5/100: 稀釋比。V1=6.31-1.86=4.45ml V2=0.4ml w=0.5020gX=15.24%分析：奶粉中蛋白質(zhì)的含量在15%到20%之間，該奶粉是合格的，由于操作人員失誤，未將冷凝器出口一直伸入接收瓶的液面下，導(dǎo)致另外一組數(shù)據(jù)偏小，因此，該組實驗數(shù)據(jù)作廢，有效數(shù)據(jù)只有第二組。六、說明1 稱樣時應(yīng)注意，不要將試樣沾在瓶頸上，固體樣品用繪圖紙包好投入凱氏燒瓶內(nèi)，

14、同時空白試驗也放入同樣大小繪圖紙。含水分多的樣品或液體樣品，應(yīng)先將水分蒸發(fā)掉，然后進行消化。2 消化樣品時，一般約3-4h左右，消化時間過長會引起損失，若樣品含脂肪或糖多時，消化時間會適當(dāng)長些，應(yīng)注意防止泡沫溢出瓶外，須時時搖動，并減少火力，必要時可以停止加熱30min后，再用大火消化。消化液澄清時應(yīng)呈藍綠色。3 硫酸鉀的加入能提高消化液的沸點，加快樣品分解速度，縮短消化時間，但硫酸鉀與硫酸的用量比不宜過大，因溫度過高生成的硫酸氫銨也會分解放出氨，造成氮的損失，使結(jié)果偏低。反應(yīng)式如下:K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O+SO4但K2SO4加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失。(NH4)2SO4=NH3+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O4 硫酸銅的催化作用機理如下反應(yīng)式所示:2CuSO4 CuSO4+SO2+O2C+2CuSO4 Cu2SO4+SO4+CO2Cu2SO4+2H2SO4 2CuSO4+2H2O+SO2此反應(yīng)不斷進行，待有機物全部被消化完后，不再有硫酸亞銅褐色生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色。故硫酸銅除起催化劑的作用外，還可指示消化終點的到達，以及下一步蒸餾時作為堿性反應(yīng)的指示劑。5 蒸餾過程中不得停