《疫學應用》課件.ppt

1、第十五章 免疫學應用,教學目的： 掌握：基于抗原抗體反應的檢測方法；免疫細胞的檢測方法 ；人工（自然）主動免疫、人工（自然）被動免疫的概念。 理解：基于抗原-抗體反應的特點及影響因素；免疫分子的檢測原理；免疫細胞的檢測方法與原理；以抗體、細胞和細胞因子為基礎的免疫治療 了解：免疫分子的檢測原理；免疫學診斷的原理、常用的免疫功能檢測指標；免疫治療制劑的類型和作用機制,教學重點： 基于抗原抗體反應的檢測方法及原理；人工（自然）主動免疫、人工（自然）被動免疫的概念。 教學難點： 抗原-抗體反應的特點及影響因素,使用教材： 醫(yī)學免疫學（第二版），龔非力主編，科學出版社，2007年。 參考教材： 醫(yī)學免

2、疫學（第五版），金伯泉主編， 人民衛(wèi)生出版社，2008年；,主要內容,第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法 第二節(jié)免疫細胞的檢測 第三節(jié)免疫分子的檢測 第四節(jié) 免疫學預防,第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法,抗原-抗體反應：指抗原與相應抗體在體內、外發(fā)生高度特異性結合反應。由于實驗所用的抗體存在于血清中，故又稱血清學反應（serological reaction) 應用： 用已知抗原檢測未知抗體； 用已知抗體檢測未知抗原： 定性或定量檢測體內各種分子； 用已知抗體檢測半抗原物質,一）特異性和交叉反應 特異性：一種抗原通常僅能與由它刺激所產生的抗體結合。 分子基礎：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間

3、構型的互補性,一、抗原-抗體反應的特點,交叉反應（cross reaction）性：若兩種抗原分子有一個或數(shù)個相同（或相似）的決定基，則針對一種抗原的抗血清可與另一種抗原發(fā)生反應,結合價： 天然抗原分子表面一般含多種抗原決定基，可與多個抗體分子結合，為多價。單體形式的抗體分子有兩個Fab段，能結合兩個相同的抗原決定基，為兩價。 前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone) Ab過剩和Ag過剩,二）抗原-抗體結合的帶現(xiàn)象與可見性,前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone) Ab過剩和Ag過剩,比例合適： 若抗原、抗體的數(shù)量比例合適，抗體分子的兩個Fab段分別與兩個抗原決

4、定基結合，相互交叉連接成網(wǎng)格狀復合體，則反應體系中基本不存在游離的抗原或抗體，此時形成肉眼可見的反應物（沉淀物或凝集物）。因此，確定反應體系中抗原、抗體的最適比例十分重要,抗原-抗體反應為分子表面的非共價結合，結合雖穩(wěn)定但可逆。在一定條件下（如低pH、高濃度鹽、凍融等），抗原-抗體復合物可被解離。解離后的抗原和抗體仍保持原有理化特性和生物學活性。根據(jù)此特點，可借助親和層析法純化抗原或抗體,三）可逆性,一）電解質 抗原和抗體有對應的極性基團，能相互吸附并由親水性變?yōu)槭杷?。電解質的存在使抗原-抗體復合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應，故免疫學試驗中多用生理鹽水稀釋抗原或抗體,二、抗原-抗體反應的影

5、響因素,二）酸堿度 抗原抗體反應的最適pH是6-8。 （三）溫度 最適溫度為37。有些例外，如冷凝集素在 4左右與紅細胞結合最好，20以上反而解離,四）抗原和抗體的性質 抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應的關鍵因素。 此外，抗原理化性質、抗原決定基多寡和種類等均可影響抗原-抗體反應,抗體分子上一個抗原結合點與對應的抗原決定基之間的結合能力,親和力(affinity,一個抗體分子與整個抗原分子間的結合強度,親合力(avidity,根據(jù)抗原的性質、結合反應的現(xiàn)象、參與反應的成分等因素分類： （一）凝集反應 （二）沉淀反應 （三）補體參加的反應 （四）免疫標記技術,三、Ag-Ab反應的基本檢測

6、方法,顆粒性抗原（細菌或細胞等）與相應抗體結合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(agglutination),一）凝集反應（Agglutination Tests,1直接凝集（direct agglutination) ： 細菌或紅細胞與相應抗體直接反應，可出現(xiàn)細菌或紅細胞凝集現(xiàn)象。 2間接凝集（indirect or passive agglutination) ：檢測針對可溶性Ag的Ab 3間接凝集抑制試驗 (direct agglutination inhibition test) 4. 協(xié)同凝集試驗（co-agglutination test,1直接凝集,Applic

7、ations Blood typing（血型測定） Bacterial infections（細菌性感染,Practical considerations Easy（簡便） Semi-quantitative（半定量,2、間接凝集,Definition - agglutination test done with a soluble antigen coated onto a particle,Applications Measurement of antibodies to soluble antigens,3、間接凝集抑制試驗,應用：可用于檢測抗原或抗體（如早孕的檢測），其 靈敏度高于一般

8、間接凝集試驗,各種凝集反應示意圖,Ag-Ab反應的基本檢測方法 （一）凝集反應 （二）沉淀反應 （三）補體參加的反應 （四）免疫標記技術,Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、細菌濾液等）與相應抗體結合，在一定條件下，形成出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的現(xiàn)象稱為沉淀反應。 該反應多用半固體瓊脂凝膠作為介質進行瓊脂擴散或免疫擴散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴散，在比例合適處相遇即形成可見的白色沉淀,二）沉淀反應（Precipitation Tests,1單向免疫擴散(single immunodiffusion) 2雙向免疫擴散(double immunodiffusion) 3免疫電泳(i

9、mmunoelectrophoresis) 4免疫比濁(immunonephelometry,二）沉淀反應,單向免疫擴散(single immunodiffusion,雙向免疫擴散(double immunodiffusion,單擴與雙擴原理,Ag-Ab反應的基本檢測方法 （一）凝集反應 （二）沉淀反應 （三）補體參加的反應 （四）免疫標記技術,用熒光素、酶、放射性核素或化學發(fā)光物質等標記抗體或抗原，進行抗原-抗體反應的檢測，是目前應用最為廣泛的免疫學檢測技術。標記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點,四）免疫標記技術 （Immunola

10、belling technique,此法乃用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標本中抗原反應，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復合物散發(fā)熒光，借此對抗原進行定性或定位,1免疫熒光法 (immunofluorescence,IF,1）直接熒光法：熒光素直接標記抗體，對標本進行檢測。該法優(yōu)點是特異性高，缺點是檢查任一抗原均須制備相應熒光抗體。 （2）間接熒光法：用一抗與標本中抗原結合，再用熒光素標記的二抗進行檢測。該法優(yōu)點是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標記的二抗即可用于多種抗原的檢測,但非特異性反應亦增強,免疫熒光法分類,免疫熒光法圖示,Mouse kidney section,Laminin

11、 - green-fluorescent Qdot 565 IgG CD31- red-fluorescent Qdot 655 IgG Nuclei - blue-fluorescent Hoechst 33342,Control,TSLP,TSLP - AlexaFluor 488 Nuclei - propidium iodide,HASMC,此法將抗原-抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，借助酶作用于底物的顯色反應判定結果。應用酶標測定儀測定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達ng/ml甚至pg/ml水平。 常見的標記物為：辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP,酶免疫

12、測定 (enzyme immunoassay, EIA,常用的方法如下： （1）酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) （2）免疫細胞或組織化學（immunocytochemistry or immunohistochemistry,ICC or IHC,1） ELISA 是酶免疫測定中應用最廣的技術，用于測定可溶性抗原或抗體。 優(yōu)點：靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定性強，可自動化檢測，從而被廣泛用于檢測多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細胞因子等,雙抗體夾心法： 用于檢測特異性抗原。該試驗所用的包被抗體與酶標抗體應分別針

13、對不同抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應無交叉反應。 間接法： 用于檢測特異性抗體。用已知抗原包被固相，加入待檢血清標本，再加酶標記的二抗，加底物觀察顯色反應,ELISA分類,間接法圖示,ELISA反應過程,動畫演示,2)酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT,生物素（biotin）是廣泛分布于動、植物體內的一種生長因子，又稱輔酶R或維生素H。 親和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一種蛋白質，由4個亞單位組成。 生物素與親和素間具有高度親和力，且均能偶聯(lián)抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影響其生物學活性,3）BAS（biotin avidin system)-ELISA,BAS-EL

14、ISA,應用酶標記的抗體與組織或細胞抗原發(fā)生反應，結合形態(tài)學觀察，對組織或細胞表面抗原進行定性、定量、定位,4）免疫細胞或免疫組化技術,ICC,IHC,乃用放射性核素標記抗原或抗體進行免疫學檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應的特異性，檢測靈敏度達pg水平。常用于標記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。 該法常用于測定微量物質，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等,3放射免疫測定法 (radioimmunoassay, RIA,化學發(fā)光免疫分析,將發(fā)光物質（如吖啶酯、魯米諾等）標記抗原或抗體，發(fā)光物質在反應劑（如過氧化陰離子）激發(fā)

15、下發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分析儀測定光子產量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。 該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質（甲狀腺素等激素,該法又稱Western印跡法，其結合凝膠電泳與固相免疫技術，將借助電泳所區(qū)分的蛋白質轉移至固相載體，再應用酶免疫、放射免疫等技術進行檢測。 該法能對分子大小不同的蛋白質進行分離并確定其分子量，常用于檢測多種病毒抗體或抗原,免疫印跡法(immunoblotting,免疫印跡法,第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法 第二節(jié)免疫細胞的檢測 第三節(jié)免疫分子的檢測 第四節(jié) 免疫學預防,一、 淋巴細胞及亞群的分離,外周血單個核細胞(PBMC)的分離：葡聚糖泛影葡胺（即淋巴

16、細胞分離液）密度梯度離心法,淋巴細胞亞群的分離 淋巴細胞為不均一的群體，可借助其表面標志及 功能差異而分為不同的群和亞群。 1尼龍棉分離法 2E花環(huán)分離法 3洗淘法 4流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM) 5磁珠分離技術,E花環(huán)實驗,磁珠分選,Removal of T cells from marrow graft,二、免疫細胞功能的測定 1. T細胞功能測定： (1) 細胞增殖(轉化)試驗： 可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。 * 絲裂原主要有PHA、Con A和PWM； * 抗原刺激物有破傷風類毒素、PPD和白色念珠菌等,淋巴細胞增殖實驗,2) T細胞介導的細胞毒試驗：C

17、TL,1) B細胞增殖(轉化)試驗 (2) 溶血空斑形成試驗 (3) 酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT,2. B細胞功能判定,溶血空斑實驗,第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法 第二節(jié)免疫細胞的檢測 第三節(jié)免疫分子的檢測 第四節(jié) 免疫學預防,在體外用已知抗原檢測相應抗體：見前述 用已知抗體對各類免疫球蛋白作定性、定量測定： 檢測血清含量高的IgG、IgA和IgM時，可用免疫比濁法； 檢測IgD和IgE選用ELISA、RIA等靈敏度高的方法。 診斷免疫球蛋白異常性疾?。ㄈ绻撬枇觥⑿月?lián)無丙種球蛋白血癥等），可用免疫電泳等方法,一、免疫球蛋白的測定,了解體內補體激活狀況，輔助有關疾病的診斷。對血清含量高

18、的C3、C4、B因子等，可用免疫比濁法，其他含量低的成分則借助ELISA、RIA等方法。血清總補體活性測定常采用50%補體溶血法（CH50），其原理是：用SRBC和兔抗SRBC作為抗原抗體復合物，通過經典途徑激活待檢血清中的補體，導致SRBC溶解。若待檢血清補體含量減少或成分缺失，則影響溶血結果,二、補體測定,一）免疫學測定法 以細胞因子作為抗原，用相應抗體進行定量或半定量檢測。對于分泌性細胞因子，常用方法為雙抗體夾心法ELISA、RIA、ELISPOT、免疫印跡法等方法檢測。對于胞內細胞因子，采用FCM免疫熒光技術檢測,三、細胞因子（CKs）檢測,二）生物活性測定法 根據(jù)細胞因子特定的生物學

19、活性，借助相應指示系統(tǒng)，如選用各種依賴性細胞株或靶細胞，同時與標準品對照測定，從而得知樣品中細胞因子活性水平，一般以活性單位（U/ml）表示。 （三）分子生物學測定法 具體方法為聚合酶鏈反應（PCR）、實時定量PCR等,第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法 第二節(jié)免疫細胞的檢測 第三節(jié)免疫分子的檢測 第四節(jié) 免疫學預防,一、免疫學預防,免疫學預防（immunoprophylaxis）是指通過人工刺激機體產生或直接輸入免疫活性物質，從而特異性清除致病因子，達到預防疾病的目的,免疫包括： 先天免疫：生物體在長期種系發(fā)育和進化中逐漸形成的一系列防衛(wèi)機制。 特異性免疫：個體在生命過程中接受抗原刺激后主動

20、產生或被動獲得的,特異性免疫獲得方式有兩種： 1、自然免疫（natural immunization,自然主動免疫：指機體受到各種病原體隱性或顯性感染后主動產生的特異性免疫。 自然被動免疫：指機體經胎盤或初乳被動獲得的特異性免疫,2、人工免疫（artificial immunization） 即免疫學預防，指采用人工方法，將疫苗、類毒素或含特異性抗體和細胞的免疫制劑接種于人體，以增強宿主的抗病能力。 人工主動免疫 人工被動免疫,人工主動免疫(artificial active immunization)： 指給機體接種抗原性物質如疫苗、類毒素等，刺激機體免疫系統(tǒng)產生特異性免疫力的方法。 人工被

21、動免疫(artificial passive immunization)： 指給人體注射含特異性抗體的免疫血清或細胞 因子等制劑,使受者迅速獲得特異性免疫力的方法,人工自動免疫與人工被動免疫的比較,人工主動免疫的接種物,疫苗（Vaccine）：細菌，病毒，螺旋體，立克次體和類毒素等抗原性生物制品統(tǒng)稱為疫苗。 理想疫苗的標準：安全；有效；實用,分類： 1、死疫苗（death vaccine）:選用免疫原性強的微生物標準株經大量培養(yǎng)后，用物理或化學方法將其殺死或滅活而制成的預防制劑。如霍亂、百日咳、傷寒、鉤端螺旋體疫苗。 優(yōu)點：主要誘導特異性抗體產生，安全 缺點：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反應嚴重,2、減毒活疫苗（live-attenuated Vaccine） 用人工