《無病毒植物的培養(yǎng)》PPT課件.ppt

1、第四章 無病毒植物的培養(yǎng),教學(xué)目的和要求,1）了解植物病毒的危害和培養(yǎng)無病毒植物的意義。 （2）理解和掌握脫除植物病毒的原理及方法。 （3）了解分離莖尖的培養(yǎng)情況。 （4）一般掌握無毒苗木的鑒定方法。 （5）一般掌握脫毒苗木的保存和利用方法,第一節(jié) 植物病毒的危害和培養(yǎng)無病毒植物的意義,病毒之所以致病不是由于消耗細(xì)胞養(yǎng)分或通過毒素殺死細(xì)胞，而是利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)占領(lǐng)空間，干擾細(xì)胞的代謝過程，促使細(xì)胞產(chǎn)生一些對(duì)細(xì)胞或生物的生命和正常功能有害的異常物質(zhì)和條件，這使得植物病毒病的防治較其他植物病害防治更為困難，常給生產(chǎn)帶來災(zāi)難的損失，被稱為“植物的癌癥,一、植物病毒的危害,植物病毒已超過600種，嚴(yán)重危

2、害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。 在果樹、蔬菜、花卉、林木以及農(nóng)作物上皆有發(fā)現(xiàn)。隨著生產(chǎn)栽培時(shí)間的推移，危害越來越嚴(yán)重，發(fā)現(xiàn)的病毒種類也越來越多,病毒調(diào)查,危害園藝植物的病毒數(shù)目,如侵染菊花的病毒和類病毒有19種之多,如 無子病毒(CAV) 潛隱病毒(CLV) B病毒(CVB) 輕斑駁病毒(CMMV) 矮化病毒(CSV) 脈斑駁病毒(CVMV) 退綠斑駁類病毒(CCMV)等,4種對(duì)草莓生產(chǎn)造成重大影響: 斑駁病毒（SMoV） 草莓黃邊病毒（SMYEV ） 草莓鑲脈病毒（SVBV） 草莓皺縮病毒 （SCrV）,甘薯根腐病,甘薯葉點(diǎn)病,甘薯枯萎病,甘薯黑痣病,2.病毒的特性及其侵染,多植物病毒不經(jīng)種子傳播，多數(shù)以種

3、子繁殖后代的植物，可以從輕度罹病植株上采集種子，播種繁殖，不會(huì)將病毒傳至下一代。（?；詮?qiáng)的病毒除外，如豆類病毒由一種?；詮?qiáng)的蚜蟲傳播)可隨著種子傳播。） 對(duì)于有性生殖退化，僅能用無性繁殖方法繁殖的植物，一旦罹病則毫無辦法。母株一旦染病，病毒在其細(xì)胞內(nèi)增殖，并通過插條、接穗、種薯、球根、鱗片傳至下一代。 通過昆蟲作為媒介加速傳播,植株脫病毒的意義,植物組織培養(yǎng)脫病毒技術(shù)是植物細(xì)胞工程的重要組成部分，脫毒種苗的生產(chǎn)在提高作物質(zhì)量和產(chǎn)量方面已顯示出極大潛力，良種、新品種的脫毒組培苗的大面積推廣和應(yīng)用，有效地解決了因病毒引起的品種退化問題。因此，植物組培脫毒技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的科學(xué)化、現(xiàn)代化中具有巨大

4、的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，還可減少農(nóng)藥的施用，改善生態(tài)環(huán)境條件，防止病害的蔓延與擴(kuò)散，該方法已成為農(nóng)業(yè)中應(yīng)用最廣泛的生物技術(shù),甘薯脫毒苗,脫毒區(qū),第二節(jié) 脫除植物病毒的原理及方法,一、物理學(xué)方法： X射線 紫外線 超短波 高溫 都能使病素鈍化，其中以熱處理最常用,1.熱處理脫除植物病毒的原理,病毒是DNA大分子，病毒進(jìn)入植物細(xì)胞后；隨植物細(xì)胞的DNA一起復(fù)制。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止，而失去侵染的能力。 熱處理是一種物理效應(yīng)，與冷處理一樣，它可以加速植物細(xì)胞的分裂，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競(jìng)爭(zhēng)中取勝,1）溫湯浸漬處理法：將剪下的接穗或種植材料，在

5、50左右的溫水中，浸漬3-15分鐘至數(shù)小時(shí)。 （2）熱風(fēng)處理法：讓盆載植物在35-40高溫下生長(zhǎng)發(fā)育，熱處理空氣溫度應(yīng)逐漸升高，然后達(dá)到所需溫度，同時(shí)必須保持一定的濕度和光照，以后可切取處理后新長(zhǎng)出的枝條作接穗和砧木，或?qū)崽幚砼c組織培養(yǎng)結(jié)合效果更好,熱處理脫毒,2、愈傷組織熱處理脫毒法,方法：從患病植株上取葉片(莖片、鱗片、花器亦可)進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后將愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)同時(shí)兼用熱處理。 常用處理溫度及處理時(shí)間： 溫度：37-38 時(shí)間：處理2周、4周或8周 溫度：50 時(shí)間：3-15min。 反復(fù)繼代兼熱處理，經(jīng)歷一定的時(shí)間(繼代次數(shù)需試驗(yàn))后，將熱處理過的愈傷組織轉(zhuǎn)移

6、到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)器官分化,果樹作物：桃(無黃萎病)、蘋果(花葉病)、葡萄(扇葉病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、樹莓、紅莓苔子、草莓等。 蔬菜作物：馬鈴薯、番茄、菠菜。 花卉植物：蔓生長(zhǎng)春花、康乃馨、菊花等。 其他植物：曼陀羅等,例：煙草愈傷組織兼熱處理鈍化煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)獲得無病毒株效果做法,A：從患病煙草植株上取5mm葉片培養(yǎng)，在MS附加IAA 2+KT 0.2的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。 B：將其中一部分愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)中分別兼用25、30和37溫度熱處理8周。 C：將熱處理后的愈傷組織，轉(zhuǎn)到MS附加IAA 2+KT 2的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽分

7、化。 D：將1cm長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)移到MS附加IAA 2+KT 0.02生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)根分化。 E：完整植株獲得后，移植到無毒土壤栽培并進(jìn)行鑒定。 結(jié)果表明：反復(fù)繼代培養(yǎng)可獲得無病毒株,3.低溫處理脫出病毒,菊花植株-5,4-7.5個(gè)月處理后進(jìn)行莖尖培養(yǎng),可以除去矮化病毒(CSV)和褪綠班駁病毒(CCMV),而單獨(dú)的莖尖培養(yǎng)無此效果,二、化學(xué)方法,使用農(nóng)藥是防治植物真細(xì)菌病害的主要方法，理論上講，也應(yīng)該是防治病毒的有效途徑。 有不少化學(xué)物質(zhì)能抑制病毒復(fù)制，例如孔雀綠、硫尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、以及某些病毒抑制劑。 如Viraz01e(病毒唑)和一些蛋白質(zhì)、核酸合成抑制劑等。由于病毒的復(fù)制和寄主的代謝過

8、程關(guān)系非常密切，因此，要找出既干擾病毒復(fù)制，又不影響寄主細(xì)胞正常代謝的藥劑十分困難,利用這些化合物處理整株植物去病毒的效果雖不理想，但培養(yǎng)離體的組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等卻可能有良好效果。 如在培養(yǎng)基中加入2硫尿嘧啶可以除去煙草愈傷組織中的PVY病毒，加入放線菌素D可以抑制原生質(zhì)體中的病毒復(fù)制等,鈍化、抑制和清除植物病毒的一些化合物,三、生物學(xué)方法,1.莖尖培養(yǎng)脫毒 （1）莖尖培養(yǎng)脫毒的理論基礎(chǔ) a、病毒在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移是通過維營(yíng)束系統(tǒng)完成的，在分生組織區(qū)域內(nèi)沒有維管束組織，病毒只能通過胞間連絲傳遞趕不上細(xì)胞的不斷分裂和活躍的生長(zhǎng)速度； b、在分裂旺盛的分生組織內(nèi)，病毒的復(fù)制受到旺盛代謝活動(dòng)的限制

9、； c、在植物分生區(qū)域內(nèi)，“病毒鈍化體系”的活性較其他部位的活性高； d、莖尖分生組織內(nèi)高濃度的植物內(nèi)源激素可能會(huì)抑制病毒的增殖,2）莖尖培養(yǎng)脫毒苗的方法,在解剖鏡下剝?nèi)∏o尖?？紤]到脫毒效果及提高成活率，一般切取0.20.5mm的莖尖為組織材料進(jìn)行培養(yǎng)，不同的植物莖尖對(duì)外源激素的反應(yīng)不同。 莖尖大小:過大時(shí)接種易成活，但脫毒效果差，過小時(shí)難成活，但脫毒效果好。一般以帶有1-2片葉原基為好，大小為0.2-0.3mm為宜，超過0.5mm時(shí)，脫毒效果差。 培養(yǎng)基:只要能使莖尖快速生長(zhǎng)，分化快的培養(yǎng)基均適于脫毒。一般以MS較好，添加一定比例的細(xì)胞分裂素就行,馬鈴薯的芽,莖尖的結(jié)構(gòu),微莖尖,普通莖尖,馬

10、鈴薯脫毒苗,康乃馨不同莖尖培養(yǎng)與康乃馨斑駁病毒的脫除情況,3)莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒的技術(shù)關(guān)鍵,同一種病毒在不同植物體內(nèi)分布部位不同。 例：煙草花葉病毒(TMV)在如下植物中的熒光反應(yīng)。 煙草：l-4片葉原基中未見TMY特異熒光 撞羽矮牽牛：一兩片葉原基未見TMV特異熒 光，而在三四片葉原莖中可見TMV熒光。 番茄：1片葉原莖中未見TMV特異熒光。 所以在用莖尖培養(yǎng)脫毒時(shí)，必須認(rèn)真確定病毒在植物莖尖中的分布部位，然后確定培養(yǎng)莖尖的大小,如：番茄：只能取生長(zhǎng)錐或僅帶一片葉原基的莖 尖進(jìn)行培養(yǎng)； 撞羽矮牽牛：可取生長(zhǎng)錐或帶一兩片葉原基 的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)； 煙草：可取帶4片葉原基的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)。 利用

11、莖尖堵養(yǎng)法脫除植物病毒時(shí)，最好找出莖原基所帶葉原基的數(shù)目與生長(zhǎng)點(diǎn)(莖尖)大小的相關(guān)性，這樣在取材時(shí)就方便多了,莖原基 0.050.08mm 莖原基帶2片葉原基 0.10.2mm 莖原基帶4片葉原基 0.30.4mm 莖原基帶6片葉原基 0.60.8mm,不同病毒種類在同一種植物中分布部位不同,甘薯 斑紋花葉病毒、縮葉花葉病毒： 分布于1.0- 2.0mm以內(nèi)的莖尖中 羽毛狀花葉病毒： 分布于0.3-1.0mm以內(nèi)莖尖中 馬鈴薯 馬鈴薯卷葉病毒、Y病毒： 分布于1.0-3.0mm以內(nèi)的莖尖中； X病毒：分布于0.2-0.5mm以內(nèi)的莖尖 G病毒：分布于0.2-0.3mm以內(nèi)的莖尖 S病毒：0.2

12、mm以下,2.愈傷組織培養(yǎng)脫毒,植物各部位器官和組織培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無病毒苗。 說明病毒顆粒會(huì)在愈傷組織的培養(yǎng)過程中逐漸消失,愈傷組織脫病毒的機(jī)理,可能的原因有： 病毒在植物體內(nèi)不同器官或同一器官的不同組織中分布不均勻，由那些無病毒細(xì)胞增殖產(chǎn)生的愈傷組織就是獲得無病毒苗的基礎(chǔ)。 有些愈傷組織細(xì)胞中病毒濃度較低，在愈傷組織細(xì)胞快速分裂過程中，病毒的復(fù)制能力衰退或丟失。 繼代培養(yǎng)的愈傷組織容易產(chǎn)生抗性變異細(xì)胞，因而可能出現(xiàn)不帶病毒的愈傷組織。但經(jīng)愈傷組織產(chǎn)生無病毒苗的脫毒途徑容易產(chǎn)生變異，可能導(dǎo)致植株喪失其原有的優(yōu)良性狀，當(dāng)然也有可能產(chǎn)生

13、有益的變異，但頻率極低,3.莖尖微體嫁接脫毒,先將砧木種子進(jìn)行表面消毒，以后再接到1%瓊脂以MS無機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)芽，用苗齡約2周的幼嫩實(shí)生苗作砧木。 把實(shí)生苗從試管中取出，在無菌條件下切去頂部，留下1-1.5cm的上胚軸部分，將子葉和液芽除去，把根切短至46cm長(zhǎng)。 從田間或溫室旺盛生長(zhǎng)的成年樹剪取一小段新梢，經(jīng)消毒后在超凈臺(tái)上用顯微操作法取出僅帶1-3個(gè)葉原基的莖尖約1mm大小作穗用。采用倒T字形的水平切口。 嫁接苗用液體濾低橋培養(yǎng)基培養(yǎng)。成活率30%50%，嫁接成功的植株移植到土壤之前至少要有兩片展開的真葉,蘋果微體嫁接莖尖大小與脫毒成功率,蘋果不同取材時(shí)期對(duì)微體嫁接成功率的影響,蘋果微

14、體嫁接莖尖大小與脫毒成功率,試管微體嫁接在果樹方面發(fā)展最快,1)嫁接植物不受與珠心及有性實(shí)生苗相關(guān)的幼年階段的影響。 (2)許多栽培品種通過嫁接繁殖了許多世代，因此果樹研究者和種植者關(guān)于這些品種的自根苗的根冠大小、病蟲害情況以及耐寒性等了解得很少,3)莖尖組織培養(yǎng)繁殖結(jié)合熱處理可產(chǎn)生無病毒植物，因此，許多研究者認(rèn)為對(duì)通常采用嫁接繁殖的果樹進(jìn)行試管嫁接是很適宜的。 (4)試管微體嫁接除了可培育無病毒植株外，還可解決難以生根的園藝植物的生根問題和進(jìn)行嫁接親和力的研究,4.珠心胚培養(yǎng)脫毒,柑桔類80%以上的種類具有多胚性,而單胚占的比例很小。 柑橘類植物中有不少多胚品種，一顆種子內(nèi)除一個(gè)合子胚外，還

15、有數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)由珠心細(xì)胞形成的無性胚，稱做珠心胚。 因?yàn)椴《就ǔＪ墙?jīng)維管束的韌皮組織傳播的，而珠心與維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系。由珠心組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的植株就可免除病素毒的危害,它與合子胚不同，不是受精的產(chǎn)物，而是由體細(xì)胞產(chǎn)生的，因此具有和母體相同的遺傳組成； 與合子胚一樣，在珠心胚和植株之間無維管組織連系，因此即使母體植株感染了病毒，珠心胚也是無毒的； 在自然條件下，珠心胚一般都不能發(fā)育成熟，只有適時(shí)從種子中剝離出來，接種在人工培養(yǎng)基上，珠心胚才能長(zhǎng)成植株，而這些植株應(yīng)當(dāng)是不帶病毒的母體無性系,珠心胚具有3個(gè)特征,5.花藥培養(yǎng)脫毒,花藥培養(yǎng)的最初目的，是培育起源于花藥內(nèi)部花粉粒的單倍體植株，并使單倍體

16、加倍，作為育種材料的來源。 但經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)表明花藥培養(yǎng)所得的植株有95%以上是能開花結(jié)果的多倍體，而且生長(zhǎng)發(fā)育都優(yōu)于母株。 已證明，經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)出來的花藥植株是不帶病毒的，借此方法，不僅可快速培育出大量的無毒植株，并可省去病毒鑒定工作，對(duì)基層生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)為一舉兩得的事情,三、分離莖尖的培養(yǎng)情況,第一種：是生長(zhǎng)停止，接種的組織并有擴(kuò)大，顏色逐漸變褐而枯死，這種情況大多是生長(zhǎng)點(diǎn)在分離接種過程中受傷而造成的； 第二種：是生長(zhǎng)太慢，莖尖接種后顏色逐漸變綠，但不見增大，最后成綠色小點(diǎn)。這是由于生長(zhǎng)素濃度偏低，或培養(yǎng)溫度過低所造成的，如果立即轉(zhuǎn)入較高濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中，或提高培養(yǎng)溫度，即能促進(jìn)莖尖生長(zhǎng),第

17、三種：是生長(zhǎng)過旺，接種后莖尖明顯增大，約培養(yǎng)一同后即在莖尖基部產(chǎn)生愈傷組織，但不易見到莖尖的伸長(zhǎng)，組織顏色也較澆。這是由于培養(yǎng)莖生長(zhǎng)素濃度偏高，或光照弱，溫度高而造成的。為此應(yīng)將培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)素濃度較低的培養(yǎng)基中，或降低溫度，提高光照強(qiáng)度來解決。否則時(shí)間長(zhǎng)了愈傷組織會(huì)表?yè)Q生長(zhǎng)分化能力； 第四種：是生長(zhǎng)正常、在營(yíng)養(yǎng)、激素、溫度、光照等各方面條件正常的情況下，接種的莖尖顏色逐漸變綠，基部逐漸增大，有時(shí)形成少量的愈傷組織，莖尖也逐漸伸長(zhǎng)，培養(yǎng)一個(gè)月左右轉(zhuǎn)入無基素的基本培養(yǎng)基，莖尖繼續(xù)伸長(zhǎng)，并產(chǎn)生根系，最后發(fā)育成完整植株,第三節(jié) 無病毒植株脫毒程序,一、材料準(zhǔn)備 1決定植物種類及品種。選用生長(zhǎng)健壯，

18、遺傳性一致的品種為材料，并探明該品種除所脫除 的病毒在寄主中的位置。 2了解該植物體內(nèi)所具有的病毒種類及危害的程 度。根據(jù)植物所帶病毒種類，選擇指示植物(敏感植物)。 3決定脫除病毒的方法：“莖尖培養(yǎng)”還是“熱處理”還是“微體嫁接,二、生長(zhǎng)點(diǎn)分離和培養(yǎng)(莖尖培養(yǎng)為例,1從罹病的植株上切取頂芽或腋芽。 2材料表面滅菌、決定滅菌藥劑、濃度、時(shí)間。 3根據(jù)病毒在寄主內(nèi)分布位置決定切取莖尖大小。如果熱處理，那么決定熱處理的溫度、時(shí)間。 4接種成功率與莖形狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。 例 馬鈴薯、百合生長(zhǎng)點(diǎn)呈半圓形較大、好分離。 番薯、矮牽牛、香石竹呈半圓形，也比較好分離。 大麗花、菊花生長(zhǎng)點(diǎn)扁平、并被對(duì)生葉原基夾住難

19、分離。 草莓，葉原基上生有密集茸毛，生長(zhǎng)點(diǎn)埋在肉質(zhì)凹形槽 內(nèi)，不僅難分離且容易污染,三、無病毒植物的鑒定,通過莖尖分生組織培養(yǎng)、熱處理脫毒法、微體嫁接法而培養(yǎng)成的植株，不一定都是無病毒植株。 當(dāng)前用于病毒檢測(cè)的方法有如下3種： 血清鑒定法； 生物鑒定法(敏感植物或指示植物)； 電子顯微鏡鑒定法。 采用單一鑒定法并不十分可靠。特別是對(duì)一些特異性病毒，單一鑒定方法可靠性更差。最好三種方法同時(shí)鑒定，可以獲得理想的結(jié)果,一)指示植物鑒定法,1、原理 指示植物法是利用病毒在其它植物上產(chǎn)生的枯斑作為病毒種類鑒別的標(biāo)準(zhǔn)，也即枯斑和空斑測(cè)定法,2、指示植物兩種類型,一種是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，出現(xiàn)在病毒擴(kuò)展到

20、的植物非接合部位，通常沒有局部明顯病斑； 另一種是只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)斑構(gòu)成。 常用的指示植物：千日紅、曼陀羅、豇豆、心葉煙、辣椒、莨菪等,每種病毒都有自己的敏感植物如,馬鈴薯病毒的敏感植物：千日紅、黃花煙、心葉煙、 毛葉曼陀羅； 大蒜病毒的敏感植物：藜、千日紅； 草莓病毒的敏感植物：威州草莓(從八倍體野生種選出)、野草莓、野紅草莓等。 桃紅葉病毒的敏感植物：旱金蓮。 大麗花病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜、心葉煙、克里芙蘭煙、矮牽牛、黃瓜。 香石竹病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜。 菊花病毒的敏感植物：矮牽牛、豇豆,3、敏感植物鑒定病毒的方法,A、摩擦接種法： 取培養(yǎng)植株的葉片

21、榨汁，將其汁用摩擦法接種到各自的敏感植物上，然后視其病斑有無，來判斷是否脫除了病毒。 接種后如若敏感植物葉片表現(xiàn)病斑，可根據(jù)病斑類型判斷，還有哪種病毒沒有脫除,例：馬鈴薯體內(nèi)各種病毒在其敏感植物上表現(xiàn)的癥狀： X病毒侵染千日紅(葉片呈枯斑)； M、S病毒侵染千日紅(葉片呈突起枯斑)； X病毒侵染黃花煙(葉片呈花葉)； Y病毒侵染黃花煙(葉片花葉或條斑或呈明顯脈綠帶)； X病毒侵染心葉煙(葉片呈花葉)； Y病毒侵染心葉煙(葉片呈條斑)；PG帶毒體侵染心葉煙(葉片呈花葉)； M、Y病毒侵染毛葉曼陀羅(葉片呈枯斑)。 植物汁液摩擦接種后，如使千日紅葉片呈枯斑，使黃花煙、心葉煙葉片呈花葉證明，該植物體

22、內(nèi)具有馬鈴薯X病毒,B嫁接法： 有些病毒不是通過汁液傳播，而是通過專門的介體傳播。如草莓黃化病毒、草莓叢枝病毒是通過一種特殊的蚜蟲為介體進(jìn)行傳播。 這種病毒的鑒定，需將培養(yǎng)植株的芽嫁接在敏感植物上，根據(jù)敏感植物的病癥表現(xiàn)來判斷是否脫除了病毒,木本多年生植物及草莓等無性繁殖的草本植物通常采用嫁接接種的方法,以指示植物作砧木，被鑒定植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法為多。 如草莓以對(duì)病毒敏感的歐洲草莓（野草莓）和深紅莓作指示植物，從經(jīng)脫毒得到的植株上僅取成齡葉片頂端一小葉作接穗，葉柄用刀片削成楔形，削面長(zhǎng)810 mm，然后迅速將接穗小葉的葉柄插入切口，用塑料綁縛接合部，嫁接

23、后4周，若帶有病毒，則在新展開的葉片、匍匐莖或老葉上會(huì)出現(xiàn)病征,二）抗血清鑒定法,1、基本原理： 當(dāng)動(dòng)物被病毒感染或人工注射異體蛋白質(zhì)時(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一種特異性丙種球蛋白稱為免疫球蛋白，即所謂“抗體”。 引起形成抗體的物質(zhì)(病毒或異體蛋白)稱為“抗原,抗原和抗體結(jié)合，表現(xiàn)為很強(qiáng)的特異性。即由一種病毒產(chǎn)生的抗體，只能結(jié)合該種病毒?？贵w在特殊細(xì)胞內(nèi)形成，進(jìn)入血液存在于血清和體液內(nèi)。 這種含有特異性“抗體”的血清稱為“抗血清”?？乖涂贵w相結(jié)合的反應(yīng)稱為“血清反應(yīng),2.病毒抗血清在診斷上的價(jià)值,A.病毒抗血清具有高度的專化性。即由一種病毒產(chǎn)生的“抗體”，只能結(jié)合該種病毒(抗原)。如由注射(感染)

24、TMV而產(chǎn)生的抗體(免疫球蛋白)，只能檢測(cè)TMV病毒(才可能發(fā)生血清反應(yīng))。 B由于“抗血清”法具有高度專化性，因此對(duì)于那些受感染而沒有癥狀的帶毒植物，也能診斷，故在實(shí)用上具有很高的價(jià)值。 C由于病毒與“抗血清”的“反應(yīng)量”與病毒濃度成正比。只要知道其中一種濃度，可根據(jù)反應(yīng)量來測(cè)定另一種的濃度。故此可以用來作病毒的定量分析,3.病毒抗血清在診斷上的局限性,A.不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黃化型”病毒，或嚴(yán)格由?；岳ハx傳播的病毒。如馬鈴薯卷葉病毒極難或不能獲得“抗血清”。 B病毒在寄主體內(nèi)含量太少，而提純過程中喪失又太多?；蛘咛峒冞^程中，病毒質(zhì)粒喪失了必備的抗原結(jié)構(gòu)。 C植物體內(nèi)具有單寧

25、物質(zhì)，單寧與病毒結(jié)合，使病毒喪失了抗原性質(zhì),4.方法,抗血清鑒定首先要進(jìn)行抗原的制備，包括病毒的繁殖、病葉研磨、汁液的澄清、病毒懸浮液的提純、病毒的沉淀等過程。只有獲得高純度的抗原，才有可能獲得高度純凈的抗血清。 一般采用家兔制備抗植物病毒的抗血清，以924個(gè)月大小的家兔為好，注射病毒懸浮液，在家兔饑餓12 h后采血，再進(jìn)行抗血清的分離和吸收等過程。血清可分裝在小玻璃瓶中，貯存在1520 的冰凍條件下，也可以分裝在安瓶中，冷凍干燥，然后密封，有效保存,具體測(cè)定可采用沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、熒光抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等多種方法,酶聯(lián)免疫吸附法 (enzyme 1inked i

26、mmunOsOrbentassay，EL工SA,酶聯(lián)免疫吸附法是把抗原抗體的免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相互結(jié)合而發(fā)展起來的一種綜合性技術(shù)，它的靈敏度高，特異性強(qiáng)，特別是當(dāng)寄主體內(nèi)病毒濃度很低或同時(shí)存在病毒鈍化物或抑制劑時(shí)，它的優(yōu)勢(shì)尤為明顯，因而是近年來病毒檢測(cè)方法中發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的一種方法,酶聯(lián)免疫吸附法的原理,利用以酶標(biāo)記的特異抗體來指示抗原抗體的結(jié)合，從而檢出樣品中的抗原。 具體操作程序是：將待檢植物汁液(抗原)注入酶聯(lián)板(聚苯乙烯多孔微量反應(yīng)板)中，使抗原吸附于它的孔壁，然后加入以酶標(biāo)記的特異抗體，待抗原與抗體充分反應(yīng)后，洗去未與抗原結(jié)合的多余酶標(biāo)記抗體，于是在固相載體酶聯(lián)板表面就只留下

27、以酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物。這時(shí)加入酶的無色底物，復(fù)合物上的酶催化底物降解，生成有色產(chǎn)物。這一結(jié)果可用肉眼識(shí)別，也可用分光光度計(jì)對(duì)底物的降解量進(jìn)行測(cè)定,血清鑒定法,血清鑒定的基本方法,A.玻璃片凝集法 在清潔玻璃片的一端，用毛細(xì)管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量對(duì)照血清。然后各加滴被檢植物壓榨出的原汁液兩滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置20-50min，然后在40-60倍顯微鏡下觀察。帶病毒的葉綠體發(fā)生典型的凝集現(xiàn)象,玻璃片凝集法,B微量凝集試驗(yàn)(MAT) 在培養(yǎng)皿底部，鋪上一層火棉膠或聚乙烯醇縮甲醛薄膜，然后將抗血清滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆蓋一層石蠟油。在2025下保溫，20-50mi

28、n后觀察。 此法優(yōu)點(diǎn)：鑒定時(shí)可以完全避免蒸發(fā)，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培養(yǎng)皿可以鑒定幾十個(gè)樣品。對(duì)某些病毒(馬鈴薯M病毒)引起的細(xì)微病毒凝聚現(xiàn)象均可識(shí)別,三）電子顯微鏡檢查法,采用電子顯微鏡，可以通過直接觀察，檢查出有無病毒存在，并可以得知有關(guān)病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu),又可以鑒定病毒的種類。這是一種較為先進(jìn)的方法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)。 。 病毒 形態(tài) 長(zhǎng)(nm) 寬（nm） X 線 狀 515 13 Y 線 狀 730 11 A 線 狀 730 11 S 線 狀 650 1213 M 線 狀 650 1213,靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測(cè)定病毒。 目前運(yùn)用負(fù)染和超

29、薄切片電鏡觀察能夠診斷和鑒別病毒到屬的水平。 1973年，Derrick把電鏡與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，建立了更為靈敏的免疫吸附電鏡技術(shù)，該技術(shù)已成為植物病毒研究的一個(gè)重要手段,方法的優(yōu)點(diǎn),四)分子生物學(xué)方法,在植物病毒鑒定中采用的分子生物學(xué)方法主要是檢測(cè)病毒的核酸。 一般都具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。 核酸雜交技術(shù)的原理:采用帶有放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的已知序列核酸單鏈作為探針，在一定條件下與靶病毒的核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。通過雜交信號(hào)的檢測(cè)，鑒定樣本中有無相應(yīng)病毒的基因,19世紀(jì)末以來，許多國(guó)家開始用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)果樹病毒，并取得很好的效果。 常用的有聚合酶鏈

30、式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，即利用已知病毒的核苷酸序列或同組病毒的相似序列區(qū)域來設(shè)計(jì)引物，將待測(cè)樣品用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA，擴(kuò)增后的產(chǎn)物可進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturing grade gel electrophor

31、esis，DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformation polymorphism，SSCP)、探針交叉雜交等技術(shù)分析檢測(cè)病毒是否存在,由于多數(shù)植物病毒核酸是RNA，在進(jìn)行PCR檢測(cè)前，需以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，再利用病毒核酸特有的序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，即可知道在寄主中是否有病毒存在。 RNA病毒和類病毒等在寄主體內(nèi)可形成雙鏈RNA(dsRNA)，而一般情況下植物體內(nèi)不存在dsRNA，因此dsRNA分析也可用于植物病毒鑒定,利用DNA雜交和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的基因芯片技術(shù)也是植物病毒快速檢測(cè)的重要發(fā)展方向。 在實(shí)際應(yīng)用中，為了提高檢測(cè)的可靠性，往往用幾種方法同時(shí)鑒定。最后選擇出的無毒苗即可進(jìn)行擴(kuò)增繁殖，用于生產(chǎn)。但在無毒種苗的擴(kuò)增繁殖和應(yīng)用過程中應(yīng)注意防止再度感染,植物脫毒苗生產(chǎn)應(yīng)用尚不普遍，原因如下： 基礎(chǔ)研究跟不上，諸如病毒特性與寄主的關(guān)系，各植物種體內(nèi)都有什么病毒等。 脫毒培養(yǎng)后如何快速檢測(cè)。 得到脫毒原種苗后，如何保存?如何防止再度侵染等,四、無毒原種苗的繁殖,經(jīng)莖尖培養(yǎng)法，熱處理法、微體嫁接法獲得的無病毒株數(shù)量是很有限的，需擴(kuò)大繁殖才能滿足生產(chǎn)需要。 一方面充分發(fā)揮