IPTG誘導蛋白表達的原理及方法步驟

1、.IPTG誘導蛋白表達的原理及方法步驟E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個結構基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結合，使操縱子（元）受阻遏而處于關閉狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結合位點。由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成lac操縱子的調控區(qū)，三個酶的編碼基因即由同一調控區(qū)調節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調表達 。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時，I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合，阻礙RNA聚合酶與P序

2、列結合，抑制轉錄起動。當有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經(jīng)b半乳糖苷酶催化，轉變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白，使蛋白構象變化，導致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實驗室廣泛應用。材料1、誘導表達材料( 1 ) LB （LuriaBertani）)培養(yǎng)基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%蒸餾水 (Distilled water)

3、1000ml pH 7.0適用范圍：大腸桿菌( 2 ) IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 m 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，20 保存。( 3 ) l 凝膠電泳加樣緩沖液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （電泳級）0.1 溴酚藍10 甘油2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料1 ）酶溶法（1）裂解緩沖液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟

4、（PMSF ）。（3）10 mg / mL 溶菌酶。（4）脫氧膽酸。（5）1 mg / mL DNase I。2 ）超聲破碎法( 1 ) TE 緩沖液。( 2 ) 2SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 溴酚藍20 甘油實驗方案1、外源基因的誘導表達( 1 ）用適當?shù)南拗菩詢惹泻怂崦赶d體DNA 和目的基因。( 2 ）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉化到相應的宿主菌。( 3 ）篩選出含重組子的轉化菌落，提取質粒DNA 作限制性內切核酸酶圖譜，DNA 序列測定，確定無誤后

5、進行下一步。( 4 ）如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32 培養(yǎng)數(shù)小時，使培養(yǎng)液的OD600達0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ；如果表達載體的原核啟動子為tac 等，則37 培養(yǎng)細菌數(shù)小時達到對數(shù)生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h 。( 5 ）取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 L 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化1 ）細菌的裂解常用方法有： 高溫珠磨法； 高壓勻漿； 超聲破碎法； 酶溶法； 化學滲透等。前三種方法屬機械破碎法，并且方法 、 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應用，后三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；-1,3 -葡聚糖酶；-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用，而其他幾種酶