實驗大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及質粒DNA的轉化

1、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及質粒DNA的轉化 一、實驗目的和要求 通過本實驗學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞和外源質粒DNA轉入受體菌細胞的技術。了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。 二、實驗原理 感受態(tài)細胞(Competent cells): 受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞(competent cell) 。 轉化（transformation）： 是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。 進入細胞的DNA分

2、子通過復制表達，才能實現(xiàn)遺傳信息的轉移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。 轉化的方法： 化學的方法:使用化學試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細胞，通過處理將載體DNA分子導入受體細胞； 電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。 克隆的篩選： 主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等； 將經(jīng)過轉化后的細胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉化體，即帶有異源DNA分子的受體細胞。否則，如果將轉化后

3、的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細菌菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉化的質粒。 三、操作步驟1）大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法) E.coli DH5菌平板上挑取一單菌落，接種于3ml LB1）從液體培養(yǎng)基（中，37振蕩培養(yǎng)過夜。將該菌懸液以1:1001:50轉接于200ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔2030min測一次OD600nm，至OD600nm0.5時停止培養(yǎng)（約23小時）； （2）每人取1個離心管，轉入1ml培養(yǎng)液，在冰上冷卻2-3min，于4，5000rpmmin離心5min（從這一步開始，所有操作均在冰上進行

4、，速度盡量快而穩(wěn)）； （3）吸干上清培養(yǎng)液，用0.5 ml冰冷的0.1 M CaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰浴15 min ； （4）5000rpmmin離心5min； （6）棄去上清液，加入100l冰冷的0.1 M CaCl2溶液，小心懸浮細胞，冰上放置超過1小時后，即制成了感受態(tài)細胞懸液； （7）制備好的感受態(tài)細胞懸液可直接用于轉化實驗，也可加入占總體積1520左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70條件下，可保存半年至一年。 2）細胞轉化 (1) 取1 l質粒DNA加入 100l感受態(tài)細胞，輕輕混勻，冰上放置30min， (2) 于42水浴中保溫1min，然后迅速冰

5、上冷卻2min (3) 立即向上述管中分別加入1ml LB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37振蕩培養(yǎng)約45-60min ，使受體菌恢復正常生長狀態(tài)，并使轉化體表達抗生素基因產(chǎn)物(Ampr)（該步驟可以省略）。 3) 平板培養(yǎng) (1) 取各樣品培養(yǎng)液20ul或50ul，涂布于含Amp抗菌素的LB平板培養(yǎng)基上，（用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）。 (2) 菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜(12-16小時)。 生產(chǎn)DNA 粒質旋螺超克微每使可，胞細態(tài)受感的備制法CaCl2 用5?106-2?107個轉化菌落。在實際工作中，每微克有105以上的轉化菌落足以滿足一

6、般的克隆實驗。 五、實驗結果 實驗中使用自制的質粒，結果成 功，觀察到如下圖中所示的培養(yǎng)結果。 DNA呈藍色。轉化成功的質粒 轉化效率）轉化子總數(shù)菌落數(shù)稀釋（1倍數(shù)轉化反應原液總體積涂板菌 液體積）感受態(tài)細胞總數(shù)受體菌對2（照組菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積 涂板菌液體積加入轉化子總數(shù)質粒DNA質粒（轉化子數(shù)每gDNA）（3轉化頻率g) (量 ）感受態(tài)細胞轉化效率轉化子總數(shù)感受態(tài)細胞總數(shù)（4 六、實驗討論 應設立對照：1 應注意涂板用菌液濃度：2 （每一稀釋度涂布用不同稀釋度菌液進行涂板一般應對菌液進行等比稀釋，二皿），使生長出來的菌落互相獨立、不混淆，便于挑取單菌落。 的污染防止雜菌和雜DNA3 1）整個操作過程均應在無菌條件下進行（ 頭等最好是新的，并經(jīng)高壓