細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)

1、許欣,1,細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn),細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù),許欣,2,第一節(jié) 樣本的采集與送檢,在公共衛(wèi)生及預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所涉及的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)樣本種類繁多，包括來自食品、化妝品、涉水產(chǎn)品、消毒及衛(wèi)生用品、環(huán)境及物品（水、土壤、空氣，各種物品）、正常人體及臨床等的樣本,許欣,3,一、臨床樣本的采集與送檢,一）血及骨髓樣本的采集 1. 采樣時(shí)間：發(fā)熱期、用藥之前、 病情發(fā)展 2. 采樣部位及頻率：多部位、高頻率 3. 樣本采集的量：成人血量10ml，嬰兒1ml2ml，兒童3ml5ml；當(dāng)懷疑為真菌感染時(shí)，應(yīng)采集雙份量，分別作雙相培養(yǎng)(37/28)。骨髓1 ml2 ml。 4. 樣本的送檢：盡快，室溫 5. 注意事項(xiàng)：同

2、時(shí)需氧和厭氧培養(yǎng),許欣,4,一、臨床樣本的采集與送檢,二）尿液樣本的采集 1. 采樣時(shí)間：晨尿、用藥前 2. 采樣方法：10ml，中段尿、腎盂尿、導(dǎo)尿 3. 注意事項(xiàng)：無菌操作，用藥前 （三）糞便樣本的采集 1. 采樣時(shí)間：急性期、新鮮糞便 2. 采樣方法：自然排便、直腸拭子、Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基或pH7.0的甘油PBS 3. 注意事項(xiàng)：無菌操作、可能厭氧培養(yǎng),許欣,5,一、臨床樣本的采集與送檢,四）痰及上呼吸道樣本的采集 1. 采樣時(shí)間：晨痰、鼻咽拭子 2. 采樣方法：自然咳痰法、支氣管鏡采集法、胃內(nèi)采痰法、氣管穿刺法等 ；咽拭子 3. 注意事項(xiàng)：先漱口、結(jié)核分枝桿菌和真菌可4保存

3、,許欣,6,一、臨床樣本的采集與送檢,五）其它臨床樣本 化膿和創(chuàng)傷樣本：棉拭子 腦脊液、膽汁、胸水、腹水、心包液、關(guān)節(jié)液和鞘膜液等：穿刺 生殖道：棉拭子 組織樣本：內(nèi)鏡 炎癥或組織壞死部位：手術(shù),許欣,7,二、食品衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)樣本,一）樣品采集原則 注意代表性，防止樣品受污染、變質(zhì)和細(xì)菌生長 大樣(一整批 )、中樣(混合200g )和小樣(檢樣25g) （二）樣品采集方法 無菌用具、包裝完好、混合、震搖、冷凍、冷藏 （三）采樣的數(shù)量 根據(jù)食品種類的不同，采樣的數(shù)量也應(yīng)不同 （四）注意事項(xiàng) 3h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，無菌操作,許欣,8,三、化妝品細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)樣本,一）采樣數(shù)量 每批兩個(gè)大包裝抽取4個(gè)包裝，

4、10g或10ml （二）樣本的處理 1. 液體樣品：10倍稀釋，油性物用液體石蠟、土溫-80 2. 膏霜乳劑樣品：親水性-玻璃珠，疏水性-先行乳化 3. 固體樣品的處理：均質(zhì)后取上清液 （三）樣品送檢原則及注意事項(xiàng) 1. 維持樣品污染原狀（出廠污染狀態(tài)） 2. 去除殘留防腐劑及抑菌劑（吐溫-80和卵磷脂 ） 3. 注意事項(xiàng)（室溫存放，多項(xiàng)目時(shí)先做微生物,許欣,9,四、生活飲用水細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)樣本,一）水樣采集 許多水體隨時(shí)間和空間會(huì)發(fā)生很大變化，要采集具有代表性的樣品，必須定出合理的采樣規(guī)劃。 （二）采樣點(diǎn)的選擇 注意樣品的代表性，河水、湖水、地下水、自來水 （三）采樣器具 采樣瓶、自動(dòng)采樣器、容

5、器可加硫代硫酸鈉 （四）樣品送檢及注意事項(xiàng) 4h內(nèi)檢驗(yàn)、可冷藏,許欣,10,五、消毒及衛(wèi)生用品,一）醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)消毒及衛(wèi)生用品 物表 ：5cm5cm滅菌規(guī)格板，100cm2 區(qū)域 空氣：高度150cm、距墻100cm；面積30m2，設(shè)一條對角線上內(nèi)、中、外3點(diǎn)；面積 30m2，設(shè)4角及中央5點(diǎn)，暴皿5min；或用采樣器 手/皮膚粘膜：含中和劑棉拭子，5cm5cm規(guī)格板 醫(yī)療用品：破壞、棉拭子 消毒劑：1ml加至9ml中和劑中,許欣,11,五、消毒及衛(wèi)生用品,二）一次性使用的衛(wèi)生用品 同一批號3個(gè)運(yùn)輸包裝中至少隨機(jī)抽取12個(gè)最小包裝量；1/4用于檢測、1/4用于留樣、2/4就地封存準(zhǔn)備復(fù)測,許欣

6、,12,六、空氣樣本,平板沉降法和采樣器采集法 （一）空氣微生物采樣器分類 按照采樣方式的不同可分為兩類(和類)，類是將微生物直接采到固體培養(yǎng)基上(如Andersen采樣器)，類是把微生物先采到液體或其它介質(zhì)上，再轉(zhuǎn)種到培養(yǎng)基或細(xì)胞上顯示(如Porton采樣器,許欣,13,六、空氣樣本,按照流量的有效數(shù)字分，3位數(shù)以上為大流量(500 L/min)，23位數(shù)為中流量(499L/min11 L/min)，1位數(shù)為小流量(10L/min)。 按照采樣器所用介質(zhì)性質(zhì)又可分為固體及液體采樣器。 按采樣器的工作原理可分為六種：撞擊式、沉降式、過濾式、靜電吸附式、旋風(fēng)式和離心撞擊式采樣器,許欣,14,六、

7、空氣樣本,二）空氣中細(xì)菌等微生物采樣的介質(zhì) 采樣介質(zhì)(包括培養(yǎng)基)對細(xì)菌等微生物具有支撐、黏附、保護(hù)和生長作用。常用有凡士林、聚硅酮，氧化烯二十二烷酮(OED)和SGB(糖、甘油、牛血清白蛋白) （三）空氣中細(xì)菌等微生物采樣方法及送檢 1. 平板沉降法：參見醫(yī)院空氣采樣規(guī)定。 2. 空氣采樣器采樣：常用Andersen采樣器,許欣,15,第二節(jié) 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)檢查法,了解標(biāo)本中有無細(xì)菌及其大致的數(shù)量。 驗(yàn)證培養(yǎng)物是否為純種。 形態(tài)檢查結(jié)果可做初步診斷。 不染色檢查法和染色檢查法。 借助顯微鏡對形態(tài)、大小、排列、結(jié)構(gòu)的直接觀察,許欣,16,一、顯微鏡檢查,1、普通光學(xué)顯微鏡(light micr

8、oscope)：分辨率0.2m，用于細(xì)菌染色標(biāo)本的觀察。 2、暗視野顯微鏡(dark-field microscope)：具有暗視野聚光器，用于觀察不染色標(biāo)本活菌的形態(tài)、運(yùn)動(dòng)方式。 3、相差顯微鏡(phase contrast microscope)：具有環(huán)狀光柵聚光器和相差物鏡，既可觀察活體細(xì)胞的外形和運(yùn)動(dòng)方式，又能觀察其內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)及這些結(jié)構(gòu)的數(shù)量,許欣,17,二、不染色檢查,細(xì)菌的活體觀察，主要用于觀察動(dòng)力 懸滴法凹玻片 壓滴法平玻片,許欣,18,三、染色檢查,常用堿性染料（美藍(lán)、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、沙黃等） 單染色法，復(fù)染色法，特殊結(jié)構(gòu)染色法（鞭毛、芽孢、莢膜等），負(fù)染色法、熒光

9、染色法，革蘭染色法（結(jié)晶紫、碘液、95%酒精、堿性復(fù)紅），抗酸染色法（分枝桿菌、石炭酸復(fù)紅、美藍(lán),許欣,19,大腸桿菌革蘭染色陰性,許欣,20,金黃色葡萄球菌革蘭染色陽性,許欣,21,變形桿菌周身鞭毛,許欣,22,綠膿桿菌單鞭毛,許欣,23,肺炎鏈球菌莢膜,許欣,24,鉤端螺旋體,許欣,25,霍亂弧菌,許欣,26,破傷風(fēng)芽胞桿菌,許欣,27,第三節(jié) 細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法,所謂細(xì)菌的分離培養(yǎng)就是提供某細(xì)菌生長所需的各種條件（營養(yǎng)、溫度、濕度、酸堿度和氣體），將其從微生物混合物中培養(yǎng)出來的方法。 在細(xì)菌的分離培養(yǎng)過程中，必須采用無菌技術(shù)或稱無菌操作,許欣,28,許欣,29,一、培養(yǎng)基的制備,一）培養(yǎng)

10、基的種類： 1. 按用途分類 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：僅最基本的營養(yǎng)成分。 營養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上加入葡萄糖、血液、血清等。 增菌培養(yǎng)基：多為液體培養(yǎng)基，一般含有抑制劑，且是具有選擇性抑制作用的抑制劑。 選擇性培養(yǎng)基：多為固體培養(yǎng)基，加有抑制物質(zhì)，抑制其它非目的菌的生長或使其生長不佳。 鑒別培養(yǎng)基：主要供細(xì)菌生化反應(yīng)試驗(yàn)用。 專用培養(yǎng)基：適用于特定細(xì)菌的專門的培養(yǎng)基,許欣,30,一、培養(yǎng)基的制備,2. 按物理性狀分類 液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基（瓊脂含量0.30.8%） 固體培養(yǎng)基（瓊脂含量1.22.0%） 3. 按成分分類： 合成培養(yǎng)基：由化學(xué)物質(zhì)和成分已知的各種物質(zhì)所組成，可以是無機(jī)鹽類，或無機(jī)鹽類

11、加有機(jī)物質(zhì)。 天然培養(yǎng)基：化學(xué)成分不完全清楚，各批物質(zhì)的成分很難一致，如蛋白胨、牛肉膏、血液、雞蛋,許欣,31,一、培養(yǎng)基的制備,二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用 1. 營養(yǎng)物質(zhì)：碳源、氮源及其它營養(yǎng)物質(zhì)（蛋白胨、肉浸液、牛肉浸膏、糖類、血液、雞蛋、動(dòng)物血清、酵母粉、生長因子、無機(jī)鹽類）。 2. 水分：常用蒸餾水。 3. 凝固物質(zhì)：瓊脂 4. 抑制劑和指示劑：如膽鹽、抗生素、染料等,許欣,32,一、培養(yǎng)基的制備,3、制備培養(yǎng)基的一般程序 調(diào)配、矯正pH、過濾澄清、分裝、滅菌、檢定、保存七個(gè)步驟。 高壓蒸汽滅菌（121、115 ）、流動(dòng)蒸汽滅菌（100） 、血清凝固器滅菌（80） 、水浴低溫滅菌（5

12、6,許欣,33,二、細(xì)菌接種方法,二）細(xì)菌的接種方法 1. 平板劃線接種法（分離、鑒別 ） 2. 斜面接種法（純培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種 ） 3. 半固體培養(yǎng)基接種法（觀察動(dòng)力和保存菌種 ） 4. 液體培養(yǎng)基接種法 （富集培養(yǎng)、生化反應(yīng)等 ） 5. 平板涂布、傾注接種法（藥敏、活菌計(jì)數(shù)等,許欣,34,三、細(xì)菌的培養(yǎng)方法,1. 需氧培養(yǎng)法（常規(guī)培養(yǎng)） 2. CO2培養(yǎng)法 CO2孵箱法（CO2鋼瓶 ） 燭缸法（CO2含量約為510，氧氣約16% ） 化學(xué)法（如碳酸氫鈉-鹽酸法,許欣,35,三、細(xì)菌的培養(yǎng)方法,3. 厭氧培養(yǎng)法 液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)（凡士林、皰肉、還原劑等） 固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)（厭氧罐培養(yǎng)法，厭氧氣袋法

13、，厭氧培養(yǎng)箱法 ，氣體噴射培養(yǎng)法（或稱轉(zhuǎn)管法,許欣,36,四、細(xì)菌的生長現(xiàn)象,一） 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象 菌落形狀、大小、表面性狀、邊緣情況、顏色、透明度、質(zhì)地、粘度、乳化性。 血平板(溶血、溶血、雙環(huán)) 卵黃瓊脂(卵磷脂酶和脂酶：沉淀環(huán)和“珍珠包膜” ) 蛋白水解(清晰的環(huán)) 色素(水溶性，如綠膿色素、熒光色素等，脂溶性色素，如金黃色葡萄球菌的金黃色菌落,許欣,37,四、細(xì)菌的生長現(xiàn)象,氣味（假單胞菌屬：葡萄汁氣味；變形桿菌：巧克力燒焦的臭味；鏈球菌：霉臭；梭菌：糞臭、腐敗味；產(chǎn)黑色素類桿菌屬細(xì)菌：辛辣味） （二） 細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象 18h24h，包括：發(fā)育程度、渾濁度、

14、沉淀、液體表面性狀、其它（色素、氣味、產(chǎn)酸、氣體） （三） 細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象 動(dòng)力觀察,許欣,38,第四節(jié) 細(xì)菌的生化反應(yīng)檢查法,一、糖類代謝試驗(yàn) 1. 糖(醇)發(fā)酵試驗(yàn) 糖類是作為碳源和能量來源提供細(xì)菌合成菌體成分必需的原料，由于細(xì)菌各自具有不同的酶系統(tǒng)，故對糖(醇)類的分解能力不盡相同。 酚紅、溴麝香草酚藍(lán)、溴甲酚紫和酸性復(fù)紅等指示劑 液體、半固體、固體培養(yǎng)基 雙糖(或三糖)高層斜面,許欣,39,一、糖類代謝試驗(yàn),2. 甲基紅（MR）試驗(yàn) 分解葡萄糖丙酮酸乳酸、乙酸、甲酸 pH4.5以下加入甲基紅指示劑紅色。 3. 伏普(Voges-Proskauer)試驗(yàn)(V-P試驗(yàn)) 葡

15、萄糖代謝中性最終產(chǎn)物乙酰甲基甲醇。葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇堿性溶液空氣氧化二乙酰（丁二酮） 加入胍基（如肌酸或肌酐、-萘酚等） 紅色化合物,許欣,40,一、糖類代謝試驗(yàn),4. -半乳糖苷酶試驗(yàn) 結(jié)構(gòu)酶和適應(yīng)酶（誘導(dǎo)酶） 迅速，延遲，不發(fā)酵乳糖 發(fā)酵乳糖的大腸菌能產(chǎn)生乳糖滲透酶和-半乳糖苷酶 鄰-硝基苯-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)證明有無-半乳糖苷酶活性，可預(yù)測細(xì)菌發(fā)酵乳糖的能力。 菌懸液+ ONPG，無色的ONPG被水解，釋放出黃色化合物鄰-硝基苯酚(ONP,許欣,41,二、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn),1. 靛基質(zhì)(吲哚)試驗(yàn) 細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可與試劑中的二甲氨基苯甲醛作

16、用，生成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 2. 硫化氫試驗(yàn) 某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可與加入培養(yǎng)基中的鉛或鐵離子生成黑色硫化物,許欣,42,二、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn),3. 尿素酶試驗(yàn) 有些細(xì)菌(如某些變形桿菌)具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨，使培養(yǎng)基pH上升，而變成堿性，使含有酚紅指示劑的培養(yǎng)基變成紅色。 4. 明膠液化試驗(yàn) 某些細(xì)菌產(chǎn)生明膠酶可使明膠分解，失去凝固力，使其由半固體轉(zhuǎn)化為液體狀態(tài),許欣,43,三、有機(jī)酸鹽和銨鹽利用試驗(yàn),1. 檸檬酸鹽利用試驗(yàn) 有些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源，能在除檸檬酸鹽外不含其它碳源的培養(yǎng)基上生長，分解檸檬酸鹽，生成碳酸鈉

17、，使培養(yǎng)基變成堿性。 2. 馬尿酸鈉水解試驗(yàn) B群鏈球菌具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸。苯甲酸與三氯化鐵結(jié)合而沉淀或甘氨酸與茚三酮作用生成紫色化合物,許欣,44,三、有機(jī)酸鹽和銨鹽利用試驗(yàn),3. 丙二酸鹽利用試驗(yàn) 某些細(xì)菌利用丙二酸鹽作為唯一碳源時(shí)，丙二酸鈉可被分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性,許欣,45,四、酶類試驗(yàn),1. 氧化酶試驗(yàn)（Kovacs試驗(yàn)） 氧化酶（又稱細(xì)胞色素氧化酶）是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，能使還原型的細(xì)胞色素C氧化成氧化型的細(xì)胞色素C，氧化型細(xì)胞色素C又使對苯二胺氧化，生成紅色的醌類化合物。 2. 過氧化氫酶試驗(yàn)（觸酶試驗(yàn)） 過氧化氫酶又稱觸酶，可

18、使細(xì)菌代謝過程中的過氧化氫分解為水和氧,許欣,46,四、酶類試驗(yàn),3. 硝酸鹽還原試驗(yàn) 某些革蘭氏陰性桿菌在代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽亞硝酸鹽+醋酸亞硝酸+對氨基苯磺酸重氮苯磺酸+-萘胺紅色的N-萘胺偶氮苯磺酸。 4. 過氧化物酶試驗(yàn) 過氧化物酶的作用是將過氧化氫中氧轉(zhuǎn)移給可被氧化的物質(zhì)。以聯(lián)苯胺作為被氧化的物質(zhì)，如為過氧化物酶陽性細(xì)菌，加入過氧化氫可使聯(lián)苯胺氧化成為藍(lán)色,許欣,47,第五節(jié) 細(xì)菌的血清學(xué)檢驗(yàn),血清學(xué)鑒定（serological identity） 已知診斷血清鑒定分離的細(xì)菌 血清學(xué)診斷（Serological diagnosis） 已知標(biāo)準(zhǔn)菌株測抗體，4倍上升 （一）凝

19、集試驗(yàn)（Agglutination test） 玻片法和試管法 （二）沉淀試驗(yàn)（precipitation test） 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)，絮狀沉淀試驗(yàn)，凝膠中沉淀試驗(yàn),許欣,48,第六節(jié) 細(xì)菌毒素的檢測,一、外毒素 主要來自G+菌，蛋白質(zhì)，不耐熱，抗原性強(qiáng)，選擇毒性 抗體與濾液反應(yīng)；已知細(xì)菌外毒素與患者血清反應(yīng)；動(dòng)物試驗(yàn)(如破傷風(fēng)痙攣毒素) 1. 白喉外毒素(diphtheria exotoxin) ：Elek平板、動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 2. 肉毒毒素(botulinic toxin)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、中和試驗(yàn),許欣,49,二、內(nèi)毒素,主要來自G-菌，LPS，耐熱，抗原性弱，普遍毒性 1. 家兔熱原試驗(yàn)（rabbit pyrogen test，RT） 2. 鱟試驗(yàn)（limulus test，LT） 3. 其它試驗(yàn)（免疫學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)發(fā)光、流式細(xì)胞術(shù)、高效液相等,許欣,50,第七節(jié) 細(xì)菌數(shù)量的測定,一、物理計(jì)數(shù)法 1. Breed計(jì)數(shù)法：100mm2區(qū)域，0.01ml涂片，亞甲蘭染色，油鏡視野（0.02mm2） 2. 比濁管計(jì)數(shù)法：BaSO4系列標(biāo)準(zhǔn)管 3. 分光光度計(jì)測定法：標(biāo)準(zhǔn)曲線,許欣,51,二、生物計(jì)數(shù)法,1. 半定量計(jì)數(shù)法(接種環(huán)0.01ml或0.001ml，平