固相微萃取與頂空進樣技術(shù)在食品分析中的應(yīng)用.PPT

1、1,固相微萃取與頂空進樣技術(shù) 在食品分析中的應(yīng)用 胡國棟 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,2,食品分析的目標 理化與感官質(zhì)量的檢驗 與品質(zhì)相關(guān)的特征組分分析 與安全相關(guān)的衛(wèi)生質(zhì)量的監(jiān)測,3,食品樣品傳統(tǒng)制備方法的復(fù)雜性 傳統(tǒng)的制備方法：液-液萃取、索氏萃取、蒸餾等 步驟多、耗時長、可靠性差，大量耗費有機溶劑， 環(huán)境污染嚴重 探尋更為簡捷、有效的食品樣品制備方法是分析 化學(xué)面臨的任務(wù),4,食品樣品處理的新技術(shù),無溶劑（或少溶劑）的處理技術(shù)已成為食品樣 品制備的主要發(fā)展方向，目前比較成熟的技術(shù) 包括： 以吸附劑萃取為基礎(chǔ)的 固相萃取(SPE)、 固相微萃取(SPME)； 以氣體萃取為基礎(chǔ)的 頂空分析(HS

2、)， 包括靜態(tài)頂空(Static Headspace)與動態(tài)頂空(Dynamic Headspace)； 超臨界流體萃取等,5,固相微萃取技術(shù)”的由來,固相微萃取技術(shù)（solid-phase microextraction, SPME）是1990 年由加拿大學(xué)者Pawliszyn 和他的 合作者首創(chuàng)，并于近10余年間迅速 發(fā)展和完善的樣品制備新技術(shù),6,SPME的原理,SPME是依據(jù)有機化合物能吸附在 涂于石英細絲表面的色譜固定相 上，且被吸附的分析物在GC的進 樣口遇熱可定量解吸的原理而設(shè)計 的技術(shù) 。依據(jù)類似的原理，HPLC 流動相將分析物沖洗到液相色譜柱 中，SPME也可用于HPLC分析

3、,7,SPME的三種不同萃取方式,纖維針式固相微萃?。‵iber SPME） 這是最常用的供GC分析進樣的SPME萃取方式 管內(nèi)固相微萃取（In-tube SPME） 富集倍數(shù)有所提高，主要供HPLC分析 攪拌棒吸附萃取（SBSE） 富集倍數(shù)大大超過前兩種方式，適合痕量組分分析，由德國Gerstel公司實現(xiàn)商品化,8,SPME的裝置,主要由萃取頭（Fiber）和手柄（Holder）兩部分組成，其狀形同一支色譜注射器，萃取頭是一根長度僅為1cm的熔融石英絲，其表面涂有厚膜的色譜固定相或吸附劑,9,由Supelco公司設(shè)計的SPME裝置,10,供GC進樣的SPME裝置示意圖,11,固相微萃取技術(shù)的

4、特點 摒棄了傳統(tǒng)的溶劑，并將萃取、濃縮、解吸 、進樣集于一體 高靈敏度，通常LOD可達ppb或ppt 將分析對象從揮發(fā)性物質(zhì)延伸到難揮發(fā)物質(zhì) 操作簡單、費用低,12,SPME定量對測定條件的要求,萃取頭的極性和涂層厚度，取樣方式（頂空或浸入），樣品pH值和加鹽量，樣品恒溫溫度和萃取時間，攪拌狀況，樣品瓶中溶液與頂空的體積比例，乃至取樣時萃取頭與液面的距離等參數(shù)均需通過實驗確定，并在以后的測定中嚴格保持一致，方可獲得重復(fù)的測定結(jié)果,13,各類商品萃取頭的性能比較,14,萃取頭的選擇,SPME與其它萃取方法一樣，同樣遵循“相似相溶”的原則，如同毛細管色譜柱的選擇，沒有一種萃取頭能萃取所有的化合物。

5、涂層的極性與厚度必須與分析物的性質(zhì)匹配，極性較強的涂層（如PA萃取頭）適合萃取極性化合物，而非極性的 PDMS萃取頭則主要用于非極性化合物的萃取。 萃取頭涂層對于分析物要有較強的萃取能力，能在較短時間內(nèi)達到吸附平衡，熱解吸時分析物能迅速從萃取頭上解吸，由于解吸通常在高溫下進行，因此，所選萃取頭必須有良好的熱穩(wěn)定性,15,攪拌棒吸附萃取,攪拌棒吸附萃取（SBSE)是1999年出現(xiàn)的一種新型的固相微萃取方法。在萃取過程中，外面涂有聚二甲基硅氧烷涂層的攪拌子在水相基質(zhì)中不斷吸附低濃度的分析物 ，從而起到濃縮作用。 SBSE與傳統(tǒng)的SPME方法相比，靈敏度可以提高12個數(shù)量級。德國Gerstel公司推

6、出了商品化的攪拌棒“Twister”，已經(jīng)在眾多的分析研究中得到了應(yīng)用,16,攪拌棒吸附萃取的特點,SBSE萃取相的體積通常為55-250L，比纖維針式固相微萃取（Fiber SPME）的萃取相體積0.5-1L和管內(nèi)固相微萃?。↖n-tube SPME）的2-20L大得多，相應(yīng)提高了富集倍數(shù)，因此更適合于樣品中痕量組分的分析。但由于它需要專用的熱脫附裝置，同時，為了避免組分峰在色譜柱上的擴寬，還需要柱頭的冷聚焦裝置，因此裝置比較貴，操作也比較復(fù)雜,17,固相微萃取在食品風(fēng)味 質(zhì)量控制分析中的應(yīng)用 水果和果汁的分析 新鮮原料的香味組成，加工過程及儲存 后的變化 酒類的微量香味組分分析 采用HSS

7、PME分析 油脂氧化變質(zhì)后產(chǎn)生的不良風(fēng)味分析 變質(zhì)玉米油采用HSSPME分析,18,果汁香味組分的SPME分析譜圖,19,采用SPME定量分析啤酒樣品的典型色譜圖,1.乙醛, 2.乙酸乙酯, 3.乙酸異丁酯, 4.正丙醇, 5.異丁醇, 6.乙酸異戊酯, 7. 4-甲基-2-戊醇（內(nèi)標）, 8.異戊醇, 9.己酸乙酯, 10.辛酸乙酯, 11.乙酸, 12.里哪醇, 13癸酸乙酯, 14.異戊酸, 15.乙酸苯乙酯, 16.己酸, 17.-苯乙醇, 18.辛酸, 19.癸酸 引自 胡國棟等， 第十四次全國色譜學(xué)術(shù)報告會文集，無錫，2003.482-484,20,2003年，我們再度優(yōu)化了各種操

8、作條件，以GC/MS和GC獲得了啤酒41種香味 化合物確切定性結(jié)果,它包括14種酯類、12種醇類、8種酸類、3種醛類、2種酚類、1種含硫化合物和1種含氧雜環(huán)化合物,酯類：乙酸乙酯，乙酸異丁酯，乙酸異戊酯，己酸乙酯，乙 酸己酯，乳酸乙 酯，辛酸乙酯，乙酸辛酯，癸酸乙酯，苯乙酸乙酯，乙酸苯乙酯，月桂酸乙 酯，丁酸-苯乙酯，鄰苯二甲酸二異丁酯 醇類：正丙醇，異丁醇，異戊醇，正己醇，2-乙基-1-己醇，里哪醇， 正辛醇，糠醇，-萜品醇，香茅醇，-苯乙醇，月桂醇 酸類：乙酸，異丁酸，異戊酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸， 2-乙基己酸 醛類：乙醛，癸醛，糠醛 酚類：苯酚，4-乙烯基愈瘡木酚 含硫化合物： 3

9、-甲硫基-1-丙醇 含氧雜環(huán)化合物：二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮 引自 胡國棟等 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2004，30（2）：1-5,21,采用SPME測定啤酒中含量為ppb量級的酒花香組分,啤酒中酒花香組分 （上）總離子流圖 （下）選擇離子流圖 1.里哪醇；2.萜品烯-4-醇（內(nèi)標）；3.乙酸香茅酯；4.香葉酸甲酯；5.-萜品醇；6.乙酸香葉酯 7.-香茅醇；8.香葉醇；9.反式-橙花叔醇 引自 王憬等， 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007，33(8):128,22,HS-SPME在葡萄酒風(fēng)味分析中的應(yīng)用,23,HS-SPME在蘋果酒風(fēng)味分析中的應(yīng)用,24,采用SPME分析蘋果的香氣組分,25,分

10、析蘋果香氣的相應(yīng)測定條件（續(xù),26,通過SPME測定監(jiān)控牛奶的風(fēng)味變化,27,牛奶的HS-SPME-GC/MS分析條件,28,SPME測定殺菌方式引起的牛奶揮發(fā)性組分的變化,29,SPME測定殺菌方式引起的 牛奶揮發(fā)性組分的變化（續(xù),30,主成分分析法（PCA）處理從SPME分析所獲數(shù)據(jù),PA、PB Pasteurized milk UHT A、UHT B UHT milk Group 2,3 Samples submitted to the highest level of heat and pressure Treatment 引自 J Agric Food Chem,2006,54(24

11、) : 9190,31,Cheese的SPME分析,32,變質(zhì)的玉米油SPME分析譜圖,33,固相微萃取在食品安全監(jiān)測中的應(yīng)用,從1994年首次將SPME應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的分析起，已有十余年的經(jīng)歷。目前，應(yīng)用固相微萃取作殘留分析的農(nóng)藥主要是各類殺蟲劑，包括有機氯、有機磷及氨基甲酸酯等，也可用于少數(shù)除草劑的檢測。 樣品的對象以液體最為適合，如水樣和各種酒類，隨著微波輔助萃取與固相微萃取的結(jié)合使用，使這一技術(shù)也可用于復(fù)雜基質(zhì)的固體樣品 的測定,34,SPME測定葡萄酒中的有機磷、有機氯農(nóng)藥殘留,35,SPME測定葡萄酒中的有機磷、有機氯農(nóng)藥殘留（續(xù),方法要點：100PDMS萃取頭，于45、3mL酒液

12、中，浸入式萃取30min,請見Journal of Chromatography A 2000，889(1-2):59-67,36,MAE-SPME-GC測定茶葉中的有機氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留,37,紅葡萄酒中有機磷農(nóng)藥的檢測,38,草莓農(nóng)藥殘留的SPME分析譜圖,39,采用SPME作定量分析時必須注意的問題,固相微萃取不同于傳統(tǒng)的液體進樣方法，它對不同化合物的萃取率差異非常大，有時不同碳數(shù)的同類化合物能相差許多倍，至于不同類別的化合物，校正因子的差異更大到23個數(shù)量級，因此，組分的定量測定切不可以采取面積歸一化方法，而必須采用標樣作校正。 當(dāng)然在作方法條件試驗時，作為方法的相對比較，歸一化法

13、還是可以用的,40,采用SPME作定量分析時必須注意的問題（續(xù),以啤酒的香味組分分析為例，采用PA萃取頭，以啤酒 基質(zhì)通過添加標樣的方式并以內(nèi)標法測定組分的校正 因子，其相互之間的差別非常大： 若以乙酸乙酯為1，則己酸乙酯為118，辛酸乙酯為 469，癸酸乙酯的靈敏度最高，達530，而在同一條 件下，乙酸僅為0.05。盡管這一差別隨萃取頭及萃取 條件而異，但國外文獻提供的回歸方程都可說明這一 點。國內(nèi)的一些研究者常常簡單地以“峰面積歸一化” 結(jié)果作為“含量”報告，這是SPME定量測定中極待注意 的問題,41,采用SPME作定量分析時必須注意的問題（續(xù)2,左表引自Am J Enol Vitic,

14、2005,56(1):37-45 作者以乙醇水溶液為基質(zhì)通過添加標樣的方式測定組分的校正 因子，其相互之間的差別與我們測定的啤酒情況類似： 若以乙酸乙酯為1，則丁酸乙酯為18、己酸乙酯為183、辛酸乙酯為463， 癸酸乙酯的靈敏度稍低，為232,42,小 結(jié),SPME是近10余年間迅速發(fā)展和完善的樣品制備新技術(shù)，它將萃取、濃縮、進樣集于一體，靈敏度高且操作簡便。 SPME在食品分析中的成功應(yīng)用為產(chǎn)品的質(zhì)量控制分析技術(shù)向深層目標發(fā)展奠定了技術(shù)基礎(chǔ) 。本文介紹的國內(nèi)外應(yīng)用示例表明，它的應(yīng)用前景十分廣闊。 SPME用于復(fù)雜產(chǎn)物的定性研究時，與其它提取方法相比具有明顯優(yōu)勢。但由于組分的色譜峰面積受樣品

15、基質(zhì)的影響特別嚴重，因此，定量測定時必須采用標樣作校正，并且盡量選擇合適的內(nèi)標物，采用內(nèi)標法定量。切忌簡單地以峰面積歸一化結(jié)果表述為“定量結(jié)果,43,頂空氣相色譜法的概述 頂空氣相色譜法（HS-GC）是一種以分析置于密閉容器中樣品上方的蒸氣組成為基礎(chǔ)的氣相色譜分析法,44,頂空氣相色譜法適合于分析樣品中較易揮發(fā)的組分。對于含固型物較多的液體樣品或固體樣品，由于其不能直接進樣進行氣相色譜分析，而采用頂空氣相色譜法則是操作簡便、快速分析樣品中較易揮發(fā)的組分的一種好方法，因此，頂空氣相色譜法在環(huán)保、藥物、石化等領(lǐng)域成為重要的分析手段，在食品分析方面也得到了廣泛的應(yīng)用,頂空氣相色譜法的應(yīng)用對象,45,

16、頂空氣相色譜法分為靜態(tài)法和 動態(tài)法（又名吹掃捕集法） 靜態(tài)頂空進樣法(Static Headspace) 置于密閉容器中的樣品在一定的溫度下與其上方的蒸氣達到平衡后，采用適當(dāng)?shù)姆椒ǔ槿№斂諝庖怨庀嗌V分析,46,按照進樣方式的不同，靜態(tài)頂空進樣 可以分為： 手動進樣（采用氣密性注射器進樣）與 自動進樣（采用與GC相連的專用儀器進 樣,靜態(tài)頂空氣相色譜的進樣方式,47,手動進樣的靜態(tài)頂空氣相色譜,采用手動進樣的靜態(tài)頂空色譜裝置比較簡單，只要有一臺控溫精確的恒溫水浴和氣密性注射器就可以試驗。但由于壓力控制難以實現(xiàn)，又受到取樣與進樣過程中溫度變化等一系列可變因素的制約，分析的重現(xiàn)性無法與自動進樣裝

17、置相比，只適合作定性試驗不宜用作定量測定,48,自動進樣的靜態(tài)頂空氣相色譜,目前，商品化的自動頂空進樣裝置大致有以下三種類型： 壓力控制定量環(huán)進樣方式，如Agilent 7694E, G1888A等。 壓力平衡進樣方式，如Perkin Elmer公司的TurboMatrix 40等。 注射器進樣方式，如瑞士CTC公司的氣相色譜自動進樣器 Combi PAL等,49,PE TurboMatrix 40 with Clarus 500 GC,50,PE TurboMatrix 40 工作原理,51,Agilent G1888 with 6890 GC,52,Agilent G1888 工作原理,53,采用自動靜態(tài)頂空進樣法分析啤酒的色譜圖 1 乙醛 2 二甲基硫 3 異丁醛 4 甲酸乙酯 5 乙酸乙酯 6 甲醇 7 異戊醛 8 乙酸異丁酯 9 丁酸乙酯 10 正丙醇 11 異丁醇 12 乙酸異戊酯 13 正丁醇 （內(nèi)標） 14 異戊醇 15 己酸乙酯 16 辛酸乙