脂肪組織細(xì)胞中特異性敲除Nrf2對代謝影響的研究

1、脂肪組織細(xì)胞中特異性敲除 Nrf2 對代謝影響的研究第一部分ASANJ、鼠脂肪組織中Nf2對糖脂及能量代謝影響的研 究目的脂肪組織 (adipose tissue,AT) 分為白色脂肪組織 (white adipose tissue,WAT) 和棕色脂肪組織 (brown adipose tissue,BAT) 。 WAT主要分為皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue,SAT) 和 臟器脂肪組織 (visceral adipose tissue,VAT) 兩大類。近年來的研 究表明 , 脂肪組織的大量堆積與血管衰老、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生以及 人體內(nèi)的糖脂和能量代謝有

2、著密切的聯(lián)系。 人體衰老通常伴隨著體脂 的再分配 , 但在該過程中 ,AT 具體轉(zhuǎn)化的研究尚待深入。脂肪組織與 氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系 , 在氧化應(yīng)激致衰老的理論體系中 ,nuclear factor erythroid-2-related factor(Nrf2) 起著核心的作用。同時(shí) , 大量的研究也表明 ,Nrf2 在糖脂和能量代謝中也發(fā)揮著重要作用。而 肝臟是糖脂代謝的主要靶點(diǎn) , 同時(shí)肝細(xì)胞在維持血糖穩(wěn)態(tài)中起著重要 作用。因此, 本研究旨在探討 Nrf2 及其調(diào)控的下游抗氧化應(yīng)激分子在 敲除Nf2的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中 WAT向 BAT的轉(zhuǎn)化及抵抗衰老，和對糖 脂及能量代謝相關(guān)因子表達(dá)作

3、用的研究。方法選取兩個(gè)半月齡的 NF 小鼠作為對照組和ASAN脂肪細(xì)胞中特異性敲除Nf2)小鼠作為實(shí)驗(yàn) 組各 8 只, 同時(shí)給予高脂飲食喂養(yǎng)。 四個(gè)月后 , 于處死前一天進(jìn)行 8 小 時(shí)的饑餓處理 , 對小鼠進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量測定實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT),時(shí)間點(diǎn)為(Oh,1/2h,1h,2h); 之后采取頸椎脫臼的方法處死小鼠 , 分別提取兩組 小鼠體內(nèi)的VAT SAT和肝臟組織,使用Western-blot及qPCR等技術(shù) 檢測小鼠脂肪組織內(nèi)：1,BAT標(biāo)記基因(PGC-1a ,PRDM16,Dio2)的表達(dá);2, 線粒

4、體的生成 (UCP1,Cycs);3,WAT 標(biāo)記基因(Bmp4,Rb1,Resistin) 的表達(dá) ;4,FGF21 相關(guān)的代謝信號(hào)通路相關(guān)因子(FGF21,AMPa、Sirtl、PGC-仏和 UCP1的表達(dá)；另一方面，使用Western-blot和qPCR的方法等技術(shù)檢測兩組小鼠肝臟組織中：1,內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(p-EIF2 a和EIF-2 a等)和總炎癥狀態(tài)相關(guān)的因子(IL- B、TNF-a、NF-kB p-p65、MMP和 MMP9)勺表達(dá);2,糖代謝相關(guān)蛋白的 表達(dá)情況(Giut-4、IGF-1R、FOXO、p-AKT 和 p-GSK3a / B )。結(jié)果 與NF小鼠相比,ASAN轉(zhuǎn)基因

5、小鼠的血糖升高，且ASANJ、鼠的AT 中:1,BAT的標(biāo)記基因PGC-仏，PRDM16和 Dio2等表達(dá)增加(P<0.05);2,線粒體生成基因，UCP1和Cycs的表達(dá)顯著增加(P<0.05);3,WAT 標(biāo)記基因：Rb1,Bmp4和 Resistin 的表達(dá)降低;4,UCP1和Sirt1參與的長壽基因信號(hào)通路的表達(dá)增加;5,FGF21相 關(guān)的代謝信號(hào)通路相關(guān)因子(FGF21、p-AMPKc、Sirt1、PGC-仏和UCP1等表達(dá)增加。同時(shí)，與NF小鼠相比,ASAN轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織 中:1,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子(p-EIF2 a )和總炎癥狀態(tài)相關(guān)因子(IL- B、TNF-a和

6、p-NF-kB)的表達(dá)降低;2,糖代謝相關(guān)蛋白(Giut-4、IGF-1R、FOXO1 p-AKT和p-GSK3a / p )表達(dá)降低。結(jié)論在特異性敲除 Nf2的ASAN轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,Nrf2參與了 WAT向 BAT的轉(zhuǎn)化及抵抗衰 老，同時(shí)抑制FGF21信號(hào)通路的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)糖脂及能量代謝。第二 部分3T3L1細(xì)胞和AML12細(xì)胞中特異性沉默Nf2對代謝影響的研究 目的從細(xì)胞水平探討在3T3-L1前脂肪細(xì)胞和AML12細(xì)胞中特異性沉默 Nrf2 對脂肪轉(zhuǎn)化相關(guān)的影響和糖脂及能量代謝相關(guān)因子的表達(dá)情 況研究。方法培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，通過誘導(dǎo)使其轉(zhuǎn)化成脂肪細(xì) 胞；使用Nf2的siRN

7、A感染上述脂肪細(xì)胞，獲得細(xì)胞內(nèi)Nf2被敲除的 脂肪細(xì)胞。在上述脂肪細(xì)胞內(nèi)檢測因 Nrf2 表達(dá)水平的變化而引起的 改變:1、應(yīng)用 Western-blot和qPCF技術(shù)檢測 WAT BAT線粒體生 成等標(biāo)記基因的表達(dá)水平的變化，以及UCP和Sirt1參與的長壽基因 信號(hào)通路 ；2 、應(yīng)用葡萄糖檢測試劑盒檢測脂肪細(xì)胞對葡萄糖攝取能力 的變化。同時(shí)培養(yǎng)AML12細(xì)胞，使用Nf2的siRNA感染上述細(xì)胞， 獲得細(xì)胞內(nèi)Nf2被敲除的AML12細(xì)胞。利用葡萄糖攝取試劑盒檢測， 沉默 Nrf2 后細(xì)胞對葡萄萄攝取能力的改變。 另外給予高糖 (33mmol/L) 對AML12細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，分為對照+低糖組(

8、Control+ LowGlucose,Con + LG), 對照 +高糖組 (Control + High Glucose,Con+HG),Nrf2-Knock down + 低糖組 (Nrf2-Knock down + Low Glucose,NK + LG),Nrf2-Knock down + 高糖組 (Nrf2-Knock down + High Glucose,NK + HG)。通過 Western-blot和 qPCF的方法來檢測：1,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子(P-EIF2 a、EIF-2 a、HO-1和 NQO1的表達(dá);2,總炎癥狀態(tài)相關(guān)的因子(IL- B、TNF-a、NF-k

9、B、p-p65、 MMP和 MMP9)勺表達(dá)；3,FGF21相關(guān)的代謝信號(hào)通路相關(guān)因子 (FGF21,AMPa、Sirtl、PGC-仏和UCP1)的表達(dá);4,糖代謝相關(guān)蛋 白(Giut-4、IGF-1R、F0XO1 p-AKT和 p-GSK3a / B )的表達(dá)情況。結(jié) 果在脂肪細(xì)胞中，與對照組相比,Nrf2沉默組,Nrf2的mRNA口蛋白 水平分別降低約90呀口 75%,Nrf2下游抗氧化酶NQO和HO1表達(dá)也顯 著下降；同時(shí):1,BAT的標(biāo)記基因PGC-1a,Dio2和PRDM1等的表達(dá)升高(P<0.05);2,線粒體生成基因,UCP1和Cycs的表達(dá)顯著增加;3,WAT表達(dá)的標(biāo)記基

10、因，Rb1,Bmp 4和Resist in表達(dá)降低;4,參與的 長壽基因信號(hào)通路的AMPK ,Sirt1和PGC-仏的表達(dá)均增加。同時(shí)， 在Nf2沉默組，葡萄糖吸收也增加。在 AML12細(xì)胞中，與對照組相 比,Nrf2沉默組,Nrf2的mRN水平和蛋白水平分別降低約 90呀口 70%,Nf2下游抗氧化酶NQO和 HO1表達(dá)也顯著降低；同時(shí),1、內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子(p-EIF2 a )表達(dá)增加和抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子(HO-1和 NQO等)表達(dá)降低;2、總炎癥狀態(tài)相關(guān)的因子(IL- (3、TNF-a、NF-kB、 p-p65、MMP2和 MMP9表達(dá)增加;3、FGF21相關(guān)的代謝信號(hào)通路相關(guān) 因子(FGF21,AMPa、Sirtl、PGC-仏和 UCP1等)表達(dá)增加;4、糖代 謝相關(guān)蛋白 (Giut-4 、 IGF-1R、 FOXO、1 p-AKT 和 p-GSK3a / 3 ) 的表 達(dá)降低。 5、葡萄糖攝取能力明顯增加。結(jié)論在離體條件下的脂