RNA含量的測定—紫外吸收法

1、RNA含量的測定一紫外吸收法一、目的1、 掌握利用紫外吸光法測定RNA含量的原理和方法2、了解紫外分光光度計(jì)的使用原理。二、原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng) (-C = C 一C = C 一)，能夠強(qiáng)烈吸收 25028Onm 波長的紫外光。核酸(DNA , RNA)的最大紫外吸收 值在260nm 處。遵照Lambert-Beer定律，可以從紫外光吸收值的變化來測定核酸物質(zhì)的 含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差異，它們的摩爾消光系數(shù)也隨之不同。所以，在測定核酸物質(zhì)時(shí)均應(yīng)在固定的pH溶液中進(jìn)行。三、材料1、干

2、酵母粉(市售)。2、 0.2氫氧化鈉溶液，2gNaoH溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。3、標(biāo)準(zhǔn) RNA溶液：100 卩 g/mL。4、95滋性乙醇和無水乙醇。5、分析天平&紫外分光光度計(jì)7、離心機(jī)和離心管8、燒杯(10mL)錐形瓶和玻璃棒9、容量瓶(100mL)10、移液管(5mL)和移液槍11、試管和試管架。四、操作1、RNA的提取置4g干酵母粉于200ml錐形瓶中，加入 0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加熱 30分鐘， 經(jīng)常攪拌，后流水冷卻，4000r/min，離心15分鐘，留上清夜加入 95%酸性乙醇40mL,邊加邊攪拌，后靜置 5-10分鐘，再4000r/min離心5分鐘，保留沉淀

3、，再每次用10mL95%!醇洗滌沉淀，3000r/min，離心5分鐘，洗滌兩次，再用無水乙醇洗滌兩次，每次3000r/min離心5分鐘，收集沉淀于濾紙上，沉淀即為粗RNA晾干后測定 RNA的濃度。2、樣品處理稱取0.2 0.25g粗品RNA，加入2ml0.2%的NaOH溶液，和1ml出0溶解，調(diào)成糊狀， 再加入4050ml出0溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0，然后定容至100ml。(再取2ml定容至100ml 待測)3、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與樣品測定配制標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液梯度，取11支試管，洗干凈后，標(biāo)號為 0、1、2、3、4、5、6、7、A、B、C按下表，測定其 Abs值，做出工作曲線試管01234567ABC標(biāo)

4、準(zhǔn)RNA 液(g/ ml)05101520253035粗品RNA(ml)666五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、列表表2酵母RNA樣品溶液吸光度測定結(jié)果試管01234567ABCAbs值00.1280.2260.3180.4190.5370.6220.7100.5230.5170.5182、標(biāo)準(zhǔn)RNA曲線的繪制Si t光度-RMA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(2011.3.16)由吸光度-RNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線可得，RNA樣品溶液濃度為：C=25卩g/mL因此可求出 RNA樣品溶液中RNA的含量為：id = 25 x 50 X 100 = 0.125 (g)則RNA樣品的純度為：0.125 、 X 100腑=49.62%0.251

5、9則干酵母粉中RNA的比例為：0.125p =100%= 3.13%六、實(shí)驗(yàn)分析1、樣品中RNA含量較低，可能原因如下：1) 粗制的RNA在空氣下長時(shí)間放置，性質(zhì)改變.RNA放2) 實(shí)驗(yàn)環(huán)境較差，人體唾液中含有RNA酶，飛濺到RNA上，RNA降解一部分。3) 在RNA的提取過程中，對 RNA粗品的沖洗次數(shù)較少，導(dǎo)致其遺留雜質(zhì)較多。標(biāo)準(zhǔn)置時(shí)間較長，物理性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致其吸光度變小。故標(biāo)準(zhǔn)曲線較理論的曲線 y 值偏小。 故最終標(biāo)準(zhǔn)曲線上面所反映的樣品RNA 濃度偏大。2、測定RNA含量的幾種方法及其比較（1）定磷法： 磷的測定方法很多， Fiske-Subbarow 定磷法是一經(jīng)典的但至今仍被經(jīng)

6、常采用 的方法，它具有靈敏、簡便的特點(diǎn)。 各種含磷有機(jī)物經(jīng)硫酸或過氯酸水解， 使有機(jī)磷消化成 為無機(jī)磷。 無機(jī)磷在酸性條件下，與鉬酸鹽（常用鉬酸銨或鉬酸鈉）反應(yīng)生成磷鉬酸鹽絡(luò)合 物。用還原劑處理，磷鉬酸鹽絡(luò)合物被還原生成鉬藍(lán)，在 660nm 處有最大光吸收峰。在一 定濃度范圍內(nèi)， 顏色的深淺與磷含量成正比關(guān)系。 因此可應(yīng)用分光光度法進(jìn)行磷的定量測定。核酸是一類含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般純的RNA 及其核苷酸含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.0%; DNA及其核苷酸含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.2%，即每100g核酸含有9.09.2g磷,也就是核酸量是含磷量的 11 倍左右，故測得磷的量，即可求得核酸量。這就

7、是定磷法的理 論依據(jù)，磷的定量測定是測定核酸含量常用手段之一。生物有機(jī)磷材料中有時(shí)含有無機(jī)磷雜質(zhì)，故用定磷法來測定該有機(jī)磷物質(zhì)的量時(shí)，必 須分別測定該樣品的總磷量， 即樣品經(jīng)過消化以后所測得的含磷量， 以及該樣品的無機(jī)磷含 量，即樣品未經(jīng)消化直接測得的含磷量。將總磷量減去無機(jī)磷才是該有機(jī)磷物質(zhì)的含磷量。（2）地衣酚法（苔黑酚法）： RNA 含量測定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法測定。其反應(yīng)原理是：當(dāng) RNA 與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠 醛，后者與 3， 5-二羥基甲苯（地衣酚或 苔黑酚， orcinol ）反應(yīng)，在 Fe 3+或 Cu 2+催化下，生 成鮮綠色復(fù)合物。反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有最大吸收。RNA濃度在20250卩g m范圍內(nèi)，光吸收與 RNA 濃度成正比。 地衣酚法特異性差， 凡戊糖均有此反應(yīng)， DNA 和其他雜質(zhì)也能 與地衣酚反應(yīng)產(chǎn)生類似顏色。因此，測定 PNA 時(shí)可先測得 DNA 含量再計(jì)算 RNA 含量；（3） 二苯胺法：DNA分子中的脫氧核糖基，在酸性溶液中變成羥基-y酮基戊醛，與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595nm處有最大吸收。DNA在40 400微克范圍內(nèi)，光密度與 DNA 的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。除DNA外，脫氧木糖，阿拉伯糖也有同樣反應(yīng)。其它多