玉米WRKY轉錄因子Ⅱd亞族抗逆相關基因的鑒定及ZmWRKY17的功能分析

1、玉米 WRKY轉錄因子 d 亞族抗逆相關基因的鑒定及ZmWRKY17的功能分析玉米是世界范圍內重要的糧食作物之一, 是公認的黃金食物。但是其生長發(fā)育和產量品質受到干旱、 鹽漬等非生物脅迫的嚴重影響, 挖掘抗逆相關基因 , 研究其逆境應答機制 , 培育抗逆性較強的玉米新品種是應對逆境脅迫, 提高玉米產量的最有效途徑。近些年的研究表明 , 轉錄因子在植物的生長發(fā)育及脅迫應答方面起著非常重要的作用。過量表達一個特定的轉錄因子能夠調控下游多個抗逆相關基因的表達,從而達到對作物進行綜合改良的效果。WRKY蛋白家族是目前研究比較熱門的逆境相關轉錄因子家族之一, 其家族成員尤其是 d 亞族成員廣泛參與了植物

2、對各種脅迫的應答反應、生長發(fā)育、代謝調控等一系列生理活動。本研究首先對玉米中d 亞族 WRKY基因的誘導表達模式、轉錄活性、以及鈣調素結合特性等分子特征進行了系統(tǒng)分析。從玉米中克隆了脅迫相關關鍵基因ZmWRKY17,通過過量表達技術對ZmWRKY17在轉基因植物中的抗逆功能進行了驗證, 并利用轉錄組測序技術對其作用機制進行了初步探索, 獲得了如下主要結果 :1. 對玉米中 12 個 d 亞族 WRKY基因的分子特性進行了分析。研究發(fā)現(xiàn) , 玉米中 7 個 d 亞族 WRKY基因的表達均受到干旱和高鹽脅迫的誘導。克隆得到其中 6 個基因。酵母轉錄活性分析表明這6 個 d 亞族 WRKY基因在酵母

3、中均不具有轉錄激活能力。酵母雙雜交實驗表明 ,6 個 d 亞族 WRKY蛋白均能夠與鈣調素發(fā)生相互作用。2. 根據(jù)進化關系和誘導表達模式分析結果, 選取了 ZmWRKY17作為關鍵基因進行下一步的功能分析。序列分析顯示 ,ZmWRKY17基因 cDNA全長為 996bp, 編碼 331 個氨基酸 , 與玉米B73 數(shù)據(jù)庫中公布的序列完全一致。通過熒光定量PCR進一步對 ZmWRKY17的表達特性進行分析 , 發(fā)現(xiàn)該基因的表達還受到外源ABA的誘導。組織表達模式分析顯示 ,ZmWRKY17在根、莖、葉、花絲、雄穗、果穗和胚7個組織中均有表達 , 其中以雄穗中的表達水平最高。亞細胞定位結果顯示 ,

4、ZmWRKY17-GFP的融合表達蛋白定位在細胞核中。酵母單雜交實驗表明 ,ZmWRKY17能夠與 W-box序列發(fā)生特異性的結合。 3. 構建了 ZmWRKY17過量表達載體 , 并通過農桿菌介導的方法獲得了多個擬南芥轉基因株系。對轉基因植株和野生型植株進行了抗鹽表型鑒定實驗, 結果表明 : 在高鹽脅迫處理后 , 轉基因植株的相對電解質滲透率和丙二醛含量均明顯高于野生型植株,說明過量表達 ZmWRKY17提高了轉基因植株對高鹽脅迫的敏感性。4.ABA敏感性實驗顯示 ZmWRKY17的過量表達降低了轉基因植株對外源ABA的敏感性。另外 , 在外施 ABA合成抑制劑的情況下 , 轉基因株系的種子

5、在高鹽脅迫下的萌發(fā)受強烈抑制的表型得到恢復。 5. 對 ZmWRKY17作用機制進行了初步探索, 通過轉錄組測序對高鹽脅迫處理前后的擬南芥植株( 包括野生型植株和轉基因植株)進行了基因差異表達分析。結果發(fā)現(xiàn) , 野生型擬南芥在高鹽處理后共獲得316 個差異表達基因 , 轉基因株系中共獲得 334 個差異表達基因。通過對 RD29B、RAB18、KIN1、DREB1F、bHLH92等多個脅迫應答功能基因的表達變化分析發(fā)現(xiàn), 在高鹽條件下 , 這些抗逆功能基因在轉基因擬南芥中的表達上調變化程度顯著低于野生型植株。而 ABA合成相關基因 NCED5在轉基因擬南芥中的表達上調變化程度顯著高于野生型植株。 綜上所述 , 本研究首先對玉米中 d 亞族 WRKY基因的分子特性進行了分析。根據(jù)誘導表達模式、進化關系和序列特征等分析結果 , 選取了 ZmWRKY17作為關鍵基因進行下一步的功能研究。 過量表達該基因顯著提高了轉基因植株對高鹽脅迫的敏感性 , 同時 , 轉基因植株對 ABA的敏感性降低。轉錄組測序結果證實野生型植株和轉基因株系在高鹽處理后, 一