酶切注意事項(xiàng)及問(wèn)題

1、一、 建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的酶切反應(yīng) 目前大多數(shù)研究者遵循一條規(guī)則，即10個(gè)單位的內(nèi)切酶可以切割1g不同來(lái)源和純度的DNA。通常，一個(gè)50l的反應(yīng)體系中，1l的酶在1XNEBuffer終濃度及相應(yīng)溫度條件下反應(yīng)1小時(shí)即可降解1g已純化好的DNA。如果加入更多的酶，則可相應(yīng)縮短反應(yīng)時(shí)間；如果減少酶的用量，對(duì)許多酶來(lái)說(shuō)，相應(yīng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（不超過(guò)16小時(shí)）也可完全反應(yīng)。 二、選擇正確的酶 不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個(gè)相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)。識(shí)別堿基數(shù)目少的酶比堿基數(shù)目多的酶更頻繁地切割底物。假設(shè)一個(gè)GC含量50%的DNA鏈，一個(gè)識(shí)別4個(gè)堿基的酶將平均在每44（256）個(gè)堿基中切割一次；而一個(gè)識(shí)別6

2、個(gè)堿基的酶將平均在每46（4096）堿基切割一次。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端產(chǎn)物可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接，而所有的平端產(chǎn)物都可以互相連接。相關(guān)信息參見(jiàn)目錄的CompatibleCohesiveEndsAndRecleavableBluntEnds一文。三、酶 內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。酶應(yīng)當(dāng)是最后一個(gè)被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合）。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超過(guò)1U/g的酶才能被完全切割。參見(jiàn)目錄第244和264之切割質(zhì)粒DNA和包埋法切割DNA

3、。 四、DNA 待切割的DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過(guò)多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素。關(guān)于甲基化的內(nèi)容，參見(jiàn)第252頁(yè)至253頁(yè)之甲基化相關(guān)內(nèi)容。 五、緩沖液 對(duì)于每一種酶NEB都提供相應(yīng)的最佳緩沖液，可保證幾乎100%的酶活性。使用時(shí)的緩沖液濃度應(yīng)為1X。有的酶要求100g/ml的BSA以實(shí)現(xiàn)最佳活性。在這種情況下，我們也相應(yīng)提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會(huì)受太大影響。 六、反應(yīng)體積 內(nèi)切酶活力單位的定義是：1小時(shí)內(nèi)，50l反應(yīng)體積中，降解1g的底物DNA所需的酶為一個(gè)活力單位。因此

4、酶：DNA的反應(yīng)比例可以由此確定。較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過(guò)總體積的10%（一般酶都貯存于50%的甘油中）。七、混合 這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩！ 八、反應(yīng)溫度 大部分酶的反應(yīng)溫度為37C；從嗜熱菌中分離出來(lái)的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。一般為50-65C不等。參看第244頁(yè)Activityofthermophilesat37C。 九、反應(yīng)時(shí)間 1酶活單位的定義時(shí)間為1小時(shí)。如果加入的酶較多，可以相

5、應(yīng)地縮短反應(yīng)時(shí)間；反之，如果加入的酶量較少，也可以延長(zhǎng)時(shí)間以使反應(yīng)達(dá)到完全。參見(jiàn)第241頁(yè)酶在反應(yīng)中的存活時(shí)間。 十、終止反應(yīng) 如果不進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用終止液來(lái)終止反應(yīng)。在NEB我們使用如下反應(yīng)終止液：50%的甘油，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚藍(lán)（10l/50l反應(yīng)液）。如果要進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用熱失活法終止反應(yīng)（65C或85C，20分鐘）。熱失活并不能適用于所有的酶，詳情參見(jiàn)第240頁(yè)熱失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于終止反應(yīng)。 十一、貯存 大部分酶應(yīng)貯存于-20C。少部分酶則須在-70C長(zhǎng)期保存。詳情請(qǐng)參見(jiàn)相關(guān)酶的DATASHEET或目錄相關(guān)部分。10XB

6、UFFER和100XBSA于-20C保存。BSA不能與NEBuffer混合后保存，否則將會(huì)出現(xiàn)BSA沉淀。十二、穩(wěn)定性 每隔1-2個(gè)月都會(huì)對(duì)所有的酶有一個(gè)活性檢測(cè)；最近的一次檢測(cè)結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上。通過(guò)三十多年來(lái)的經(jīng)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)大部分酶在推薦的保存緩沖液里在-20C條件下十分穩(wěn)定。高于-20C條件下穩(wěn)定性將有所降低。 十三、對(duì)照反應(yīng) 如果發(fā)現(xiàn)您的DNA底物不能被成功切開(kāi)，可以進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以查明原因。具體方法如下： 將不加內(nèi)切酶的底物DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對(duì)照DNA（有多個(gè)已知酶切位點(diǎn)）同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。若實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明底物DNA降解，則說(shuō)明DNA在純化過(guò)程中或反應(yīng)液里引入了核酸

7、酶污染；若實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對(duì)照DNA被成功切開(kāi)，則可以排除酶質(zhì)量的原因，此時(shí)可以將對(duì)照DNA和待切底物DNA混合起來(lái)再次進(jìn)行反應(yīng)，以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在（通常是鹽、EDTA或酚），則混合物里的對(duì)照DNA也無(wú)法被切開(kāi)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)：1、 首先看是單酶切還是雙酶切。要是雙酶切要注意這兩種酶是否有共用的Buffer。2、酶的用量最好在40U單位以上，盡可能酶切充分。3、酶的用量不要超過(guò)總體積的1/10。4、同時(shí)看是否需要用到BSA。5、酶切時(shí)間不要低于2個(gè)小時(shí)。6. 酶切進(jìn)行時(shí)，注意酶切溫度是否穩(wěn)定地保持在最佳溫度；酶切時(shí)間根據(jù)廠家推薦，一般的酶1-2h

8、即可，特別難酶切的時(shí)間可放長(zhǎng)，但并不是越長(zhǎng)越好，時(shí)間太長(zhǎng)易引發(fā)部分酶的星號(hào)活性, 造成酶切失敗。NEB的酶我用過(guò)半小時(shí)內(nèi)酶切即可徹底。酶反應(yīng)操作時(shí)注意事項(xiàng)：1、基因工程操作是微量操作，試劑昂貴，要細(xì)心，準(zhǔn)確地配制所用的試劑。DNA樣品和酶用量體積都很少，要注意吸樣量的準(zhǔn)確性，酶用量不能過(guò)多，因酶通常保存在一定濃度的甘油內(nèi)，酶用量取得過(guò)多，甘油濃度加大反而抑制酶的反應(yīng)，通常不應(yīng)超過(guò)1/10 酶反應(yīng)總體積。2、當(dāng)塑料小管在一定溫度下水浴進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)，蓋子必須蓋得嚴(yán)密，防止水氣出入，影響總體積。3、酶反應(yīng)的一切器皿，都要以重蒸水清洗，消毒滅菌，嚴(yán)防其它酶的污染。4、要注意酶反應(yīng)時(shí)，加樣順序，最后加酶

9、液，混勻，操作過(guò)程中，一旦吸取好酶溶液，酶應(yīng)立即放回-20冰箱中，防止酶失活。酶的星號(hào)活性類(lèi)限制酶雖然識(shí)別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來(lái)的特異性。條件的改變，限制酶的特異性就會(huì)松動(dòng)，識(shí)別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱(chēng)第二活性，而將這種因條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個(gè)星號(hào)表示，因此第二活性又稱(chēng)為星號(hào)活性。概括起來(lái)，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種： (1)高甘油含量(5, vv)； (2)限制性內(nèi)切核酸酶用量過(guò)高(100UugDNA)； (3)低離子強(qiáng)度(25 mmolL)； (4)高pH(8.0以上)；(5)含有有機(jī)溶劑

10、，如DMSO，乙醇等； (6)有非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等連接注意事項(xiàng)1.與載體連接時(shí)，加大目的基因DNA量，以提高與載體的連接效率，而且可以按倍數(shù)擴(kuò)大連接反應(yīng)體積，如25ul加大到50ul2.保證你的感受態(tài)細(xì)胞效率沒(méi)問(wèn)題，必要的時(shí)候可以做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（加沒(méi)有酶切的質(zhì)粒載體）3.轉(zhuǎn)化過(guò)程中的冰浴要用碎冰加水，以保證溫度，從熱水浴中取出感受態(tài)后要迅速放入冰浴中。（二）連接反應(yīng)1.實(shí)驗(yàn)步驟1）用微量進(jìn)樣器吸取用PCR 清潔試劑盒終止酶反應(yīng)的酶切反應(yīng)液及試劑，混合于一個(gè)已編好號(hào)碼的Eppendorf 小管內(nèi)，連接反應(yīng)加樣量及順序：（1）pUC18質(zhì)粒酶切反應(yīng)液15 微 升（2）PCR 產(chǎn)物酶切反應(yīng)液15微升（3）10 倍T4 連接緩沖液4 微升（4）4 微升滅菌雙蒸水（5）T4D