擬南芥ems誘變及突變體篩選課件

1、擬南芥ems誘變及突變體篩選,EMS誘變擬南芥,誘變方法： 稱取250mg(約5000粒)野生型種子+25ml重蒸水50ml燒杯內(nèi)攪拌30min4下放置12h30ml 100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.5)的100ml三角瓶中加入0.2%(v/v)的甲基磺酸乙酯(EMS)封口后放在水浴(25)振蕩器上振蕩12h50ml蒸餾水漂洗種子4次,每次15min將漂洗好的種子置4下春化3天后種植。,擬南芥ems誘變及突變體篩選,誘變植株培養(yǎng)：,將經(jīng)EMS誘變處理后的擬南芥種子(M1)播種于用1 /4Hoagland營養(yǎng)液浸透的混有蛭石的營養(yǎng)土中(營養(yǎng)土:蛭石=2:1, v/v),種植后覆蓋塑料薄膜以

2、保持濕度。在溫度1822、光照強度120mol/m2s-1、光暗周期16h/8h條件下培養(yǎng),待種子成熟后分行采收種子(M2代)。,擬南芥ems誘變及突變體篩選,100mmol/L磷酸緩沖液配置：,1、準備100ml 1M K2HPO4和100ml 1M KH2PO4; 2、將70ml K2HPO4和20ml KH2PO4在燒杯中混勻； 3、用KH2PO4將PH調到6.5； 4、將1M的磷酸緩沖液稀釋到100mmol/L。,擬南芥ems誘變及突變體篩選,突變體篩選,根據(jù)光合色素的改變來篩選葉色突變體 因為很多與光合作用相關的基因突變,會直接引起葉片顏色的改變。葉色變異是比較常見的突變性狀,一般在

3、苗期表達,但少數(shù)突變體直到發(fā)育后期才發(fā)生葉色突變。由于基因突變往往是直接或間接影響葉綠素的合成和降解,改變?nèi)~綠素含量和葉綠素a/b的比值,所以葉色突變體也多為葉綠素突變體。葉色突變體的分類主要從苗期葉色來劃分,如白化、黃化、淺色、黃綠、綠色、花斑葉。,擬南芥ems誘變及突變體篩選,選擇壓的確定,適當?shù)倪x擇壓力應當是既能使突變體的優(yōu)勢得到發(fā)揮,又能使野生型受到足夠的壓力而不能表現(xiàn)。在篩選突變體之前,首先要設計一系列的篩選濃度,以野生型完全不能生長的濃度確定為篩選濃度。,擬南芥ems誘變及突變體篩選,根據(jù)高葉綠素熒光表型篩選突變體,其中高葉綠素熒光表型,作為光合電子傳遞鏈受損的標志,廣泛地應用于篩

4、選光合組分功能缺失的突變體。在正常的條件下,光化學反應與非光化學途徑活性很高,熒光的釋放很低(約3一5%);相反,如果由于類囊體膜蛋白復合體結構的改變等原因而造成的光合電子傳遞的受阻,則所吸收的光能不能有效傳遞轉變成化學能,便會以熱或高熒光的形式釋放出來,使光受體從激發(fā)態(tài)回到它的穩(wěn)定態(tài)(基態(tài)),導致吸收的能量以紅色熒光進行釋放的比例增加,這樣我們便能在暗室中觀察到與正常植株所發(fā)出的暗紅色熒光相比是亮紅色的熒光,即產(chǎn)生高熒光(hcf)的表型從而將突變體篩選出來。,擬南芥ems誘變及突變體篩選,根據(jù)葉綠素熒光參數(shù)篩選突變體,以葉綠素熒光參數(shù)為指標,可以得到不同類型的突變體,其中影響非光化學淬滅（N

5、PQ)和Psll的有效量子產(chǎn)率(ll)是兩種主要類型的突變體。 突變體篩選： 接種:擬南芥種子用10%次氯酸鈉浸泡15分鐘,其間不時的振蕩使滅菌充分,再用無菌水沖洗種子3次以上,滅菌處理后的種子點播于含3%的蔗糖的MS固體培養(yǎng)基(0.8%瓊脂)上,接好的種子放在4冰箱里春化2天。 培養(yǎng):于22下,光強120mol/m2sec(12h光照/12h黑暗)的光照條件下培養(yǎng)15-20天之后進行篩選。,擬南芥ems誘變及突變體篩選,葉綠素熒光成像系統(tǒng)對突變體進行篩選，設定不同偽彩色參數(shù)挑選出Fo；Fm；Fv/Fm;NPQ變化的突變體。 室溫狀態(tài)下,暗適應后的突變體野生型各生長時期植株用于分析。,擬南芥e

6、ms誘變及突變體篩選,過程： 1、測量前，使植株暗適應至少30分鐘； 2、打開測量光(measuring light,650nm的脈沖測量紅光，脈沖頻率為1.6KHz,光強0.05mol/m2 s)，得最小熒光值Fo； 3、得到穩(wěn)定的初始熒光值Fo，施加0.8s的單飽和脈沖光(3000mol/m2 s); 4、1.5分鐘后，曲線基本穩(wěn)定，打開激活白光(actinic light，光強為40mol/m2 s); 5、7.5分鐘時光合作用己達到穩(wěn)定狀態(tài)，曲線基本可以穩(wěn)定，得到Ft，在激活光存在下打開單飽和光(a saturating flash of light,持續(xù)800ms,光強為6000mo

7、l/m2 s)脈沖一次，與此同時，測量光脈沖頻率變?yōu)?0KHz，得最大熒光值Fm。 6、等曲線回落下來并達到穩(wěn)定，關閉激活光，再關閉測量光。記錄Fo,比率(Fm一Fo）/Fm=Fv/Fm,光飽和曲線等。,擬南芥ems誘變及突變體篩選,植物葉片經(jīng)過充分暗適應后,PSI和PSll均處于還原狀態(tài)，在650nm,光強為0.05-o.1mol/m2s的測量紅光下，由于Psl主要吸收遠紅光，Psll主要吸收紅光，此時葉片電子傳遞過程主要停留在PSll中，得到穩(wěn)定的初始熒光值FO。施加單飽和脈沖(3000mol/m2 s for 0.8s)后，Psll暫時達到飽和，Psll的電子受體QA被完全還原，葉綠素熒光產(chǎn)量由基態(tài)F(o)上升到最大值F(m)。這可以決定PSll最大光化學量子產(chǎn)量,Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(Maximum quantum yield of PSll)，表明最大PSll光能轉化效率。在擬南芥野生型葉片中,常在0.8-0.84之間。,擬南芥ems誘變及突變體篩選,1、當Fv/Fm比值在0.5左右時,說明在突變體中PSll內(nèi)部的電子傳遞受阻或者突變體中部分PSll功能喪失的結果。這是由于Fo升高引起的。 2、當Fv/Fm比值高于