第六章光學(xué)檢測技術(shù) 張靜

1、第六章 光學(xué)檢測技術(shù) ? 利用物質(zhì)所具有的各種光學(xué)性質(zhì)，對物質(zhì)利用物質(zhì)所具有的各種光學(xué)性質(zhì)，對物質(zhì) 進行定性、定量及結(jié)構(gòu)分析的技術(shù)。 ? 包括：旋光檢測、熒光檢測、分光光度檢 測、散射光譜檢測等。 ? 生化領(lǐng)域常用：分光光度檢測、旋光檢測、 熒光檢測 第一節(jié) 旋光檢測技術(shù) ? 利用旋光計測量出 旋光物質(zhì)（光學(xué)活性物質(zhì)） 對 偏振光旋轉(zhuǎn)角度的方向（左旋或右旋）和大小， 從而進行定性與定量分析的技術(shù)，稱為旋光檢測 技術(shù)。 ? 旋光物質(zhì)對偏振光的旋轉(zhuǎn)方向和角度大小是該物 質(zhì)的固有特性。偏振光旋轉(zhuǎn)的方向和角度稱為旋 光度。左旋（），右旋（）。 ? 物質(zhì)的旋光度主要取決于 物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)，此外 與入射光

2、的波長及溫度有關(guān)，對溶液而言，還與 溶液性質(zhì)、溶液濃度和溶液厚度 有密切關(guān)系。 旋光法：應(yīng)用旋光儀測量旋光性物質(zhì) 的旋光度以確定其含量的分析方法。 旋光度和比旋光度是旋光性物質(zhì) 的主要物理性質(zhì)。通過旋光度和比 旋光度的測定，可以檢查光學(xué)活性 化合物的純度，也可以定量分析有 關(guān)化合物溶液的濃度。 光是一種電磁波，即光波的振動方向與其前進方向互相垂直。 自然光有無數(shù)個與光的前進方向互相垂直的光波振動面。若光線前 進的方向指向我們，則與之互相垂直的光波振動平面可表示為如圖 （a），圖中箭頭表示光波振動的方向。若使自然光通過尼科爾棱鏡， 由于振動面與尼科爾棱鏡的光軸平行的光波才能通過尼科爾棱鏡， 所以

3、通過尼科爾棱鏡的光，只有一個與光的前進方向互相垂直的光 波振動面，如圖（b）。這種僅在一個平面上振動的光叫偏振光。 自然光與偏振光 通常用以下兩種方法產(chǎn)生偏振光：尼科爾棱鏡或偏振片。 尼科爾棱鏡 一塊方解石的菱形六面體末端的表面磨光，使鏡角 等于68，將之對角切成兩半，把切面磨成光學(xué)平面后，再用 加拿大樹膠粘起來，便成為一個尼科爾棱鏡。其中非常光線 MP由方解石到加拿大樹膠是由光疏介質(zhì)到光密介質(zhì)，必將發(fā) 生折射通過加拿大樹膠，由棱鏡的另一端面射出，從而產(chǎn)生了 平面偏振光。 偏振光的產(chǎn)生 尼科爾棱鏡示意圖 偏振片 利用偏振片也能產(chǎn)生偏振光。它是利用某些 雙折射晶體（如電氣石）的二色性，即可選擇性

4、吸收 尋常光線，而讓非常光線通過的特性，把自然光變成 偏振光。 分子結(jié)構(gòu)中有不對稱碳原子 ，能把偏振光的 偏 振面旋轉(zhuǎn)一定角度的物質(zhì)稱為 光學(xué)活性物質(zhì) 。 許多食品成分都具有光學(xué)活性，如單糖、低 聚糖、淀粉以及大多數(shù)的氨基酸和羥酸等。 其中能把偏振光的振動平面向右旋轉(zhuǎn)的，稱 為“具有右旋性”，以（十）號表示；反 之稱為“具有左旋性”，以（一）號表示。 旋光性、旋光性物質(zhì) 旋光度 偏振光通過光學(xué)活性物質(zhì)的溶液時，其振 動平面所旋轉(zhuǎn)的角度叫做該物質(zhì)溶液的 旋光度， 以表示。旋光度的大小與 光源的波長 、溫度、 旋光性物質(zhì)的種類、溶液的濃度及液層的厚度 有關(guān)。對于特定的光學(xué)活性物質(zhì)，在光源波長 和溫

5、度一定的情況下，其旋光度 與溶液的濃 度c和液層的厚度L成正比。 即： KcL 比旋光度比旋光度 ? 當旋光性物質(zhì)的濃度為 100 g/100 ml，液層厚度為 l dm （分米）時所測得的旋光度稱為比旋光度，以 表示 。由 上式可知： ? K11K ? 即： 式中： 比旋光度，度； ? t 溫度， ? 光源波長，nm； ? 旋光度，度； ? L液層厚度或旋光管長度，dm； ? c溶液濃度，gml。 LC ? ? ? t ? ? ? ? t ? ? ? ? t ? ? 比旋光度與光的波長及測定溫度有關(guān)。 通常規(guī)定用鈉光D線（波長 589.3nm）在 20時測定，在此條件下，比旋光度用 表示 ?

6、 因在一定條件下比旋光度 是已知的， L為一定，故測得了旋光度就可計算出旋光 質(zhì)溶液中的濃度c。 ? ? 20 D ? ? ? t ? ? 變旋作用變旋作用 定義 具有光學(xué)活性的還原糖類（如葡萄糖， 果糖，乳糖、麥芽糖等），在溶解之后，其 旋光度起初迅速變化，然后漸漸變得較緩慢， 最后達到恒定值，這種現(xiàn)象稱為變旋作用。 這是由于有的糖存在兩種異構(gòu)體，即型和型， 它們的比旋光度不同。這兩種環(huán)型結(jié)構(gòu)及中間的開鏈 結(jié)構(gòu)在構(gòu)成一個平衡體系過程中，即顯示出變旋光作 用。 變旋現(xiàn)象 因此，在用旋光法測定蜂蜜，商品葡萄糖等含有 還原糖的樣品時，樣品配成溶液后，宜 放置過夜再測 定。若需立即測定，可將中性溶液

7、（ pH=7）加熱至 沸，或加幾滴氨水后再稀釋定容；若溶液已經(jīng)稀釋定 容，則可加入碳酸鈉干粉至石蕊試紙剛 顯堿性。在堿 性溶液中，變旋光作用 迅速，很快達到平衡。但微堿 性溶液不宜放置過久，溫度也不可太高，以免破壞樣 品。 旋光儀旋光儀 WXG型半蔭旋光儀 檢糖計 WZB自動旋光儀 WGX型半蔭旋光儀型半蔭旋光儀 結(jié)構(gòu)和原理 起偏棱鏡一般用尼科爾（Nicol) 棱鏡，以 獲得偏振光。 旋光管盛裝待測液的玻璃管。 檢偏棱鏡仍用尼科爾（Nicol) 棱鏡，用以 檢測從旋光管射出的偏振光振動平面與原來相 比較的角度（可由刻度盤上的數(shù)值讀出）。 檢糖計檢糖計 檢糖計專用于糖類的測定。故刻度數(shù)值直 接表

8、示為蔗糖的百分含量（W/V），其測定原 理與旋光計相同。在結(jié)構(gòu)上有以下特點 檢糖計的基本光學(xué)元件 自動旋光儀自動旋光儀 當檢測池中放進存有被測溶液的試管后， 由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋轉(zhuǎn) 了一個角度，零度視場便發(fā)生了變化，轉(zhuǎn) 動檢偏鏡一定角度，能再次出現(xiàn)亮度一致 的視場。這個轉(zhuǎn)角就是溶液的旋光度，測 得溶液的旋光度后，就可以求出物質(zhì)的比 旋度。根據(jù)比旋度的大小，就能確定該物 質(zhì)的純度和含量了。 旋光法測定味精濃度旋光法測定味精濃度 ? 樣品溶液配制 ? 精確稱取味精樣品 10.00g，加4050mL蒸餾水 溶解，攪拌加入分析純鹽酸 16mL，使味精全部 溶解。冷卻至室溫，蒸餾水定容至

9、100mL。 ? 旋光儀調(diào)零 ? 預(yù)熱10min ，放進濾光片。取 16mL分析純鹽酸 蒸餾水定容至100mL。裝滿旋光管，調(diào)整零點。 ? 樣品液測定 ? 樣品洗滌旋光管三次，裝滿旋光管，放進樣品室， 測定旋光度，記錄溫度。 物質(zhì)被輻射能照射后，分子內(nèi)部獲得外源能 量，基態(tài)分子能級的電子躍遷到較高能級，轉(zhuǎn)變 成激發(fā)態(tài)分子能級，使分子處在高能域不穩(wěn)定狀 態(tài)，因此，它必須釋放多余的能量，變成穩(wěn)定狀 態(tài)的分子。 分子發(fā)光：由激發(fā)態(tài)能級回到基態(tài)能級的過程 中以光的形式釋放多余的能量，并發(fā)射出比原波 長更長的光譜。 熒光分光光度法 ：檢測分子發(fā)射光譜的分析方 法。 第二節(jié) 熒光檢測技術(shù) 一、特點一、特點

10、 專一性強 靈敏度高：測定同樣濃度物質(zhì)的含量，通常比吸 收光譜靈敏度高 24個數(shù)量級左右。 選擇性強：既可分析發(fā)射光譜，也可分析激發(fā)光 譜，偏振光譜。 發(fā)光方式多：物理發(fā)光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光。 可分析參數(shù)多：可分析熒光光譜，熒光強度，熒 光效率，熒光壽命等多種物理參數(shù)。 二、方法原理二、方法原理 熒光現(xiàn)象：是一種發(fā)光現(xiàn)象，當一種波長的 光照射在某一熒光物質(zhì)時，該物質(zhì)被激發(fā), 若 能在極短的時間內(nèi)發(fā)射出較激發(fā)波長更長波 長的光, 在激發(fā)態(tài)停留的時間大約10-810-4s. 發(fā)射的光譜稱為熒光光譜. 磷光光譜: 若這種光在激發(fā)態(tài)停留較長的時 間, 即在激發(fā)態(tài)停留的時間大約是10-410s, 系

11、統(tǒng)內(nèi)發(fā)射出比熒光波長更長波長的光. 發(fā)射的 光譜稱為磷光光譜. 1. 熒光產(chǎn)生機理熒光產(chǎn)生機理 （1）分子能級：最低第一級電子激發(fā)態(tài)振 動能級是產(chǎn)生熒光的基礎(chǔ)。分子吸收能 量后，電子躍遷到哪一個能級并不重要， 重要的是吸收了能量的分子經(jīng)過內(nèi)轉(zhuǎn)移 以后，將能量降到最低第一級電子激發(fā) 態(tài)振動能級后，能否以光子的形式釋放 能量，如能就會發(fā)射熒光，否則不會。 （2）耗能方式: 產(chǎn)生熒光:分子內(nèi)在因素和外在條件決定. ?在同一能級中分子間的相互碰撞消耗能量 ; ?無輻射衰減轉(zhuǎn)給周圍分子變成振動能消耗 ; ?輻射熒光-以光子的形式釋放能量 ; ?光分解消耗分子內(nèi)部的能量 (光分解以產(chǎn)生熱的 方式，使物質(zhì)結(jié)

12、構(gòu)發(fā)生變化，發(fā)光基團的發(fā)光 能量減弱或喪失 ). （3）能量的傳遞途徑）能量的傳遞途徑: 處于較高能級的激發(fā)處于較高能級的激發(fā) 態(tài)電子回到基態(tài)途徑 當兩個電子能級非?？拷?以致其振動能級發(fā)生重疊 時，電子由高能級以無輻 射躍遷方式轉(zhuǎn)移給低能級 不同多重態(tài)間的無輻射躍遷， 如S1T1。有時通過熱激發(fā)， 就有可能發(fā)生T1 S1 ，然 后產(chǎn)生延遲熒光 被激發(fā)分子與溶劑分子或其他 溶質(zhì)分子的相互作用把多余的 能量轉(zhuǎn)移給周圍分子，使熒光 或磷光發(fā)射的強度減弱或消失。 也稱熒光熄滅或猝滅 激發(fā)態(tài)分子把多余的振動 能量以熱的形式轉(zhuǎn)給周圍 分子，而自身從Sn的較高 振動能級層降低到該電子 能級的最低振動能級層

13、上 處于第一激發(fā)單重態(tài)最低 振動能級的電子回到基態(tài) 振動能級時，在短時間內(nèi) 發(fā)射一個光子返回到基態(tài) 分子的系間竄躍躍遷后， 就會發(fā)生快速的振動弛豫 到達第三激發(fā)單重態(tài)最低 振動能級上，以光子的形 式躍遷回到基態(tài) （4）分子熒光的類型: 根據(jù)熒光物質(zhì)所需的 激發(fā)光源不同和吸能后發(fā)射熒光光譜的差 異, 分為: ?物理發(fā)光(物理/光致熒光）：熒光分子吸收 了光能(如以X射線，紫外光，激光等為光源的輻 射能等)而產(chǎn)生的熒光; ?化學(xué)發(fā)光: 通過分子與分子之間的 化學(xué)反應(yīng)所 產(chǎn)生的化學(xué)能，在化學(xué)反應(yīng)過程中釋放能量而發(fā) 射熒光; ?生物發(fā)光: 通過生物體內(nèi)的 熒光酶與熒光物質(zhì) 相互作用，在生物化學(xué)反應(yīng)過程

14、中所釋放出來的 光能. 2. 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 任何熒光化合物的分子在吸收能量和釋 放能量的過程中，都存在著激發(fā)光譜和發(fā)射 光譜。 ? 激發(fā)光譜：熒光分子首先要從外界得到相應(yīng) 的能量，才能具備發(fā)光的基本條件,才有可 能發(fā)射熒光。 在選擇最佳激發(fā)波長時，可通過測量分 子的激發(fā)光譜來確定。 ?發(fā)射光譜： 分子發(fā)射熒光的特征波長比吸 收的特征波長長。 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光譜極為相似, 且呈鏡像對稱關(guān)系。 3. 熒光量子產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu) （1）熒光分子產(chǎn)生熒光的條件： ?熒光分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的 結(jié)構(gòu)，能吸收激發(fā)光提供的輻射能 ； ?分子吸收了與本身特征頻率相同能量后，必須具 有產(chǎn)

15、生一定的熒光量子的能力 。 產(chǎn)生熒光量子的強弱可用熒光量子產(chǎn)率（也稱 熒光效率或量子效率）來表示： （2）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系：）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系： ?共軛效應(yīng)：含有-*電子躍遷能級化合物 的熒光最強。的熒光最強。 絕大多數(shù)能發(fā)射熒光的化合物，都是 芳香族 或雜環(huán)類化合物或者在它們的分子中含有芳香族或者在它們的分子中含有芳香族 或雜環(huán)類基團。 苯類化合物的對苯基化、間苯基化及乙烯化 作用能夠增強苯分子的熒光強度。 ?分子的剛性平面結(jié)構(gòu)：分子的剛性平面結(jié)構(gòu)：能產(chǎn)生較強熒光。能產(chǎn)生較強熒光。 這種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動減少分子的振動，分子與溶劑或其 他溶質(zhì)分子相互之間的作用降低了，這樣更有利

16、于熒光的發(fā)射（如芴和聯(lián)二苯的熒光效率分別為 1.0和0.2；熒光素有很強的熒光，而酚酞沒有熒 光）。 ?取代效應(yīng)：給電子基團 （如-OH，-OR，-NH2， -CN，-NR等）能使熒光增強，得電子基團（如- COOH ，-C=O，-NO2，-NO及鹵素離子等）能 使熒光減弱 三、儀器的結(jié)構(gòu)與原理三、儀器的結(jié)構(gòu)與原理 1. 熒光分光光度法定量分析基本原理 溶液的熒光強度和該溶液 吸收光能的程度以 及溶液中熒光物質(zhì)的 熒光量子效率有關(guān)。 2. 熒光分光光度計的結(jié)構(gòu) 激發(fā)光源,激發(fā)單色器,樣品池,發(fā)射單色 器,檢測器及顯示系統(tǒng) ? 激發(fā)光源：要求能發(fā)出強度較大，連續(xù)穩(wěn) 定的光源。 理論上,發(fā)射熒光的

17、強度取決于激發(fā)光源的強 度. 實際應(yīng)用中選擇光源的強度不能太強也不能 太弱。 要根據(jù)熒光物質(zhì)的性質(zhì)選擇合適光源: 對光敏感或發(fā)射熒光較強的物質(zhì)選用較弱光源 , 反之可選較強光源 . 測量熒光強度儀器：濾光片熒光分光光度計 和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的精密熒光分光光度計 。主要部件： ?激發(fā)光源: 前者常用汞燈, 后者常用氙燈(250700 nm). ?濾光片和單色器： 前者采用兩個濾光片(激發(fā)濾 光片/熒光濾光片)；后者采用光柵作單色器。 ?樣品池：低熒光的玻璃或石英制成，形狀以散射 光較少的方形為宜。 ?檢測器：阻擋層光電池(500600 nm 最靈敏)，缺 點：易疲勞，靈敏度低 ；光電倍增管檢測器 ：靈

18、敏度高，使用簡單，特別適用于強度微弱光的測 量。 四、實驗技術(shù)四、實驗技術(shù)（影響熒光分析的因素）影響熒光分析的因素） a.溶液的pH的影響：在溶液中，絕大多數(shù)熒 光物質(zhì)都是以離子狀態(tài)形式存在的，發(fā)射熒光 的最佳條件是解離的熒光分子。 b. 溫度的影響: 溫度升高，熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光 效率和熒光強度都會下降，反之。 c.溶劑的影響：熒光物質(zhì)的熒光波峰位置和熒 光強度與溶劑的 介電常數(shù)有關(guān)。 不同溶劑對各種熒光物質(zhì)發(fā)生熒光的影響程度 是不同的，某些溶劑可使熒光物質(zhì)形成配合物， 某些溶劑可改變熒光物質(zhì)的解離狀態(tài)。 d. 激發(fā)光源的影響：光分解:熒光化合物被強激發(fā) 光照射會發(fā)生分解，引起熒光強度迅速下

19、降。所 以，熒光分光光度計通常在激發(fā)光單色器后裝配 有光閘，在測定時才打開光閘讓激發(fā)光照射樣品 池。 e.器皿污染的影響：器皿內(nèi)壁含極少量熒光物質(zhì)， 會使測定結(jié)果造成偏差，最好用 30% 硝酸清洗 。 f.內(nèi)濾效應(yīng)的影響：在樣品溶液中存在著雜質(zhì)或 測試樣品池濃度太大引起熒光變?nèi)醯默F(xiàn)象。 ?自吸收：樣品濃度大，熒光分子吸收光能和發(fā)射 熒光的同時有部分重疊，而引起可檢測的熒光強 度變?nèi)酢??雜質(zhì)吸收：樣品溶液中存在能吸收激發(fā)光或發(fā)射 光能量的雜質(zhì)，使檢測到的光強度變?nèi)酢?g. 稀樣品溶液的影響稀樣品溶液的影響: ?氧化作用：熒光物質(zhì)的稀溶液不如濃度高的溶 液穩(wěn)定，易發(fā)生氧化作用 (腎上腺素，1 g

20、/mL ， 100 g/mL) ?光分解：稀溶液相對于高濃度溶液更易發(fā)生光 分解，尤其對光較敏感的物質(zhì)。 ?表面吸附：某些非待測的熒光物質(zhì)吸附在比色 皿內(nèi)壁表面上，在分析過程中這些熒光物質(zhì)發(fā) 射相應(yīng)的熒光，干擾測定。對稀溶液影響大。 另外，表面吸附對不同溶劑吸附程度不同，有 機溶劑表面吸附更明顯。 五、熒光檢測技術(shù)的應(yīng)用 根據(jù)發(fā)光機理，能吸收能量后以光子的形式 釋放能量的化合物都屬熒光物質(zhì)。 發(fā)光方式分： ?自熒光物質(zhì)(分子中含熒光發(fā)光基團或化學(xué)鍵 ) ?外源熒光物質(zhì)(要與某些熒光物質(zhì)或熒光燃料以 共價鍵或離子鍵的形式結(jié)合 ) 分析方法: 1、 定量分析方法： （1）標準曲線法 （2）外標法（

21、直接比較法）：在一定濃度范圍內(nèi)， 選擇一個合適的標準樣品濃度，將其在熒光分光 光度計上測得的值與在同樣條件下的未知樣品的 值進行比較，得出未知樣品的濃度。 未知樣品濃度（ mg/mL ）=(A1/A2)c 式中，A1為未知樣品的熒光發(fā)光值， A2為標準 樣品的熒光發(fā)光值， c為標準樣品濃度。 2、定性分析：根據(jù)熒光發(fā)射的波長和出現(xiàn)的峰位， 確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)的某些特征 . 第三節(jié) 分光光度檢測技術(shù) a、目視比色法 用眼睛比較溶液顏色的深淺以確定物質(zhì)濃度的方 法稱為目視比色法。 特點：設(shè)備簡單、操作簡便；無需單色光；準確度不 高。 b、分光光度計 基于被測物質(zhì)的分子對光具有 選擇性吸收的特性 而建立起

22、來的分析方法。 包括： 分光光度檢測技術(shù)分光光度檢測技術(shù) （Chapter two spectrophotography) 定義: 分光光度檢測技術(shù)是利用物質(zhì)所特有的吸 收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的分析檢測技術(shù)。 特點: 靈敏、精確、快速和簡便，在復(fù)雜組分系 統(tǒng)中，不需要分離，即能檢測出其中所含的極少量 物質(zhì)。 應(yīng)用: 生物化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一，廣 泛用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測。 分光光度檢測的分類 分 光 光 度 檢 測 的 分 類 紅外分光光度檢測 : 可見光分光光度檢測 : 紫外分光光度檢測 : 測定波長范圍為大于760 nm的紅外光區(qū) 測定波長范圍為400760

23、 nm的可見光區(qū) 測定波長范圍為200400 nm的紫外光區(qū) 一、分光光度計工作原理 （一）分光光度檢測的光譜范圍（一）分光光度檢測的光譜范圍 包括波長范圍為 400760 nm的可見光區(qū)和波長范 圍為200400 nm 的紫外光區(qū)。不同的光源都有其特有 的發(fā)射光譜，因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光 源。 鎢燈的發(fā)射光譜 ：鎢燈光源所發(fā)出的 400760nm 波長的光譜，光通過三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、 黃、綠、藍、靛、紫組成的連續(xù)色譜；該色譜可作為 可見光分光光度計的光源。 氫燈的發(fā)射光譜 ：氫燈能發(fā)出185400 nm 波長的 光譜，可作為紫外光分光度計的光源 。 （二）物質(zhì)的吸收光

24、譜（二）物質(zhì)的吸收光譜 如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液，此 時在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜，它出現(xiàn) 了幾條暗線，即光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液 吸收而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的 吸收光譜。 不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的。因此根據(jù)溶液的 吸收光譜，可以鑒別溶液中所含的物質(zhì)。 用不同波長的單色光照射，測定吸光度，如果以 波長? ?為橫坐標，吸光度為縱坐標即可得一條曲線稱 為吸收曲線（ ? A曲線）。 吸收曲線清楚地描述了物質(zhì)對光的吸收情況。 吸收曲線 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 400450500550600650 波長（ nm ） A ?m

25、ax=510 nm ? （1）不同物質(zhì)吸收曲線的形狀和吸收波長不同。 MnO 4- 531 吸收曲線 ? （2）同一物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同；同一物 質(zhì)不同濃度，其吸收曲線形狀相似。 ? 吸收曲線是特征的，可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，作 為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一；吸收曲線是定量分析中 選擇入射光波長的重要依據(jù)。 當光線通過某種物質(zhì)的溶液時，透過的光的強度減 弱。因為有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分 光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收，只有一部分光可透過溶 液。 入射光 = 反射光 分散光 吸收光 透過光 如果我們用蒸餾水 (或組成此溶液的溶劑 )作為“空 白”去校正反射、分散等因素造成的入射光

26、的損失，則： 入射光 = 吸收光 十 透過光 (三）分光光度計常用術(shù)語 C : 測試溶液的濃度 I : 透過光的強度 I0 : 空白校正后入射光的強度 T : 透光率（ I/I 0 ） A : 光吸收（OD） L : 比色杯光程 吸光度A ：物質(zhì)對光的吸收程度。 定義： Alg（I 0/It) A越大，表示對光的吸收越大，透過光越弱。 ? （四）依據(jù)原理：朗伯-比爾定律（Lambert Beer） 1760年朗伯(Lambert) 闡明了光的吸收程度和 吸收層厚度的關(guān)系：Ab ? 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和 吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系： Ac ? 二者的結(jié)合稱為朗伯

27、比耳定律， Abc ? 朗伯比耳定律數(shù)學(xué)表達式： Alg（I0/I t)= b c 式中：A，吸光度，無量剛； b，液層厚度(光程長 度)，cm； c，溶液的濃度， mol L -1 ； (epsilon) 稱 為摩爾吸光系數(shù) ，Lmol -cm-1，僅與入射光波長、溶 液的性質(zhì)及溫度 有關(guān)，與濃度無關(guān)。 上式表明： 當一束單色光通過溶液時，其吸光度與溶 液濃度和寬度的乘積成正比 。 ? T、A、c間的關(guān)系： A lg（I 0/It) = -lg T = b c 透光度透光度( (透光率透光率) )T T ：透過光和入射光強度之比，即 T= I t /I0 100% T越大，表示對光的吸收越小

28、。 朗伯-比爾定律的適用條件 單色光 應(yīng)選用? max 處或肩峰處測定. 稀溶液 濃度增大，分子之間作用增強 . 吸光質(zhì)點形式不變 離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系 , 應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等 ). 吸光度具有加和性： 在多組分體系中，吸光度具有加和性， 即： A（總） A 1 + A2 + An = 1b c+ 2b c+ + nb c (五） 分光光度計的基本結(jié)構(gòu) 無論哪一類分光光度計都包括 5個基本部件：光源、 單色器、吸收池、檢測器和測量儀表 。分光光度計各部 件的次序如圖所示 : 分光光度計的基本部件分光光度計的基本部件 光 源: 分光光度計上常用的光源有兩種：鎢絲燈 或氫燈，

29、在可見光區(qū)、近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢 絲燈作為光源；在紫外光區(qū)多使用氫燈。 單色器：把混合光波分解為單 波長光的裝置。在 分光光度計中多用棱鏡或光柵作為色散元件。 吸收池：（比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃、 石英或熔凝石英制成，用來盛被測的溶液。在低于350 nm的紫外光區(qū)工作時， 必須采用石英池或熔凝石英池。 吸收池（比色皿）必須與光束方向垂直。此外， 每套比色皿的質(zhì)料、厚度應(yīng)完全相同，以免產(chǎn)生 誤差。比色皿上的指紋、油污或壁上的沉積物都 會顯著地影響其透光性，因此在使用前務(wù)必會顯著地影響其透光性，因此在使用前務(wù)必徹底徹底 清洗。 檢測器：常用光電池、光電管和光電倍增 管三種。 測量儀表：一般常用的紫外光和可見光分 光光度計有 3種測量裝置，即電流表、記錄器 和數(shù)字示值讀數(shù)單元?，F(xiàn)代的儀器常附有自動 記錄器，可自動掃描出吸收曲線。 （六）使用分光光度法測定樣品溶液濃 度的計算方法度的計算方法 ?標準曲線法（常用） ?標準管法 ?標準系數(shù)法 ?回歸分析法 其方法和步驟是： 1）配制一組濃度不同的標準溶液 (c 1 、 c2 )； 2）在一定波長下，分別測定其吸光度 (A 1、A2)。 3）以A為縱坐標，濃度 c為橫坐標，繪制曲線，得到一 條通過原點的直線，稱為標準曲線（A-c曲線）。 4）用完全相同的方法和步驟測定待測溶液的吸