抗體制藥課件

1、1 第五章第五章 抗體工程制藥抗體工程制藥 2 抗體藥物的生產(chǎn) 傳統(tǒng)的方法抗血清 淋巴細(xì)胞的培養(yǎng) 如何獲得需要的淋巴細(xì)胞？如何體外 培養(yǎng)淋巴細(xì)胞？ 3 1997年全球抗體藥物銷售額為3.1億美元，同 期全球藥品銷售額為3028億美元，市場份額 為千分之一 到2008年，增長至400億美元，同期全部藥品 銷售7730億美元，市場份額提升至5.2% 抗體藥物年銷售額復(fù)合增速高達(dá)56%，是總藥 品銷售增速的6倍 4 2009年，美國FDA批準(zhǔn)的6項(xiàng)新的生物制品 許可申請中，有4只產(chǎn)品屬于單抗藥物, 歐洲7個 5 2010年 強(qiáng)生的抗腫瘤壞死因子(TNF)-單克隆抗 體Remicade銷量達(dá)74億美元

2、 羅氏的Rituxan銷售額達(dá)到65億美元 羅氏的抗Her-2受體單克隆抗體赫賽汀 （Herceptin）銷售額達(dá)到51億美元 6 第一節(jié)第一節(jié) 抗體藥物概念及其特點(diǎn)抗體藥物概念及其特點(diǎn) 7 一、抗體藥物概念一、抗體藥物概念 通過細(xì)胞工程或基因工程生產(chǎn)的，用于診 斷或治療的單克隆抗體、多克隆抗體、抗 體片段、基因工程改造的抗體或免疫偶聯(lián) 物統(tǒng)稱為抗體藥物 8 免疫偶聯(lián)物 生物導(dǎo)彈 是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼 由單克隆抗體與藥物、酶、毒素 或放射性同位素等配合而成 9 10 二、抗體藥物特點(diǎn)二、抗體藥物特點(diǎn) 1. 特異性 1）與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合 2）對靶細(xì)胞的選擇性 2. 多樣性 1）抗原多樣

3、性 2）結(jié)構(gòu)多樣性 3）抗體活性的多樣性 4）免疫偶聯(lián)物和融合蛋白的多樣性 11 第二節(jié)第二節(jié) 雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體 1975年，德國學(xué)者Kohler和英國學(xué)者 Milstein合作研究將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫后的 小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，建立了 能持續(xù)分泌抗棉樣細(xì)胞抗體的雜交瘤細(xì)胞， 從而創(chuàng)立了具有劃時代意義的新技術(shù)，為此 獲得了1984年醫(yī)學(xué)諾貝爾獎 12 一、抗體的種類一、抗體的種類 1. 多克隆抗體 多克隆抗體含有兩層意思：一是有含多個抗原 位區(qū)的大分子刺激產(chǎn)生的、識別不同抗原位區(qū) 的各種抗體；二是由體內(nèi)不同淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的、 可針對同一抗原位區(qū)的多克隆抗體 2

4、. 單克隆抗體 僅識別抗原分子上同一抗原位區(qū)的由同一克隆 細(xì)胞產(chǎn)生的抗體為單克隆抗體 13 傳統(tǒng)傳統(tǒng)抗血清抗血清 抗抗 原原 免免 疫疫 所有抗所有抗體體混合混合 1 2 34 BALB/ c 1234 1 2 34 14 二、雜交瘤及雜交瘤技術(shù)二、雜交瘤及雜交瘤技術(shù) 細(xì)胞雜交的含義包括同一細(xì)胞的自融合 或是在誘導(dǎo)物的作用下不同細(xì)胞間的融 合 淋巴細(xì)胞通過融合劑的作用和腫瘤細(xì)胞 形成融合的雜交細(xì)胞稱雜交瘤細(xì)胞 通過腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的融合，用于 某些細(xì)胞特性的研究和生產(chǎn)所期望的免 疫分子，稱為雜交瘤技術(shù) 15 目前雜交瘤技術(shù)在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 有兩種 B淋巴細(xì)胞雜交瘤，即用骨髓瘤細(xì)胞和 B淋巴

5、細(xì)胞進(jìn)行融合而制備抗體，也是 引用最廣泛的一種 T細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞 融合而制備具有免疫活性的淋巴因子 通常人們所述的雜交瘤技術(shù)即知B淋巴 細(xì)胞雜交瘤，也可稱為單克隆抗體技 術(shù) 16 三、單克隆抗體三、單克隆抗體 單克隆抗體是由一個骨髓瘤細(xì)胞和一 個具有分泌抗體能力的B淋巴細(xì)胞融合 形成的雜交瘤細(xì)胞，通過無性繁殖形 成的細(xì)胞系 而獲得的 這個細(xì)胞系的每個細(xì)胞均具有相同的 特性且高度均一，這一細(xì)胞系分泌的 抗體均一性極高，活性、亞基、親合 力均相同 17 單克隆抗體的特點(diǎn) 抗體結(jié)構(gòu)高度均一?？贵w分子在結(jié)構(gòu)上高度 均一，甚至在氨基酸的序列和空間結(jié)構(gòu)上都 相同 高度特異性?？贵w識別的是

6、抗原分子上單一 的抗原位區(qū) 穩(wěn)定的生產(chǎn)特性。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是可以無 性繁殖的細(xì)胞系 18 第三節(jié)第三節(jié) 雜交瘤細(xì)胞系的建立雜交瘤細(xì)胞系的建立 19 一、免疫一、免疫B淋巴細(xì)胞的制備淋巴細(xì)胞的制備 1. 抗原 凡是能具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)均可制備單 克隆抗體，抗原可以是全病毒、亞單位 或純化分子，也可以是蛋白質(zhì)、多糖、 脂類等 用于制備單克隆抗體的抗原在理論上講， 純度要求就可以不高，也可以使混合抗 原 20 2. 免疫 動物的選擇 目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系來自BALB/c小 鼠和Lou大鼠 免疫方法 A. 體內(nèi)免疫法 B. 脾內(nèi)免疫法 C. 體外免疫法 21 二、二、 骨髓瘤細(xì)胞的選擇骨髓瘤細(xì)胞的選

7、擇 在B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)中，主要是用多 發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞作為親本細(xì)胞，這種細(xì) 胞是來自骨髓造血細(xì)胞的一種腫瘤，分 泌單一抗體的漿細(xì)胞，并且衰變成不表 達(dá)自身抗體或部分表達(dá) 常見的骨髓瘤親本細(xì)胞系有Sp2/0，NS-1， Y3，YB2 22 三、三、 免疫脾細(xì)胞的制備免疫脾細(xì)胞的制備 經(jīng)免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼 球、斷頸等方法處死后，無菌摘取脾臟， 研磨制取B淋巴細(xì)胞懸液，經(jīng)氯化銨破碎 紅細(xì)胞后，洗滌并調(diào)整到（15）X107 個ml濃度備用 23 四、四、 細(xì)胞融合細(xì)胞融合 將免疫脾B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按照 （510）：1混合后離心取上清，緩慢 加入分子量在40006000的5

8、0PEG 1ml， 間隔1分鐘后，緩慢加入無血清培養(yǎng)基， 終止融合劑的作用，經(jīng)洗滌去除融合劑 后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，分種于96孔板中 24 五、特異雜交瘤細(xì)胞的選擇五、特異雜交瘤細(xì)胞的選擇 1. 雜交瘤細(xì)胞的選擇 融合后，有雜交瘤細(xì)胞有骨髓瘤B 淋巴細(xì)胞、B淋巴瘤細(xì)胞B淋巴瘤 細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞， 還有未融合的骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì) 胞 一般用HAT培養(yǎng)液進(jìn)行篩選 25 mm 核酸 磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 26 27 2. 特異性抗體的篩選 篩選出的雜交瘤細(xì)胞并不是都能分泌所 期望的抗體，所以還要對雜交瘤細(xì)胞做 的二次篩選，即對所分泌的抗體進(jìn)行檢 測 一般地，細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，抗體可 以達(dá)到每毫升

9、微克級的水平，目前檢測 方法的靈敏度都可以達(dá)到。實(shí)驗(yàn)室常用 的是酶聯(lián)免疫的方法，即ELISA方法 28 29 六、雜交瘤細(xì)胞的克隆和建株六、雜交瘤細(xì)胞的克隆和建株 1. 雜交瘤細(xì)胞的克隆化 2. 雜交瘤細(xì)胞系建株 30 七、單克隆抗體的制備七、單克隆抗體的制備 1. 動物體內(nèi)誘生法 2. 體外培養(yǎng)法 31 32 八、單克隆抗體生產(chǎn)的一般流程 33 體外培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞 免疫純系小鼠，取脾臟細(xì)胞 體外融合 HAT選擇培養(yǎng) 抗體檢測，陽性孔 克隆化培養(yǎng)，抗體檢測 陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng) 凍存細(xì)胞，建立細(xì)胞庫 體外法制備單克隆抗體 體內(nèi)法制備單克隆抗體腹水 抗體檢測 34 35 第四節(jié)第四節(jié) 基因工程抗體

10、基因工程抗體 36 鼠單抗對人而言有較強(qiáng)得免疫原性，可 以產(chǎn)生較強(qiáng)的人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng) 生產(chǎn)成本比較高，難以大規(guī)模普及應(yīng)用 37 基因工程抗體優(yōu)點(diǎn) 降低抗體的免疫原性。通過基因工程改 造技術(shù)，可以最大程度地降低抗體的鼠 源性，降低甚至是消除人體對抗體的排 斥反應(yīng) 穿透力強(qiáng)。基因工程抗體分子一般比較 小，更容易到達(dá)病灶的核心部位 可以根據(jù)需要，制備多用途的新型抗體 成本降低。可采用原核細(xì)胞、低等真核 細(xì)胞和植物等多種系統(tǒng)表達(dá) 38 一、人鼠嵌合抗體一、人鼠嵌合抗體 在基因水平上將鼠源單克隆抗體可 變區(qū)和人抗體恒定區(qū)連接起來并在 合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)，這種抗體 稱為人鼠嵌合抗體 39 40

11、 二、鼠單抗可變區(qū)人源化抗體二、鼠單抗可變區(qū)人源化抗體 1. 改行(型)抗體 將鼠單抗的CDR區(qū)移植到人單抗的骨架 區(qū)，就可能使人單抗獲得同鼠一樣的 抗體特異性，并可以最大限度地降低 鼠單抗的異源性，這樣就得到了改行 抗體。這種改造過的抗體也稱CDR移植 抗體 41 42 2. 表面氨基酸殘基的人源化鑲面抗體 將鼠單抗可變區(qū)表面暴露的骨架區(qū)氨基酸 殘基中改成人源的，就成為了鑲面抗體 3. 表位印跡選擇 表位印跡選擇是一種與高效篩選噬菌體抗 體庫技術(shù)相結(jié)合的人源化抗體的方法，可 以通過數(shù)輪篩選得到完全人源的抗體 43 三、 小分子抗體 小分子抗體是完整免疫球蛋白的一部分，分子量 比較小。 1）Fa