蜜環(huán)菌菌種的復(fù)壯研究

1、蜜環(huán)菌菌種的復(fù)壯研究第33卷第2期2008年1月中國中藥雜志chinajournalofchinesemateriamedicavo1.33,issue2january,2008蜜環(huán)菌菌種的復(fù)壯研究王淑芳,楊金玲,朱平,朱慧新,何惠霞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室,北京100050)摘要】目的:研究蜜環(huán)菌菌種的復(fù)壯問題.方法:應(yīng)用搖瓶擴繁無性后代的方法,觀察幾種培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)方法對蜜環(huán)菌菌索形成的影響,并挑取新鮮粗壯菌索的先端部分進行斜面培養(yǎng).結(jié)果:在富含有機氮的半固體培養(yǎng)基上蜜環(huán)菌最易形成粗壯的菌索.結(jié)論:選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基及培養(yǎng)方法搖瓶擴繁蜜環(huán)菌

2、后代,再進行選擇培養(yǎng)是復(fù)壯蜜環(huán)菌菌種最簡易的方法.關(guān)鍵詞】蜜環(huán)菌;菌索;復(fù)壯中圖分類號】s567文獻標識碼a文章編號】1001.5302(2008)02-0121-03蜜環(huán)菌是名貴中藥天麻塊莖生長發(fā)育必不可少的共生菌.栽培天麻時如無蜜環(huán)菌菌材伴栽,天麻塊莖就會因得不到營養(yǎng)而無法長大并逐漸消亡.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,蜜環(huán)菌本身就是一種具有天麻藥效的藥用真菌,蜜環(huán)菌可作為傳統(tǒng)中藥天麻的代用品j.但無論伴栽天麻還是發(fā)酵生產(chǎn)天麻蜜環(huán)菌片,蜜環(huán)片,所用蜜環(huán)菌菌種經(jīng)長期多次傳代后都會逐漸發(fā)生退化,明顯表現(xiàn)為在瓊脂斜面上萌發(fā)菌絲慢,菌絲不易形成菌素或僅形成少量纖細少分支并很快變?yōu)楹稚木?有時只形成一片片褐色皮殼

3、狀硬塊,其上面菌絲叢不多,培養(yǎng)基表面白色菌絲也很少,所以其特有的在黑暗中能發(fā)出熒光的特性很弱,甚至沒有.已發(fā)生退化的菌種不僅會影響伴栽天麻的產(chǎn)量j,也會影響其發(fā)酵生產(chǎn)蜜環(huán)片的產(chǎn)量和質(zhì)量.菌索粗壯,分支旺盛的菌株發(fā)酵得到的每克干菌絲中的多糖含量一般較高_4j,其中的2種多糖均能抑制四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖升高j.菌索是蜜環(huán)菌生活史中存在較長的一個階段,子實體在菌索上產(chǎn)生.不形成菌索的蜜環(huán)菌較難通過培養(yǎng)子實體來復(fù)壯,但根據(jù)蜜環(huán)菌好氣性的生物學(xué)特性,選用搖瓶深層培養(yǎng)得到較多碎小的新生菌絲段,通過半固體搖瓶培養(yǎng)與靜置,可將一株保存20多年,經(jīng)多次傳代,不易形成菌索的退化菌株,恢復(fù)為生長旺盛,菌索發(fā)達且熒

4、光強的菌株.1儀器與材料收稿日期2007-02-28通訊作者朱平,tel:(010)63165197,e-mail:zhupingimm.高壓滅菌鍋,無菌操作超凈臺,搖床.亮竹蜜環(huán)菌armiuariameuea為本實驗室1986年保存菌種.2方法2.1菌種無性后代的擴繁2.1.1培養(yǎng)基菌種斜面:5%麥麩煮30rain濾液1000ml,加入10g葡萄糖,10g蔗糖,1gkh2po,0.5gmgso4?7h20,18g瓊脂.種子搖瓶:1%豆餅粉,2%葡萄糖,0.1%kh2po4,0.05%mgso4?7h20,自來水配制,ph自然.培養(yǎng)瓶:5%麥麩煮汁濾液(液體);麥麩濾渣(固體);5%麥麩煮汁不

5、濾渣(半固體);同斜面瓊脂培養(yǎng)基(固體).以上各培養(yǎng)基除菌種斜面用試管外,其余均用三角瓶.液體,半固體培養(yǎng)基用500ml瓶,裝量200ml,固體培養(yǎng)基用100ml三角瓶,裝量為瓶體積的1/31/2,壓成斜面即可,每處理4瓶,常規(guī)高壓滅菌30rain.2.1.2擴繁方法從4冷庫取出保存20多年經(jīng)多次傳代的蜜環(huán)菌母種試管,由于菌種退化,無菌索,只是在褐色菌皮上有一些駝色的菌絲叢,并且培養(yǎng)基表面的白色菌絲較少,所以接種種子搖瓶時,每瓶1支,截為23段,接種后搖床暗培養(yǎng),轉(zhuǎn)速150r?rain,溫度23.因菌種衰老,在搖瓶中調(diào)整適應(yīng)期較長,擴繁時間為3周以上,瓶內(nèi)充滿較多米粒大小的菌絲球后備用.將種子

6、菌液接入4種培養(yǎng)基后,和先放搖床上搖培4d,生長旺盛后靜置,和接種后即靜置,25避光培養(yǎng)1個月.121?第33卷第2期2008年1月中國中藥雜志chinajournalofchinesemateriamedicavo1.33,issue2january,20082.2不同培養(yǎng)基與濃度比較2.2.1培養(yǎng)基用含2%葡萄糖,0.2%kh2po和0.1%mgso?7h2o的水溶液配制含4種不同氮源的培養(yǎng)基:5%麥麩濾汁;1%豆餅粉汁;0.25%nhno液;麩豆濾渣.2.2.2配制與培養(yǎng)按500ml三角瓶裝量200ml,用瓊脂將,3種營養(yǎng)液分別配制成不同體積分數(shù)的半固體,依次為0%,0.2%,0.4%,

7、0.6%,每處理3瓶,為和的混合濾渣(含水230%)按重量比均分于各三角瓶中,依次形成4個濃度即0%,9%,18%,27%,培養(yǎng)基常規(guī)高壓滅菌30min.菌源為麥麩濾渣培養(yǎng)的菌種,每瓶接入1cm菌塊,接種時將菌塊放在瓶el盡量壓碎,先搖培90h,然后25c【=避光靜置培養(yǎng)1個月.2.3培養(yǎng)基添加有機氮固形物及培養(yǎng)方法基于添加瓊脂配制的綜合nhno半固體培養(yǎng)基缺少有機氮營養(yǎng),將瓊脂改為含少量有機氮的硬木屑及稻殼粉,按2.2.1方法中將nhno基本液配分別制成含固形物1%,3%,5%,7%,3重復(fù),滅菌,接種和培養(yǎng)方法均同上.3結(jié)果3.1擴繁菌種生長狀況由于蜜環(huán)菌在自然界中菌索多貼附在樹木皮層縫隙

8、中,所以在4種不同物態(tài)的培養(yǎng)基上,同樣的種子菌液出現(xiàn)了不同的生長狀況.麥麩煮汁濾液(液體):上液面飄浮多塊圓形褐色絨狀菌絲叢,下有淡棕色凍狀菌絲團,未形成明顯菌索;麥麩濾渣(固體):上表面為生有駝色菌絲叢的菌皮,瓶壁及底部可見白色線狀菌索;5%麥麩煮汁不濾渣(半固體):上表面有駝色菌絲叢,培養(yǎng)基內(nèi)充滿白色粗壯多分支的貼瓶壁的菌索;麩汁綜合瓊脂(固體):上表面及周邊有褐色菌線與白色菌絲形成大小不等分隔區(qū),底部可見白色菌索.在人工培養(yǎng)條件下,蜜環(huán)菌在固體培養(yǎng)基上均可形成菌索,但從其長勢及生長量上來看半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)效果較好,便于從直觀上分辨菌索的形成以盡快篩選到復(fù)壯的菌株.3.2菌索形成狀況各處理

9、的菌索形成狀況見表1.綜合麥麩濾汁和綜合豆餅粉汁所有培養(yǎng)瓶中都能形成菌索,不添加瓊脂也能形成菌索,但菌索較細且呈淺紅褐色.加0.2%及0.4%瓊脂后菌索形成較多且較粗壯,主?122?菌索直徑可達3mnl.而nhno披理的12瓶,均未形成菌索,但搖瓶期菌絲發(fā)出熒光最早,亮度最強,可能是因為其可溶性速效營養(yǎng)被菌利用得快,菌絲生長旺盛,而搖培3d后其熒光亮度下降至不及其他3種培養(yǎng)基;靜置后nhno孜理缺長效有機氮,所以營養(yǎng)不足以使菌形成菌索.在麩豆濾渣處理中,無論濾渣多少,每瓶均可形成菌索.只有未添加濾渣的處理,因僅僅是葡萄糖和無機鹽溶液,缺乏氮源,營養(yǎng)不足,所以未形成菌索.表1各處理的菌索形成狀況

10、形成菌索瓶數(shù)/培養(yǎng)瓶數(shù)未添加瓊脂的含9%,18%,27%濕麩豆濾渣的3個處理均能形成菌索,未添加濾渣的處理則不能形成菌索.3.3硬木屑及稻殼粉對菌索形成的影響硬木屑及稻殼粉對菌索形成的影響結(jié)果見表2.無論硬木屑還是稻殼粉,由于有機氮含量較低,遠不及麥麩及豆餅粉,所以其含量為1%的培養(yǎng)瓶中只形成一團團菌絲,上表面有較多駝色及白色菌絲叢,下邊菌絲連成一片片淺褐色的膜,未形成菌索.含硬木屑或稻殼粉3%及更高濃度的各培養(yǎng)瓶中則都形成了菌索,但菌索均較細長,直徑大多在1mm左右,沒有綜合麥麩及綜合豆餅粉的培養(yǎng)基中長出的菌索粗壯,量多,但長期靜置又比添加瓊脂有利于菌索潔白顏色的保持.表2硬木屑及稻殼粉對菌

11、索形成的影響形成菌索瓶數(shù)/培養(yǎng)瓶數(shù)綜上所述,已退化的不能形成菌索的蜜環(huán)菌菌種,通過搖瓶擴繁形成大量米粒大小菌絲球,菌絲片后,可通過含有機氮和葡萄糖的半固體搖瓶進一步培養(yǎng)后靜置,生活力強的菌絲球或片段即脫穎而出并快速生長,形成粗壯旺盛的菌索,挑取新鮮菌索的第33卷第2期2008年1月中國中藥雜志chinajournalofchinesemateriamedicavo1.33,issue2january,2008先端部分移植于試管斜面上即可得到復(fù)壯的菌株.參考文獻1陳士瑜,陳海英.蕈菌醫(yī)方集成m.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2000:433.2栗德林,余傳隆,楊思樹,等.中國藥物大辭典m.上冊.北京

12、:中國醫(yī)藥科技出版社,199l:ll89.3王秋穎,郭順星,關(guān)鳳斌.不同來源蜜環(huán)菌對天麻產(chǎn)量影響的456研究j.中草藥,2001,32(9):839.王秋穎,郭順星,樊錦艷.不同蜜環(huán)菌菌株生物學(xué)特性及多糖含量研究j.中國藥學(xué)雜志,2001,36(9):588.于敏,沈業(yè)壽.蜜環(huán)菌菌索多糖對小鼠血糖及急性毒性作用研究j.中國食用菌,2002,21(1):35.王淑芳,徐貴樣,楊永春.室溫條件下藥用真菌菌種的保藏j.中國食用菌,1991,10(2):25.studiesonrejuvenationofarmillariamelleawangshu.fang,yangjin.ling,zhuping

13、,zhuhui.xin,hehui.xia(keylaboratoryofbiosynthesisofnaturalproductsofministryofhealth,instituteofmateriamedica,chineseacademyofmedicalsciencesandpekingunionmedicalcollege,beijing100050,china)abstractobjective:tostudytherejuvenationofarmillariamelleastrain.method:observetheinfluencesofseveralingredien

14、tsanddifferentculturalmethodsontheshoestringformationoftheclonaloffspringsinflask,andselectthetippartoftheshoestringforcultivation.result:thestrongshoestringswereeasilyrestoredinthesemisolidmediumwithrichorganicnitrogensource.con?clusion:itwastheeasiestwaytorejuvenatea.melleastrainbymuhiplyingtheclo

15、naloffspringsinapropermedium,togetherwiththeproperselection.keywordsarmillariamellea;shoestring;rejuvenation責任編輯張寧寧】土壤因子對懷菊質(zhì)量影響研究郭巧生h,梁迎暖,張重義,王桃銀,汪濤(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所,江蘇南京210095;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所,河南鄭州450002)摘要目的:研究土壤因子對懷菊內(nèi)在質(zhì)量的影響.方法:分別測定河南溫縣,江蘇南京和浙江桐鄉(xiāng)三地懷菊樣品中綠原酸,總黃酮和微量元素的含量,并分析相應(yīng)土壤的理化性質(zhì),測定礦質(zhì)元素含量,通過相關(guān)分析和通徑分析研究土壤環(huán)境對懷菊內(nèi)在質(zhì)量的影響.結(jié)果與結(jié)論:結(jié)果表明三地懷菊內(nèi)在質(zhì)量差異顯著,土壤因子對懷菊內(nèi)化學(xué)成分含量有很大的影響,其中直接作用較大的依次是脲酶活性,速效鉀,cec和速效磷的含量,而且其微量元素與土壤礦質(zhì)元素有很好的相關(guān)性,其中懷菊對土壤中鎂,砷的富集能力