HTRF技術原理和應用介紹(總4頁

1、Cisbio-HTRF技術原理和應用簡介HTRF（均相時間分辨熒光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是一種用來檢測純液相體系中待測物的技術。該技術基于熒光共振能量轉移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時間分辨熒光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)）兩大技術，開通的一款高通量藥物篩選利器。熒光共振能量轉移（FRET）利用兩種熒光基團的能量轉移，這兩種熒光基團分別稱為能量供體（Donor）和能量受體（Acceptor）。Donor被外來光源激發(fā)（例如氙燈或激光）

2、，如果它與Acceptor比較接近，可以將能量共振轉移到在Acceptor上，使其受到激發(fā)，發(fā)出特定波長的發(fā)射光。將Donor和Acceptor分別與相互作用的兩個生物分子結合，生物分子的結合可以將Donor和Acceptor拉到足夠近的距離，產(chǎn)生能量轉移，由于Acceptor的發(fā)射光來自能量轉移，所以實驗中不需要將未結合與已結合的分子分開，即不需要洗滌步驟。 時間分辨熒光（TRF）TRF利用稀土元素中鑭系元素的獨特性質(zhì)，它們與普通熒光的主要區(qū)別是熒光的持續(xù)時間不同。普通熒光的半衰期為納秒級。鑭系元素的半衰期為毫秒級，有6個數(shù)量級的差別。所以，在檢測室，TRF有一個時間延遲-50us，經(jīng)過這個

3、時間延遲，普通熒光的信號幾乎為零，所以，TRF的背景非常低，反映樣品實際情況。HTRF的能量受體（技術創(chuàng)新點）HTRF的能量供體是銪(Eu)和鈦(Tb)的穴狀化合物。在這個穴狀化合物里，Eu和Tb被永久地嵌合在一個籠子里，結構非常穩(wěn)定，這個結構由J.M.Lehns教授發(fā)明的，并由此在1987年獲得了諾貝爾獎。HTRF的能量受體HTRF的能量受體也有二種，XL665和d2.它們的光學性質(zhì)相同，分子量不同，前者分子量為10KD，實際上就是別藻藍蛋白（APC）。我們將APC的亞基偶聯(lián)在一起，使其不能解離，提高了穩(wěn)定性，后者分子量為1KD，在某些實驗中有獨特的優(yōu)勢。HTRF的操作步驟HTRF操作步驟非

4、常簡單，只需要將實驗所需試劑加進去，然后孵育，檢測即可。HTRF實驗數(shù)據(jù)分析HTRF采用了比值法來處理數(shù)據(jù)，可以去除溶液通透率、細胞大小、細胞數(shù)量不同引起的誤差。HTRF應用范圍G蛋白偶聯(lián)受體研究激酶活性檢測生物標志物檢測受體第二信使檢測受體配體結合胞內(nèi)信號分子檢測胞外激酶活性檢測胞內(nèi)激酶活性檢測基于抗體的夾心法和競爭法檢測抗體檢測生物/免疫過程分析免疫檢查點檢測抗體重鏈含量檢測抗體輕鏈含量測定GST含量測定 CD16結合檢測HIS含量測定 CD32結合檢測CHO宿主蛋白含量測定 CD64結合檢測PD1/PD-L1 CTLA4/B7-1LAG3/MHC II CD47 / SIRP alphaCTLA4/B7-2 Adenosin A2A相互作用分析蛋白修飾實驗室服務蛋白-蛋白 / 蛋白-多肽蛋白-DNA / 蛋白-RNA蛋白甲基化 / 蛋白乙酰化蛋白泛素化 / 蛋白水解HTRF技術優(yōu)勢：1.操作簡單，空板直接加樣，加完即可檢測，時間短（加樣和孵育2h）！2.適合珍貴樣本：整個實驗體系只需20ul3.均相檢測：無需包被，免洗ELISA，省時省力4.體系穩(wěn)定：7天內(nèi)可隨時檢測，信號基本不變5.數(shù)據(jù)客觀真實：比值處理可有效去除背景熒光，假陽性率和價陰