微生物的遺傳物質(zhì)

1、第1章 微生物的遺傳物質(zhì) 第一節(jié) 證明遺傳物質(zhì)是DNA(或RNA)的經(jīng)典實驗 第二節(jié) DNA的結(jié)構(gòu)和復(fù)制 第三節(jié) 原核生物的染色體及其復(fù)制 第四節(jié) 真核生物染色體及其復(fù)制 第五節(jié) 基因結(jié)構(gòu)和基因組 第一節(jié)證明遺傳物質(zhì)是DNA（RNA）的三 個經(jīng)典試驗 v細菌的轉(zhuǎn)化 v噬菌體感染實驗 v病毒重建實驗 1、細菌的轉(zhuǎn)化實驗 1928, 英國Griffith, Streptococcus penumoniae 菌株毒力莢膜菌落 野生型有產(chǎn)生光滑Smooth 突變型無不產(chǎn)生粗糙Rough Griffith認為,加熱殺死的S型菌中存在某種 能使活的R型菌轉(zhuǎn)變成S型菌的因子,并把 此因子稱為轉(zhuǎn)化因子. 這種

2、一種生物由于接受了另一種生物 的遺傳物質(zhì)而表現(xiàn)出后者的遺傳性狀, 或發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象叫做轉(zhuǎn)化. 結(jié)論:轉(zhuǎn)化因子是DNA Avery等的轉(zhuǎn)化實驗 2、噬菌體感染實驗 1952，Hershey 在真 核生物中核小體的形成引入負超螺旋,在細菌 和古細菌中是DNA回旋酶引起超螺旋. DNA的不同形式有： 環(huán)狀和線狀 通常細菌的染色體DNA，質(zhì)粒DNA， 以及真核生物的線粒體DNA和葉綠體DNA 為環(huán)狀 二、DNA的復(fù)制特點 和幾種主要的復(fù)制方式 1. 基本概念 2. 復(fù)制起點與方向 3. Semi-Conservation Replication 4. 復(fù)制的方式 1. 基 本 概 念 ( Ba

3、sic Concept ) Watson Replicon; Replisome; 每一個復(fù)制起點及其復(fù)制區(qū)稱為一個復(fù)制單位 The multi protein (30 The multi protein (30) structure that assembles ) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA at replicating fork to undertake synthesis of DNA 復(fù)制機理的復(fù)雜性 D.S. DNAS.S. DNA 能量的供求 構(gòu)型的變化 超螺

4、旋線狀，開環(huán)狀 多種酶類的互作Replisome DNA復(fù)制起始控制機理知之甚少 復(fù)制的準(zhǔn)確性 （修復(fù)，校正） 研究試材的特殊性 （溫度敏感型ts，突變抑制體系Su） DNA復(fù)制速度(E.coli 105 bp/min ，高速解旋 112 km/h ?) 缺乏統(tǒng)一的模式 (D.S. DNA, S.S. DNA, Linear DNA.) 原核生物的復(fù)制起點（Origin of replication ， 簡稱ori）例如，E.coli 的oriC，長度為245bp 真核生物多個復(fù)制起點，例如釀酒酵母，約有 400個復(fù)制起點（autonomously replicatory sequence，A

5、RS），每個長度為100-200bp。 2. 復(fù)制起點與方向 （replication origin & direction ） isolation of ori rich AT & palindrom rich AT & palindrom Enzymes binding site Enzymes binding site 300 bp 300 bp in replication origin in replication origin 0f Prokaryote 0f Prokaryote AT rich 復(fù)制起點的特征 AT rich 真核生物復(fù)制起點的研究是以酵母為基礎(chǔ)的 ARS (a

6、utomatic Replication Sequence) 自主復(fù)制序列 ARS1 (A, B1,B2,B3) A區(qū)具有高度保守性 A/TTTTATG/ATTTA/T B區(qū)變化較大 “呼吸現(xiàn)象” DNA復(fù)制原點處氫鍵迅速斷裂與再生， 導(dǎo)致兩條DNA鏈不斷解鏈與聚合， 形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程。 在富含AT的區(qū)域內(nèi)尤為明顯 子鏈DNA延伸方向 DNA polymerase reacts on the 3 end onlyDNA polymerase reacts on the 3 end only New DNA elongation from 5 to 3 direction New DN

7、A elongation from 5 to 3 direction 進化中保留 的深刻的、 選擇與適應(yīng) 的、化學(xué)及 功能的根源 5 OH T C A T C A C 5 OH 3 ppp OH C + + ppi 如果DNA的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 ppp 因能量的需 要， DNA的5 端 必須帶有 PPP 游離dNTP 具有ppp ppp OH 3 A T C G 在0.2M Nacl 的生理環(huán)境中，磷酸 基團間的強電負性，使

8、dNTP難以 聚合到 DNA的5端，而且 雙鏈DNA的5端 堿基配對困難 需要其他機 制以解脫 堿基發(fā)生錯配后的校正 費時、費能、增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗 A T C G ppp OH + ppp A p OH T C G pp p OH T C G T C G pp p OH 3. DNA的半保留復(fù)制 （Semi-Conservation Replication） Three replication hypotheses (CsCl gradient centrifuge) (CsCl gradient centrifuge) N15 N14 DNADNA Semi-Conservati

9、on Replication M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958. 半不連續(xù)復(fù)制 （semi-discontinuous replicationsemi-discontinuous replication） 后隨鏈 前導(dǎo)鏈5 3 3 5 3 5 5 3 4. DNA復(fù)制的方式 (DNA replication model)(DNA replication model) 型復(fù)制 1963年，Cairns根據(jù)E.coli 的環(huán)狀染色體復(fù)制的中間 產(chǎn)物自顯影實驗提出的。 形狀象 “ ” 滾環(huán)方式 D.S. DNA Nick Elong

10、ation rolling 合成互補 鏈，形成 雙鏈 A蛋白識別 起點，產(chǎn)生 切口 polIII 催化 延長 正鏈 環(huán)化 形成 雙鏈 結(jié)構(gòu) 產(chǎn)生A 蛋白, 識別復(fù) 制起點 置換式 或 D-Loop （Displacement formDisplacement form） D.S. DNA In mitochondrial DNA In mitochondrial DNA also in chloroplasm DNA also in chloroplasm DNA S.S. DNA as template New S.S. DNA Displacement D-Loop 重鏈 復(fù)制 D- 環(huán)延

11、 伸 形成 D- 環(huán) 輕鏈 開始 復(fù)制 重鏈 復(fù)制 完成 輕鏈 正在 復(fù)制 輕鏈 復(fù)制 完成 封閉新合 成鏈上的 缺口 第三節(jié) 原核生物的染色體及其復(fù)制 v原核生物染色體 80%以上DNA RNA 蛋白質(zhì) 環(huán)狀雙鏈DNA分子存在于細胞內(nèi)相對集中的區(qū) 域，成為擬核。無核膜。 習(xí)慣上把原核生物的DNA分子也稱為染色體。 一、原核生物染色體的數(shù)目和大小 E.coli有1條環(huán)狀染色體，4.7Mb B.subtilis有1條環(huán)狀染色體，4.2Mb Agrobacterium tumefaciens有1條線性染色體， 2.1Mb；1條環(huán)狀染色體，3.0Mb。 二、細菌染色體的結(jié)構(gòu) 參與DNA折疊 的蛋白質(zhì)

12、類組蛋白與 DNA結(jié)合后，幫助 DNA進行高度折疊， 除類組蛋白外，DNA 還與其他蛋白質(zhì)相結(jié)合。 如與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和加工 有關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合在一 起，這樣，其環(huán)狀染色 體DNA以緊密纏繞的、 致密的、不規(guī)則小體形 式存在，該小體即是擬 核。電鏡下呈圓形或橢 圓形。 擬核： 三、細菌染色體的復(fù)制 細菌的復(fù)制基因與酶類 Initiate genes dna B prepriming 300kd 20 copies/cell hexamer RNApol primase for leading S. dna C acts with dnaB 25kd dna G primase for lagging

13、 S. 60kd 25 (Okazaki fragment ) monomer SSB Binding with S.S.DNA 74kd 300 Prevents from anneal monomer Elongate genes dnaE DNA polymerase III() 140kd 20 dnaZ DNA polymerase III() 52kd 20 polA DNA polymerase I 109kd 400 polB DNA polymerase II 90-120kd 100 Topoisomerase topA TopI (swivelase) 100kd sup

14、erhelix D.S.helix Topoisomerase gyr TopII (gyrase) gyr D.S.helix superhelix Cut D.S. DNA ATP Ligate Topoisomerase rep Relaxed protein (Helicase) D.S. DNA S.S. DNA lig Ligase HDP Helix Di-stabilizing Protein No ATPase Binding S. S. DNA decrease Tm Prevents from anneal b) DNA聚合酶 （DNA polymerase） Proka

15、ryoteProkaryote I polA 109KD 3-5和5-3外切酶活性 切除RNA引物和參與后隨鏈合成中的缺口填 充反應(yīng) II polB 3-5外切酶活性 III 10種不同的亞基組成 核心酶和全酶 Top I , Top II Helicase (rep protein) Single Strand Binding protein (SSB) Helix destabilizing protein (HDP) DnaB protein DnaC protein Primase Ung-ase DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligase f

16、or primosome 復(fù) 制 體 進 化 中 形 成 了 靈 活 的 多 酶 復(fù) 合 體 replisome 進 化 中 形 成 了 靈 活 的 多 酶 復(fù) 合 體 replisome 位于復(fù)制叉處的多酶復(fù)合體 完成 lagging Strand DNA延伸時 必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎片段 In lagging Strand 多酶系統(tǒng) 必須完成多次反復(fù)的啟動與擴展 E.coli 啟動20004000次的岡崎片段復(fù)制 Replisome modelReplisome model 復(fù)制起點 AT豐富DNA識別位點 DNA box 5-TTATCCACA-3 13個富含AT的單核苷酸

17、5-GATCTNTTNTTTT-3 大腸桿菌染色體復(fù)制起點oriC 的結(jié)構(gòu) DNA復(fù)制過程 鏈的生長原理 起始階段: 識別oriC 起始階段: 雙鏈分開 起始階段: 引物的合成 延伸階段: The termination of DNA replication E.coli (單起點雙方向) 兩復(fù)制叉的相遇處具有多個終止位點(不是復(fù)制叉簡單相遇） terE, D, A terF, C, B (22bp保守區(qū)) F B Terminus Utilization Substance（TUS 36kd） C A D ETer-TUS復(fù)合體 終止階段: terE, D, A 僅對反時針方向的復(fù)制叉具有終

18、止效應(yīng) terF, B, C 僅對順時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng) F B C A D E Ter-TUS復(fù)合體 (Rep. fork trap) 終止DnaB(螺旋酶) 防止DNA過度復(fù)制 避免出現(xiàn)DNA多聚體，高拷貝 四、細菌染色體的分離機制 第五節(jié)基因結(jié)構(gòu)和基因組 v基因結(jié)構(gòu)和基因概念的發(fā)展 v基因組學(xué) v大腸桿菌的基因組 vX174噬菌體的基因組 v真核生物的基因組及其特點 原核基因結(jié)構(gòu):-35,-10區(qū)的特征 真核基因結(jié)構(gòu):增強子,外顯子,內(nèi)含子 一、基因結(jié)構(gòu)和基因概念 基本概念 vgene vpromoter vORF vterminator vIntron vexon vTATA box vCAAT box vEnhancer vsilencer overlapping gene split gene pseudogene movable gene 二、基因組學(xué) 基因組的大小: 病毒103bp 原核生物106bp 真核生物109bp 基因組:單倍體細胞核內(nèi)整套染色體所含的 DNA分子及其所攜帶的全部基因 Map of the Mycoplasma genitalium genome Map of the Haemophilus influenzae genome 基因組學(xué)的發(fā)展 E. c