第三章蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離分析

1、第三章蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第三章蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 及分離分析及分離分析 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 一、兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)一、兩性性質(zhì)及等電點(diǎn) 二、膠體性質(zhì)二、膠體性質(zhì) 三、變性與復(fù)性作用三、變性與復(fù)性作用 四、蛋白質(zhì)的沉淀作用四、蛋白質(zhì)的沉淀作用 五、沉降作用五、沉降作用 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì) 一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈側(cè)鏈上存在游離的上存在游離的 氨基氨基和和羧基羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩 性解離性質(zhì)，具有特定的性解離性

2、質(zhì)，具有特定的等電點(diǎn)（等電點(diǎn)（pI）。 溶液溶液pHpI時(shí)時(shí)，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等；，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等； pHpI時(shí)時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷；，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷； pHpI時(shí)時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。 蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用 F 理論上：理論上： 研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能,分子量測(cè)定分子量測(cè)定,亞單位拆分；亞單位拆分； F 生產(chǎn)生活中有利的一面：生產(chǎn)生活中有利的一面： 食品加工，消毒滅菌等；食品加工，消毒滅菌等； 非蛋白生物物質(zhì)提取純化，終止酶促反應(yīng)；非蛋白生物物質(zhì)提取純化，終止酶促反應(yīng)； F 生產(chǎn)生活中不利的一面：生產(chǎn)生活中不利的一面：

3、活性蛋白制品（酶、抗體）的分離提取和保存；活性蛋白制品（酶、抗體）的分離提取和保存； ; Whats salt precipitation of protein? 蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 |常用的中性鹽：常用的中性鹽：硫酸銨硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。、氯化鈉、硫酸鈉等。 |鹽析時(shí)，鹽析時(shí)，pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好。在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好。 |鹽析沉淀蛋白質(zhì)通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。鹽析沉淀蛋白質(zhì)通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。 |優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) |鹽析應(yīng)用舉例鹽析應(yīng)用舉例 （1）鹽析鹽析中性鹽沉淀中性鹽沉淀 蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法蛋白質(zhì)仍能保持

4、生物活性的沉淀方法 & 分段鹽析：分段鹽析： 半飽和半飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較大的血漿硫酸銨溶液可沉淀分子量較大的血漿 球蛋白球蛋白, ,而而飽和飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較小的硫酸銨溶液可沉淀分子量較小的 血漿清蛋白。血漿清蛋白。因此因此,使用使用不同濃度不同濃度的硫酸銨溶液的硫酸銨溶液 就可將分子量不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行初步分離。就可將分子量不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行初步分離。 （1）鹽析鹽析中性鹽沉淀中性鹽沉淀 凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，如乙醇、凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，如乙醇、 甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質(zhì)。甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質(zhì)。 &沉淀原理：沉淀原理： 脫水作用脫

5、水作用破壞水化膜；破壞水化膜； 使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。 （2）有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法 蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 & 處理?xiàng)l件處理?xiàng)l件： 低溫操作；低溫操作； 沉淀完全后盡快分離；沉淀完全后盡快分離； （2）有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法 蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 & 機(jī)制機(jī)制：破壞電荷，等電點(diǎn)沉淀。破壞電荷，等電點(diǎn)沉淀。 （3）酸沉淀法酸沉淀法 （1 1）重金屬鹽沉淀法）重金屬鹽沉淀法 （2 2）生物堿試劑沉淀法（除蛋白作用）生物堿試劑沉淀法（除蛋白作用）

6、（3 3）熱凝固沉淀法）熱凝固沉淀法 （4 4）抗體對(duì)抗原蛋白質(zhì)的沉淀）抗體對(duì)抗原蛋白質(zhì)的沉淀 3.沉淀方法：沉淀方法： | 沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 | 沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法 四、蛋白質(zhì)的沉淀作用四、蛋白質(zhì)的沉淀作用 沉降的概念沉降的概念 沉降速率：沉降速率：v=dx/dtv=dx/dt 沉降常數(shù)與單位沉降常數(shù)與單位 應(yīng)用：應(yīng)用： 沉降速度法測(cè)定分子量的原理；沉降速度法測(cè)定分子量的原理； 梯度離心分離蛋白質(zhì)（氯化銫）；梯度離心分離蛋白質(zhì)（氯化銫）； 五、蛋白質(zhì)的沉降作用五、蛋白質(zhì)的沉降作用 六

7、、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 1. 雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) 2. 茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng) 3. 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250 4. 福林酚試劑反應(yīng)福林酚試劑反應(yīng) 5. 黃色反應(yīng)黃色反應(yīng)-芳香族氨基酸的特有反應(yīng)芳香族氨基酸的特有反應(yīng) 6. 米倫氏反應(yīng)米倫氏反應(yīng)酪氨酸的特有反應(yīng)酪氨酸的特有反應(yīng) 7. 乙醛酸反應(yīng)乙醛酸反應(yīng)色氨酸的特有反應(yīng)色氨酸的特有反應(yīng) 8. 坂口反應(yīng)坂口反應(yīng)精氨酸特有的反應(yīng)精氨酸特有的反應(yīng) 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 1. 雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) 兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色復(fù)合物粉紅色復(fù)合物 含有兩個(gè)或兩個(gè)以上含有

8、兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣反應(yīng)的化合物，能發(fā)生同樣反應(yīng) 肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深，肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深，粉紅，紫紅，藍(lán)紫粉紅，紫紅，藍(lán)紫 受蛋白質(zhì)特異性影響小受蛋白質(zhì)特異性影響小 蛋白質(zhì)定量測(cè)定；測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度蛋白質(zhì)定量測(cè)定；測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 2. 茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng) 靈敏度差。靈敏度差。 3.考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250 |本身為棕色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色本身為棕色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色 |與蛋白的親和力強(qiáng)，靈敏度高與蛋白的親和力強(qiáng)，靈敏度高 |1-10001-1000微克微克/ /毫升毫升 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、

9、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 4. 福林酚試劑反應(yīng)福林酚試劑反應(yīng) r酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)）酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)） r福林試劑：磷鉬酸福林試劑：磷鉬酸- -磷鎢酸磷鎢酸 r與雙縮脲法結(jié)合與雙縮脲法結(jié)合-Lowry法法 在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)- -銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生 磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物 靈敏度提高靈敏度提高100100倍倍 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 5. 黃色反應(yīng)黃色反應(yīng)-芳香族氨基酸芳香族氨基酸的特有反應(yīng)的特有反應(yīng) |濃硝酸與濃硝酸與酪氨酸、色氨

10、酸酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)的反應(yīng) |生成黃色化合物生成黃色化合物 |指甲、皮膚、毛發(fā)指甲、皮膚、毛發(fā) 6. 米倫氏反應(yīng)米倫氏反應(yīng)酪氨酸酪氨酸的特有反應(yīng)的特有反應(yīng) | 酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)）酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)） | 米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝 酸汞的混合物酸汞的混合物 | 蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉 淀，加熱后變成紅色淀，加熱后變成紅色 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 7. 乙醛酸反應(yīng)乙醛酸反應(yīng)色氨酸色氨酸的特有反應(yīng)的特有反應(yīng) |在蛋白質(zhì)溶液中加在蛋白質(zhì)溶液中加入入HCOCOOH，

11、將濃，將濃 硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液 面交界處，即有紫色環(huán)形成面交界處，即有紫色環(huán)形成 |色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)） |鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸 |明膠中不含色氨酸明膠中不含色氨酸 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 8. 坂口反應(yīng)坂口反應(yīng)精氨酸精氨酸特有的反應(yīng)特有的反應(yīng) |精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)）精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)） |精氨酸與精氨酸與-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴 酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物 |鑒定蛋白質(zhì)中是否

12、含有精氨酸鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸 |定量測(cè)定精氨酸定量測(cè)定精氨酸 七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì) y大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、 酪氨酸和色氨酸。酪氨酸和色氨酸。 y這三種氨基酸在這三種氨基酸在280nm 附近有最大吸收。附近有最大吸收。 因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強(qiáng)附近顯示強(qiáng) 的吸收?？梢詫?duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。的吸收?？梢詫?duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。 y蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） =1.45A2800.74A260 蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化 一、分離純化的基本方法一、

13、分離純化的基本方法 1 1、鹽析與等電點(diǎn)沉淀、鹽析與等電點(diǎn)沉淀-根據(jù)根據(jù)溶解度溶解度不同分離不同分離 2 2、層析法、層析法 離子交換層析法離子交換層析法-根據(jù)根據(jù)電荷電荷不同分離不同分離 凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法-根據(jù)根據(jù)分子量、分子形狀分子量、分子形狀不同分離不同分離 親和層析親和層析-根據(jù)根據(jù)特異性親和力特異性親和力不同分離不同分離 3 3、梯度離心法、梯度離心法 2、層析、層析 層析（層析（chromatography）是一種利用混合物中是一種利用混合物中 各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相 （固定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)行分（固定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)行分 離分析的技術(shù)方法。離分析的技術(shù)方法。 Whats chromatography? 主要的層析技術(shù)有主要的層析技術(shù)有離子離子 交換層析交換層析，凝膠層析凝膠層析， 吸