液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中粘桿菌素和多粘菌素B的殘留量-文檔資料

1、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中粘桿菌素和多粘 菌素 B 的殘留量 Determination of Colistin and Polymycin B Residues in Milk by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spetrometry LIANG Xue-qi LIU Hong * HE Feng-qin （Zhongshan AgriculturalProducts Quality Supervision 流動(dòng)相如表1所示；柱溫30 C;流速為0.3 mL/min; 進(jìn)樣量20卩Lo 1.3.2質(zhì)譜條件。電離方式：ESI+，檢測(cè)模式：多反應(yīng)檢測(cè) (

2、MRM，毛細(xì)管電壓：4 000 V，干燥氣流量10 mL/min，干燥 氣溫度：350 C,霧化器壓力 40 psi，定性離子對(duì)、定量離子 對(duì)及碰撞能量如表2所示。 1.4 樣品前處理 1.4.1提取。準(zhǔn)確吸取5 mL牛奶于50 mL帶蓋離心管中， 加入5%高氯酸10 mL,搖床水平震蕩30 min，超聲提取10 min , 10 000 r/min 于4 C下離心8 min，把上清液轉(zhuǎn)移到用另一離 心管，殘?jiān)儆?%高氯酸5 mL清洗，超聲提取5 min，水平搖 床上震蕩10 min , 10 000 r/min 于4 C下離心5 min，合并上 清液，加入8 mL乙醚，水平搖床上震蕩 15

3、 min , 10 000 r/min 于4 C下離心8 min，吸取下清夜于試管中，以待凈化。 1.4.2凈化。以3 mL甲醇活化，再用3 mL純凈水平衡固相 萃取小柱，轉(zhuǎn)移樣品提取液至固相萃取柱，接著依次用5%甲醇 水溶液3 mL 2%丙酮水溶液3 mL, 3 mL純凈水淋洗，負(fù)壓抽干， 最后用0.2%甲酸/甲醇(3 : 7 V/V) 6 mL洗脫，洗脫液用標(biāo)有刻 度的玻璃試管收集，45 C下氮?dú)獯抵? mL以下。 1.4.3上機(jī)測(cè)定。濃縮液用 2 g/L甲酸定容至1 mL,漩渦 均勻，過0.22卩m針孔濾頭，轉(zhuǎn)移至樣品瓶，上機(jī)檢測(cè)。 2 結(jié)論與討論 2.1 色譜條件的選擇 由于粘桿菌素B

4、是由A和B 2種組分構(gòu)成的多肽類抗生素， 并且粘桿菌素中A和B所占比例大，因此該方法采用粘桿菌素A 和 B 的色譜峰面積加和作為定量標(biāo)記物。 試驗(yàn)中考察了 0.1%甲酸水 - 甲醇、 0.1%甲酸水 - 乙腈 +0.1%甲 酸、2 g/L 甲酸水-乙腈+0.1%甲酸 3種流動(dòng)相體系對(duì)分析效果的 影響，結(jié)果表明，采用 2 g/L 甲酸水 - 乙腈+0.1%甲酸作為流動(dòng)相 時(shí)粘桿菌素和多粘菌素 B藥物的離子化效率高，峰型好，靈敏度 高。 2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 粘桿菌素、多粘菌素B是多肽類抗生素，多肽類化合物帶有 多個(gè)電荷，根據(jù)粘桿菌素和多粘菌素 B的結(jié)構(gòu)特征，該試驗(yàn)選擇 ESI正模式作為電離模式

5、。采用1.0 g/mL的單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)液通過 兩通管進(jìn)入質(zhì)譜中對(duì)粘桿菌素、多粘菌素B的毛細(xì)管電壓、碎裂 電壓、 碰撞能等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化使化合物響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)， 其參 數(shù)如表 2 所示。 粘桿菌素和多粘菌素 B 在正離子模式下容易質(zhì)子化， 全掃描 在2001 000 u質(zhì)量范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)6個(gè)強(qiáng)度較大的準(zhǔn)分子離子 峰，分別為粘桿菌素 A的M+2H2+峰(m/z 585.6 )和M+3H3+ 峰(m/z 390.8 )(圖 1),粘桿菌素 B 的M+2H2+峰(m/z 578.5 ) 和M+3H3+峰(m/z 386.1 )(圖 2),多粘菌素 B 的M+2H2+ 峰(m/z 602.6 )和M+3H3+峰

6、(m/z 402.1 )(圖 3)。通過對(duì) 毛細(xì)管電壓、碎裂電壓、碰撞能等參數(shù)優(yōu)化，選擇響應(yīng)值相對(duì)最 大的 m/z 390.8 、m/z 386.1 和 m/z 402.1 為母離子。然后對(duì)其 母離子進(jìn)行子離子掃描，最后得出粘桿菌素A 的子離子分別是 101.1和384.9 ;粘桿菌素B的子離子分別是101.1和380.2 ; 多粘菌素B的子離子分別是101.1和396.2，其中選擇峰度相對(duì) 較大的 101.1 作為定量離子。 2.3 線性范圍和相關(guān)系數(shù) 在該試驗(yàn)條件下多粘菌素 B和粘桿菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃 度在 25、50、100、200、400、600、800、 1 000 ng/mL 各

7、取 20 卩L進(jìn)樣，記錄色譜圖，線性方程和相關(guān)系數(shù)，如表3所示。 2.4 方法檢出限、回收率和精密度 配置一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液， 做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線其線性方程、 相 關(guān)系數(shù)如表 3 所示。通過對(duì)空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液并以 3 倍信噪 比估算出(LOD S/N3)檢出限如表4所示。按照1.4方法進(jìn)行 LOD的加標(biāo)回收試驗(yàn)，吸取 5mL的空白樣品，分別加入 50、100、 200 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品，相當(dāng)于加入 10、 20、 40 ug/L 的粘桿 菌素和多粘菌素B,做5次平行試驗(yàn)，結(jié)果如表 4所示。 3 結(jié)論與討論 該試驗(yàn)建立了 LC-MS/MS法測(cè)定牛奶中粘桿菌素和多粘菌素 B殘留量的分析方法。樣品直接用高氯酸沉淀蛋白，乙醚去除脂 肪，通過 Strata-X 固相萃取柱凈化，經(jīng)氮吹濃縮后上機(jī)分析。 粘桿菌素和多粘菌素 B( LOD分別為4、7卩g/L ,定量下限(LOQ 為10卩g/L