實(shí)驗(yàn)室啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)講義[1]

1、實(shí)驗(yàn)室啤酒發(fā)酵講義一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?：熟悉靜止培養(yǎng)操作，觀察啤酒發(fā)酵過程，掌握發(fā)酵過程中一些指標(biāo)的 分析操作技能。二、實(shí)驗(yàn)原理 ：啤酒酵母將麥芽汁發(fā)酵， 產(chǎn)生酒精等發(fā)酵產(chǎn)物 （啤酒）。三、實(shí)驗(yàn)器材 ： . 100 升發(fā)酵罐。O. 0 10O BX 糖度表。（3）.10 C -30 C可調(diào)生化培養(yǎng)箱。培養(yǎng)基：. 麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基 1 0 Plato, 50 升，糖化制取。 . 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽汁加2瓊脂，自然 pH。 . 麥芽汁液體培養(yǎng)基：酵母擴(kuò)大培養(yǎng)用。菌種 ：啤酒生產(chǎn)用酵母菌株。四、實(shí)驗(yàn)步驟 ：（ 1 ）麥汁制備（ 2）酵母菌種分離純化與質(zhì)量鑒定（3）菌種擴(kuò)大培養(yǎng)（4）啤酒主發(fā)酵：麥汁 5

2、0升，10BX , 11 Ct接種量1.5 X 107個(gè)細(xì)胞/mL宀主發(fā)酵, 11 C, 57天t至4.0 BX時(shí)結(jié)束（嫩啤酒）。在主發(fā)酵過程中，每天測定下列項(xiàng)目：糖 度、細(xì)胞濃度、出芽率、染色率、酸度、a-氨基氮、還原糖、酒精度 、pH、雙乙酰。然后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，這些指標(biāo)為縱坐標(biāo)，疊畫于方格紙上。（ 5）后發(fā)酵五、作業(yè)要求（1）. 畫出發(fā)酵周期中上述上述指標(biāo)的曲線圖， 并解釋它們的變化。（ 2） . 記下操作體會與注意點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)一 協(xié)定法糖化試驗(yàn)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?協(xié)定法糖化試驗(yàn)是歐洲啤酒釀造協(xié)會（EBC推薦的評價(jià)麥芽質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)方 法，我們用該法進(jìn)行小量麥芽汁制備，并借此評價(jià)所用麥芽的質(zhì)量。二

3、、實(shí)驗(yàn)原理： 利用麥芽所含的各種酶類將麥芽中的淀粉分解為可發(fā)酵性糖類，蛋白質(zhì)分 解為氨基酸（具體參見理論部分第二節(jié)） 。三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑：1 實(shí)驗(yàn)室糖化器：由水浴和 500600 mL 的燒杯組成糖化儀器，杯內(nèi)用玻棒攪拌或用100 C溫度計(jì)作攪拌器（此時(shí)攪拌應(yīng)十分小心，以免敲碎水銀頭）。實(shí)驗(yàn)時(shí)杯內(nèi)液面應(yīng)始終低于水浴液面。最好采用專用糖化器：該儀器有一水浴，水浴本身有電熱器加熱和機(jī)械攪 拌裝置。水浴上有 48 個(gè)孔，每個(gè)孔內(nèi)可放一糖化杯，糖化杯由紫銅或不銹鋼制成，每一 杯內(nèi)都帶有攪拌器，轉(zhuǎn)速為 80100 轉(zhuǎn)/ 分，攪拌器的螺旋槳直徑幾乎與糖化杯同，但又不 碰杯壁，它離杯底距離只有12 mm。

4、2 白色滴板或瓷板，玻棒或溫度計(jì)。3 濾紙，漏斗，電爐。4 碘溶液， 0.02N： 2.5 克碘和 5 克碘化鉀溶于水中，稀釋到 1000 毫升。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 協(xié)定法糖化麥汁的制備（ 1 ）取 50g 麥芽，用植物粉碎機(jī)將其粉碎。（ 2）在已知重量的糖化杯（ 500600 mL 燒杯或?qū)Ｓ媒饘俦┲校湃?50g 麥芽粉， 加200mL 4647C的水，于不斷攪拌下在45C水浴中保溫 30分鐘。（3） 使醪液以每分鐘升溫1C的速度，升溫加熱水浴，在25分鐘內(nèi)升至70C。此時(shí)于杯內(nèi)加入 100 mL 70 C的水。（4）70 C保溫1小時(shí)后，在1015分鐘內(nèi)急速冷卻到室溫。（ 5）沖洗攪拌器

5、。 擦干糖化杯外壁， 加水使其內(nèi)容物準(zhǔn)確稱量為450g。（ 6）用玻棒攪動(dòng)糖化醪 ，并注于干漏斗中進(jìn)行過濾，漏斗內(nèi)裝有直徑20 厘米的折疊濾紙，濾紙的邊沿不得超出漏斗的上沿。（7）收集約100mL濾液后，將濾液返回重濾。過30分鐘后，為加速過濾可用一玻棒稍稍攪碎麥槽層。將整個(gè)濾液收集于一干燒杯中。在進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)前，需將濾液攪勻。2. 糖化時(shí)間的測定 在協(xié)定法糖化過程中，糖化醪溫度達(dá)70 C時(shí)記錄時(shí)間，5分鐘后用玻棒或溫度計(jì)取麥芽汁 1 滴，置于白滴板（或瓷板）上，再加碘液 1 滴，混合，觀察顏色變化。 每隔 5 分鐘重復(fù)上述操作， 直至碘液呈黃色 （不變色） 為止， 記錄此時(shí)間。由糖化醪溫度達(dá)

6、到 70 C開始至糖化完全無淀粉反應(yīng)時(shí)止，所需時(shí)間為糖化時(shí)間。 報(bào)告以每 5 分鐘計(jì)算：如 Cu （OH 2 J十NazSO氫氧化銅因能與酒石酸鉀鈉反應(yīng)形成絡(luò)合物而使沉淀溶解。酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物中的 二價(jià)銅是一個(gè)氧化劑，在氧化醛糖和酮糖（合稱總還原糖）的同時(shí)，自身被還原成一價(jià)的 紅色氧化亞銅沉淀：反應(yīng)終點(diǎn)用美藍(lán)（亞甲基藍(lán)）來指示。由于美藍(lán)的氧化能力較二價(jià)銅 弱，故待二價(jià)銅全部被還原糖還原后，過量一滴還原糖立即使美藍(lán)還原成無色的美白。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑： 電爐，滴定管等（1）斐林溶液甲液：稱取 3.4939g結(jié)晶硫酸銅（CuS04 5H2O），溶于50mL水中，如有不溶物須過濾。乙液：稱取13.

7、7g酒石酸鉀鈉，5g NaOH,溶于50mL水中，若有沉淀過濾即可。（2）0.2 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液：精確稱取于105 C烘至恒重的分析純葡萄糖0.5000g ,用水溶解后,加 2.5mL 濃鹽酸,定容成至250mL。1 %美藍(lán)指示劑：0.5g 美藍(lán)溶于50mL蒸餾水中。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 斐林溶液的標(biāo)定由于試劑的純度不同,配制時(shí)稱量、定容等有誤差,各人所配的斐林試劑氧化能力會有差異，因此有必要對斐林溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。配制準(zhǔn)確時(shí)，斐林甲、乙液各5mL可氧化25mL0.2 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。預(yù)滴定：準(zhǔn)確吸取斐林甲、乙液各5mL,放入250mL錐形瓶中，加水約 20mL,并從滴定管加入約 24mL 0.2

8、%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（如果斐林甲、乙液配制非常精確,從理論上說,應(yīng) 消耗25mL 0.2 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，故先加24mL），將錐形瓶置電爐上加熱煮沸，維持沸騰2 分鐘,加入 1%美藍(lán)指示劑 2滴,在沸騰狀態(tài)下,以每兩秒 1 滴的速度滴入 0.2%標(biāo)準(zhǔn)葡 萄糖溶液,至溶液剛由藍(lán)色變?yōu)轷r紅色為止。后滴定操作應(yīng)在1 分鐘內(nèi)完成,整個(gè)煮沸時(shí)間應(yīng)控制在 3 分鐘之內(nèi)。記下總耗糖量V。正式滴定：與預(yù)滴定基本相同，只是用（V-1 ） mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖代替 24mL葡萄糖液，最后在 1 分鐘內(nèi)滴定完成。2. 試樣的滴定 稀釋：將樣品除氣后，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以期用 1550mL（最好2030mL）稀釋液使滴定完 成。

9、一般麥汁稀釋 50 倍左右,啤酒主酵液稀釋 20 倍左右。 滴定： 基本同上,也分預(yù)滴定和正式滴定。只不過用樣品稀釋液代替標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液,由于預(yù)滴定時(shí)不知道需要多少毫升稀釋液,因此誤差較大。 正式滴定時(shí)先加入比預(yù)滴定少 1mL的稀釋液。正式滴定至少進(jìn)行 2 次。計(jì)算總還原糖量,以 100 mL 樣品中含有的葡萄糖克數(shù)來表示五、注意事項(xiàng)：(1) 指示劑美藍(lán)本身具有弱氧化性， 要消耗還原糖 所以每次用量應(yīng)保持一致。(2) 次甲基藍(lán)被還原為無色后，易被空氣氧化又顯藍(lán)色，所以滴定過程應(yīng)保持沸騰狀態(tài)， 使瓶內(nèi)不斷冒出水蒸汽，以防空氣進(jìn)入。(3) 反應(yīng)過程中不能搖動(dòng)錐形瓶，沸騰已可使溶液混勻。(4) 測定時(shí)

10、須嚴(yán)格控制反應(yīng)液體積，以保持一致的酸堿度。因此要控制電爐火力及滴定速 度。六、思考題 ：為什么要進(jìn)行預(yù)滴定？實(shí)驗(yàn)十a(chǎn)-氨基氮含量的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)a-氨基氮含量的測定方法，控制麥汁或啤酒質(zhì)量。二、實(shí)驗(yàn)原理：a-氨基氮為a-氨基酸分子上的氨基氮。水合茚三酮是一種氧化劑，可 使氨基酸脫羧氧化，而本身被還原成還原型水合茚三酮。還原型水合茚三酮再與末還原的 水合茚三酮及氨反應(yīng)，生成藍(lán)紫色縮合物，顏色深淺與游離a-氨基氮含量成正比，可在 570nm 下比色測定。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑：分光光度計(jì)，電爐等(1) 顯色劑 稱取10g NS2HPCO- 12H2O , 6g KHPQ , 0.5g水合茚三酮

11、，0.3g果糖，用水溶解并定容至100mL(pH 6.6 6.8 )，棕色瓶低溫保存，可用兩周。(2) 碘酸鉀稀釋液溶0.2g碘酸鉀于60mL水中，加40mL 95 %乙醇。(3) 標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸貯備溶液準(zhǔn)確稱取0.1072g甘氨酸，用水溶解并定容至100 mL 0 C保存。用時(shí) 100 倍稀釋。四、實(shí)驗(yàn)步驟(1)樣品稀釋適當(dāng)稀釋樣品至含 13卩g a-氨基氮/mL (麥汁一般稀釋 100倍，啤酒50 倍，啤酒應(yīng)先除氣) 。(2)測定 取9支10mL比色管，其中3支吸入2mL甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液， 另3支各吸入2mL 試樣稀釋液，剩下3支吸入2mL蒸餾水。然后各加顯色劑1 mL,蓋玻塞，搖勻，在沸水浴中

12、加熱I 6分鐘。取出，在 20C冷水中冷卻 20分鐘，分別加 5mL碘酸鉀稀釋液，搖勻。 在30分鐘內(nèi)，以水樣管為空白，在570nm波長下測各管的光密度。計(jì)算：a-氨基氮含量(卩g/mL)=(樣品管平均 O.D./標(biāo)準(zhǔn)管平均 O.D. )x 2X稀釋倍數(shù)說明： 式中(樣品管平均O.D./標(biāo)準(zhǔn)管平均 O.D.):表示樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管之間的a-氨基氮之比；2 :標(biāo)準(zhǔn)管的a-氨基氮濃度(卩g/mL)，即(0.1072 X 14/75 ) X 100 ；五、注意事項(xiàng)：(1) 必須嚴(yán)防任何外界痕量氨基酸的引入， 所用比色管必須仔細(xì)洗滌， 洗凈后的手只能 接觸管壁外部，移液管不可用嘴吸。(2) 測定時(shí)加入果

13、糖作為還原性發(fā)色劑，碘酸鉀稀釋液的作用是使茚三酮保持氧化態(tài)， 以阻止進(jìn)一步發(fā)生不希望的生色反應(yīng)。(3) 深色麥汁或深色啤酒應(yīng)對吸光度作校正：取2mL樣品稀釋液，加 1mL蒸餾水和5mL碘酸鉀稀釋液在 570n m 波長下以空白做對照測吸光度，將此值從測定樣品吸光度中減去。一、思考題： 啤酒色澤是否會對結(jié)果產(chǎn)生影響？附：分光光度計(jì)的使用：現(xiàn)以SP-2000UV紫外可見分光光度計(jì)為例介紹使用方法。a) 接通電源，預(yù)熱 20 分鐘，使儀器進(jìn)入熱穩(wěn)定狀態(tài)，儀器開始自檢；b) 自檢結(jié)束后，儀器自動(dòng)停留在 546nm處，并自動(dòng)調(diào)100%T和0%T當(dāng)儀器顯示“ 546”“100%T,即進(jìn)入測試狀態(tài)；c) 按

14、方式鍵(MOD)將測試方式設(shè)定為吸光度方式，儀器顯示“ XXXnm X.XXXAbs”d) 按波長設(shè)置鍵至所需要波長，如 570nm；e) 將參比溶液和被測溶液分別倒入比色杯中，插入比色槽中，蓋上樣品室蓋；f) 將參比溶液推入光路中，按“100%T鍵調(diào)整 “ 0Abs”；g) 將被測溶液推入光路中，讀取顯示器上的吸光度值；h) 搞好清潔衛(wèi)生工作。注意：比色杯貴重，應(yīng)格外小心。實(shí)驗(yàn)十一 酸度和 pH 的測定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆账岫群蚿H的測定方法，監(jiān)測啤酒發(fā)酵的進(jìn)程。二、 實(shí)驗(yàn)原理：總酸是指樣品中能與強(qiáng)堿(NaOH作用的所有物質(zhì)的總量，用中和每升樣品(滴定至 pH 9.0 )所消耗的1N NaO

15、H的毫升數(shù)來表示，但在啤酒發(fā)酵液的測定過程中常 用中和100mL除氣發(fā)酵液所需的 1N NaOH的毫升數(shù)來表示。啤酒中含有各種酸類約 100 種以上，生產(chǎn)原料、糖化方法、發(fā)酵條件、酵母菌種都會影響啤酒中的酸含量。其中包括揮發(fā)性的（甲酸、乙酸），低揮發(fā)性的（G、G、異C4、異C5、 C6、 C8、 C10 等脂肪酸）和不揮發(fā)性的（乳酸，檸檬酸，琥珀酸，蘋果酸以及氨基酸， 核酸，酚酸等）各種酸類。適宜的pH和適量的可滴定總酸，能賦于啤酒以柔和清爽的口感；同時(shí)這些酸及其鹽類也是酒中重要的緩沖物質(zhì)，有利于各種酶的作用。由于樣品有多種弱酸和弱酸鹽，有較大的緩沖能力，滴定終點(diǎn)pH變化不明顯，再加上樣品有色

16、澤，用酚酞做指示劑效果不是太好，最好采用電位滴定法。三、 實(shí)驗(yàn)器材與試劑：自動(dòng)電位滴定儀，或普通堿式滴定管，pH計(jì)。（ 1 ） 0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液（精確至 0.0001 mol/L ）（ 2） 0.05 酚酞指示劑： 0.05g 酚酞溶于 50%的中性酒精（普通酒精常含有微量的酸，可 用 0.1mol/L NaOH 溶液滴定至微紅色即為中性酒精）中，定容至100mL。四、實(shí)驗(yàn)步驟1酸度測定取 50mL 除氣發(fā)酵液，置于燒杯中，加入磁力攪拌棒，放于自動(dòng)電位滴定儀上，插入pH探頭，逐滴滴入 0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至 pH 9.0，記下耗去的 NaOH毫升數(shù)。若

17、無自動(dòng)電位滴定儀，可用下述酸堿滴定方法。取5mL除氣發(fā)酵液，置于 250mL三角瓶中，加 50mL蒸餾水，再加1滴酚汰指示劑，用 0.1mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色（不可過量 ） 經(jīng)搖動(dòng)后不消失為止，記下消耗的氫氧化鈉溶液的體積 VmL，計(jì)算總酸（1 mol/L NaOH 毫升數(shù)/ 100mL樣品）=20MV式中 M 為 NaOH 的實(shí)際摩爾濃度， V 為消耗的氫氧化鈉溶液的體積2 pH 測定現(xiàn)以PHS-3C型精密pH計(jì)為例來說明 pH的測定方法。PHS-3C型pH計(jì)是一種精密數(shù)字顯示pH計(jì)，它采用3位半十進(jìn)制 LED數(shù)字顯示。在使用前應(yīng)在蒸餾水中浸泡 24小時(shí)。接通電源后，先預(yù)熱

18、 30分鐘，然后進(jìn)行標(biāo)定。一般說來， 儀器在連續(xù)使用時(shí)，每天要標(biāo)定一次。（ 1 ） 選擇開關(guān)旋至 pH 檔；（ 2）調(diào)節(jié)溫度補(bǔ)償至室溫；（ 3）把斜率調(diào)節(jié)旋紐順時(shí)針旋到底（即調(diào)到100%位置）（ 4）將洗凈擦干的電極插入 pH6.86 的緩沖液中， 調(diào)節(jié)定位旋紐至 6.86 ；（5）用蒸餾水清洗電極，擦干，再插入pH4.00 的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，調(diào)節(jié)斜率至 pH4.00；6）重復(fù)（ 4），（5），直至不用再調(diào)節(jié)定位和斜率兩旋紐為止。（ 7）清洗電極，擦干，將電極插入發(fā)酵液中，搖動(dòng)燒杯，使均勻接觸，在顯示屏中讀 出被測溶液的 pH 值。（ 8）關(guān)閉電源，清洗電極，并將電極保護(hù)套套上，套內(nèi)應(yīng)放少量補(bǔ)充

19、液以保持電極球 泡的濕潤，切忌浸泡于蒸餾水中。五、注意事項(xiàng) 發(fā)酵液中的二氧化碳必須徹底去除。0.1mol/L NaOH 必須經(jīng)過標(biāo)定，保留 4 位有效數(shù)。六、思考題 ：酸堿滴定時(shí)為什么要用水稀釋？水的酸堿度對滴定結(jié)果有什么影響？實(shí)驗(yàn)十二 比重的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?：了解比重的測定方法，監(jiān)測發(fā)酵過程中浸出物濃度的變化。二、實(shí)驗(yàn)原理： 在一定溫度下，各種物質(zhì)都有一定的比重。當(dāng)物質(zhì)純度改變時(shí)，比重也隨 著改變，故測定比重可檢驗(yàn)物質(zhì)的純度或溶液的濃度。如在啤酒發(fā)酵中，隨著糖分的消耗、 酒精和 CO2 的產(chǎn)生，比重會逐漸下降，因此可通過測定發(fā)酵液的比重來了解發(fā)酵過程。溶解于水中的固體物質(zhì)稱為固形物，以重量

20、百分濃度表示。在啤酒發(fā)酵液中，固形物 的含量常以蔗糖的重量百分比來表示。但是發(fā)酵液固形物還包括許多非糖成分，這些非糖 成分對溶液比重的影響與蔗糖不一樣，但為了方便起見，可假定非糖物質(zhì)對溶液比重的影 響程度和蔗糖相等。 因此，根據(jù)比重查知的固形物含量實(shí)際上只是一個(gè)近似值。麥汁和啤酒發(fā)酵液樣品20C的比重規(guī)定為：在空氣中，20C樣品與同體積 20C水的重量之比值。三、實(shí)驗(yàn)儀器： 測定比重常用的是比重瓶和比重計(jì)。 比重計(jì)方便， 但精確度低 （見實(shí)驗(yàn)四） 比重瓶精確，但測定很費(fèi)時(shí)。比重瓶有多種的形狀，常用的規(guī)格為25mL,比較好的一種是帶有特制溫度計(jì)并具有磨口帽小支管的比重瓶（見圖）。比重以相同溫度下

21、，同體積的溶液和純水之間的重量比來表示。比重瓶示意圖四、實(shí)驗(yàn)步驟：(1) 空瓶稱重：將比重瓶洗干凈后，吹干或低溫烘干(可用少量酒精或乙醚洗滌)，冷卻至室溫，精確稱重至O.lmg。(2) 稱水重：將煮沸 30分鐘并冷卻至1518 C的蒸餾水裝滿比重瓶(注意瓶內(nèi)不要有氣飽)。裝上溫度計(jì)。立即浸入20 0.1 C的恒溫水浴中，讓瓶內(nèi)溫度計(jì)在20 C下保持20分鐘，取出比重瓶用濾紙吸去溢出支管外的水，立即蓋上小帽，室溫下平衡溫度后，擦干瓶壁上的水，精確稱重。(3) 樣品稱重：倒出蒸餾水，用少量除氣樣品洗滌后，加入冷卻至1519C的樣品， 按( 2)測得樣品重量。(4) 比重計(jì)算：比重瓶和樣品重一 空瓶

22、重樣品比重 =比重瓶和蒸餾水重一空瓶重(5) 查表：查閱比重-浸出物對照表。啤酒外觀濃度和實(shí)際濃度的測定成品啤酒或發(fā)酵液中所含的浸出物的重量百分?jǐn)?shù)稱為濃度。由于啤酒和發(fā)酵液中有一 部分酒精，酒精比水輕，故采用比重法測得的濃度，要稍低于實(shí)際濃度，習(xí)慣上稱為外觀 濃度。將酒精分和 CQ除去后測得的濃度稱為實(shí)際濃度。因此實(shí)際濃度較為準(zhǔn)確，并可以此來計(jì)算原麥芽汁濃度。(1) 外觀濃度的測定：同上。(2) 實(shí)際濃度的測定： 在普通天平上用干燥的燒懷稱取已除CQ的發(fā)酵液或啤酒樣品100.0g，置80C水浴中蒸發(fā)酒精，蒸至原體積的1/3時(shí)，冷卻，加蒸餾水至內(nèi)容物100.0g ,充分混勻，用比重瓶準(zhǔn)確測定20C時(shí)的比重，查表求得實(shí)際濃度。加熱過程中可能有蛋白質(zhì)沉淀，測定比