DNA-ladder-protocol細(xì)胞凋亡操作步驟

1、也希望大家批評(píng)指正!注：黑色字體部分為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南P 108 109的內(nèi)容（完全一樣），其中紅色部分 為我的改動(dòng)以及一些建議，希望您能成功！三、DNA裂解分析凋亡的標(biāo)準(zhǔn)特征之一，是基因組DMA斷裂為180-200bp的多條寡核小 體片段。此現(xiàn)象可用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，是凋亡的特征。由于該技術(shù)只 能提供細(xì)胞死亡的定性分析，一般要結(jié)合定量的方法以確定樣品的凋亡程度。 另有需注意的重要之處，一些細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞系（如K562, 10T1/2, Raji）在凋 亡時(shí)不是以此種方式斷裂DNA,另外在壞死細(xì)胞中也不發(fā)生這樣的DNA裂解。 這不是凋亡細(xì)胞的限定性試驗(yàn)，但不論在何系統(tǒng)中，這都是確定細(xì)胞死亡有

2、用 的特性。DNA裂解測(cè)量有幾種方法，包括FACS分析和完整的標(biāo)記DNA的檢 測(cè)。另一種方法TUNEL,需DNA末端標(biāo)記，用于單個(gè)細(xì)胞DNA裂解的測(cè)定。凋 亡常常伴隨有D5IA的裂解，這些技術(shù)在凋亡測(cè)量中都有意義。（一）瓊脂糖凝膠電泳1）將5X105細(xì)胞移人無(wú)菌的Eppendorf管中，4 C 2000 r/min離心5分 鐘，棄上清。注意不要使用過(guò)多的細(xì)胞，否則隨后的酶解可能不完全，形成很黏稠的DNA溶液。借軍注:細(xì)胞接種數(shù)：我一般是將細(xì)胞按照5X10s細(xì)胞/35nun平皿接種然后培養(yǎng)兩天（因?yàn)榻臃N后的細(xì)胞 有部分會(huì)死亡所以培養(yǎng)一天的細(xì)胞可能會(huì)少個(gè)人覺(jué)得培養(yǎng)兩天比較合適細(xì)胞不要太 多 了 ！

3、）然后再加藥物處理處理時(shí)問(wèn)看您藥物的類(lèi)型柯劑量不過(guò)建議您做幾個(gè)梯度同時(shí)進(jìn)行這 樣可以看出劑量和時(shí)問(wèn)對(duì)細(xì)胞凋亡的彩響程度我當(dāng)時(shí)做的是每隔8h測(cè)量一次太累建議您毎隔 12h或者21h訓(xùn)量一次 離心速度：我是2000 r/min 5分鐘按照我實(shí)驗(yàn)室濟(jì)心機(jī)換算RCF（相對(duì)離心力） 為 367g 細(xì)胞收集：姑壁細(xì)胞需要把漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞（胰酶消化）一起收集，離心，然后用 預(yù)冷的PBS再洗滌一次注意丟棄上清液要小心注意不要把細(xì)胞吸走了，我一般使用51和兩個(gè)移液槍來(lái)操作的 lml取走大部分上清夜把剩余的小心取走！2）加入 20p 1 溶解緩沖液20 mmol/L EDTA, 100 mmoll/L Tri

4、s, , % （w/v）SDS o用移液管尖混勻細(xì)胞沉淀。小心：SDS（見(jiàn)附錄5）不要形成強(qiáng)的疵渦，因?yàn)楦叻肿恿緿NA可能被剪切。儲(chǔ)軍注：加入溶解圾沖液前：雖然上清液被丟棄但是一般在管底還是有少量上清液此時(shí)可以用食指経 彈管底使徉細(xì)胞沉淀盡可能舷解為加入溶解緩沖液后混勻創(chuàng)造條件。 溶解緩沖液的配制：把EDTA.Tris-base.SDS放在一起攪拌混勻，使用pH計(jì)測(cè)得其pll值大槪 在左右根本不需要加HCL調(diào)pH值！只要你的試劑好（flukffl amresco、sigma） 這些經(jīng)典方法基本上都不需要調(diào)pH值.真的很準(zhǔn)，上下而巳。 混勻細(xì)胞.1：有了這步應(yīng)該可以很好做了.把杞液面下，： F按

5、鈕（很重要否則溶液里有很多泡導(dǎo)致濬解霞沖液沒(méi)有充分混勻啊!），只是形成暗流崔液面下涌動(dòng) 體 不放出來(lái)自然無(wú)氣泡！3）加 lOp 1 RNA 酶 A/T1 混合液（分別為 500U/ml, 20000U / ml, Ambion Inc.）,輕彈管尖混勻，不要形成旋渦。37&C孵育30-120分鐘。儲(chǔ)軍注：混勻：方法同2）我釆用37X2孵育120min也采用過(guò)90min效果一樣RNA酶A/T1混合液：我只是配了 500U/ml的RNA WA.不需要T1 效果也是很好！而且 我的RNA 也沒(méi)有進(jìn)行烹沸處理不過(guò)最好是處理一下了！ 將封口膜將EP管封好以免EP管中的液體蒸發(fā)4）加10R 1蛋白酶K（2

6、0mg/mU Ambion）,輕彈管尖混勻，5（TC孵育至少 90min,也可過(guò)夜。儲(chǔ)軍注：在加蛋白晦K之前.輕輕將EP甩幾下使得貼在管壁和管蓋上的水滴流至管底 我釆用55X?水浴時(shí)問(wèn)曾用過(guò)3h.4h.6h過(guò)夜效果差不多根據(jù)您自己的個(gè)人時(shí)問(wèn)決定比如你 現(xiàn)在需要陪血看碟了 就讓它過(guò)夜吧沒(méi)關(guān)系的了！ 加入蛋白酶K后.溶液立即出現(xiàn)絮狀白色物，蛋白晦K是冷的緣故，加到37X：的裂解液自然 會(huì)出現(xiàn)絮狀物，再涌動(dòng)涌動(dòng)（同2） ） 然后再放入55T 段時(shí)問(wèn)就消失了.不是什么怪現(xiàn)象 將封口膜將EP管封好以免EP管中的液體薫發(fā) 做完后輕輕將EP甩幾下使得貼在管墅粗管蓋上的水潼流至管底這時(shí)可以進(jìn)行電泳或 在-20

7、匸保存以后罠電泳5）加5卩1 6XDNA加樣緩沖液（30%甘油，0. 25%漠酚藍(lán)），在含u g/ml漠化 乙錠TAE的1 % %瓊脂糖凝膠干孔中加DNA樣品。小心：甘油；謨酚藍(lán)；謨化乙錠（見(jiàn)附錄5）為了避免由于某些制備液黏稠而致DNA樣品損失，推薦加樣應(yīng)在干孔中（電泳池中加入緩沖液之前）。參考 加樣量為lOObp大小。借軍注：膠濃度：】綣/%的我都用過(guò)但是發(fā)現(xiàn)效果不好建議使用2%我就是用的2%電泳相關(guān)參數(shù)：最好選擇24Y/cm電壓，用大的電泳槽（10cm以上）我使用23cm電泳槽. 電壓為 45V 跑 6h30min如樣緩沖液：我一般每孔加20p 1樣品+4|1 I 10X loading

8、buffer（加液緩沖液用量加倍了. 要是為了使樣品中的DNA樣品能否充分沉積在孔中）6）低電壓電泳，可以促進(jìn)DNA片段的分離（如35V, 4小時(shí)，或至染料泳動(dòng)到 2/3 處）o儲(chǔ)軍注:當(dāng)膠放入電泳槽后小心加TAE以免孔中的樣品流到外面跑電泳過(guò)程注意不要魂歪了 不時(shí)調(diào)整一下電泳槽的水平7）DNA序列梯最后有紫外光顯示，攝影。凋亡細(xì)胞形成明顯的DNA梯度，而壞 死細(xì)胞為不清晰的成片條帶（或無(wú)DMA裂解）?；罴?xì)胞DXA在膠頂部，是一個(gè)髙 分子量條帶。凋亡并不超能形成梯度，這取決于所研究的細(xì)胞類(lèi)型。另外，壞死細(xì)胞在某些情況下能產(chǎn)生梯度。 凋亡中如發(fā)生DNA裂解，通常會(huì)失去膜整合性。如因生存力喪失梯度

9、形成明顯遲緩，則不像是凋亡發(fā)生。 儲(chǔ)軍注：我一般泡20min EB吧然后將它在水龍頭下輕輕漂洗4、5遍然后開(kāi)始照相了 最好使用礙膠成像 系統(tǒng)進(jìn)行拍照這樣效果好數(shù)碼相機(jī)效果不是特別好注斎事項(xiàng)建議使用寬口移液管移取基因組DMA,以避免DNA的剪切。寬口吸頭可從商 業(yè)途徑獲得，或?qū)?00R 1吸頭尖切掉而制得。吸頭應(yīng)髙壓滅菌，避免DNA酶污 染。可以不在瓊脂糖凝膠中直接加入漠化乙唳，而是電泳后用含1H lg/m 1漠化 乙唳的TAE緩沖液染1小時(shí)，用水脫色后進(jìn)行DNA顯色。儲(chǔ)軍注：我第一次做DNA LADDER實(shí)軽時(shí)是自己做的寬口吸頭但后來(lái)發(fā)現(xiàn)其實(shí)沒(méi)必要直接使用已滅過(guò)萌 的tip頭效果一樣只要在操作

10、過(guò)程小心就行了！實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下（一）細(xì)胞凋亡|結(jié)果說(shuō)明：細(xì)胞為SP2/0 （鼠骨髓瘤細(xì)胞），lOug/ml順鎧（終濃度）處理，每隔8h,進(jìn)行分L迂二析.凝膠兩端為lamda marker,從左至右分別為空白（未用順鈾處理），處理8h. 16h、24h. 32h.40h.48h. 56h. 64h、72h,我可是連續(xù)奮斗了三個(gè)晚上咆，好累，不過(guò)值得，結(jié)果 非常不錯(cuò)！:）隨著時(shí)間的累積，細(xì)胞凋亡程度在加大一切都很明顯?。ǘ┘?xì)胞壞死結(jié)果說(shuō)明：細(xì)胞為SPC-A1 （人源肺癌細(xì)胞），lOug/ml順鎧（終濃度）處理，每隔8h,進(jìn)行分 析凝膠兩端為lamda marker,從左至右分別為空白（未用順鈾處理

11、），處理8h、16h、 24h. 32h、40h. 48h、56h. 64h、72h,我可是連續(xù)奮斗了三個(gè)晚上啊，好累，不過(guò)值得， 結(jié)果非常不錯(cuò)！ : ） 隨著時(shí)間的累積,細(xì)胞壞死程度在加大一切都很明顯！ 說(shuō)明：本來(lái)不想將結(jié)果列出的有點(diǎn)怕有人將我的結(jié)果當(dāng)作自己的成果我不希望有這種情況 出現(xiàn)畢竟造假是不道德的！祝大家新年快樂(lè)!實(shí)驗(yàn)順利！儲(chǔ)軍2004-1-9于華中科技大學(xué)【求助】DNA瓊脂糖凝膠電泳方法我準(zhǔn)備做D7A瓊脂糖凝膠電泳請(qǐng)教下列幾個(gè)問(wèn)題：酶一A/T1混合液中A/T1是什么，它有什么作用？2.離心后DNA是存在上淸液中還是在沉淀中？3將上清液在等體積的苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1異丙

12、醇（25:24:1）和氯仿中各 提取1次這一步的作用是什么？4.在上淸液中加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積的冷無(wú)水乙醇，一20乜靜置過(guò)夜.這 一步作用又是什么？另：如有全面的操作過(guò)程請(qǐng)公布一下！非常感謝！2. 2. 1. 1細(xì)菌中質(zhì)粒D7A的制備堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA1）挑取培養(yǎng)基上的白色單菌落，接種于5ml含適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩 培養(yǎng)過(guò)夜；2）取菌液于小離心管中,13000離心l-2min,富集菌體,重復(fù)一次;3）菌體沉淀重懸于300ul溶液I中，振蕩混勻；4）加入新鮮配置的300ul溶液II上下顛倒混勻，冰上放置lOmin；5）加入300ul溶液III,輕

13、輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰上放置5分鐘；6）室溫 13000rpm 離心 15min；7）取上清,加入等體積的Tris-中性酚，混勻后13000rpm離心lOmin；8）取上淸，再用等體積氯仿抽提一次；9）取上淸，加入2倍體積無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻至少5min,-20X：放置30min；10）13000rpm 離心 15min；11）棄上清，抽干后溶于適量雙蒸水中。質(zhì)粒提取所需的溶液：液液液溶溶溶I: 50mmol/L Tris-Hcl ； 10mmol/L EDTA（pH ； 125ug/ml RNase A；II: L NaOH； 1% SDS；III: L KAC 苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1異丙醇（25:24:1）和氯仿中各提取1次使蛋白質(zhì) 變性和抽提蛋白的作用.在上淸液中加入1/10體積3mol/L醋酸鈉M使截裂解變性質(zhì)粒DNA復(fù)性，而基因組D NA由于過(guò)大而不能及時(shí)復(fù)性而和蛋白一起纏繞沉淀2倍體積的冷無(wú)水乙醇，一20工靜置過(guò)夜”是充分洗除殘留的苯酚/氯仿和使質(zhì)粒DN A沉淀的作用.至于H RNAW-A/T1混合液中A/T1是什么，它有什么作用中的A/T1我沒(méi)有聽(tīng)說(shuō)過(guò)，也不 知