實(shí)驗(yàn)4細(xì)胞骨架的顯示及觀察學(xué)習(xí)資料

1、精品文檔一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握用考馬斯亮藍(lán) R250染色觀察動(dòng)物和植物細(xì)胞骨架的原理和方法。2. 了解免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞成分的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1.2.包括微，MF）、中間纖維（in termediated實(shí)驗(yàn)4細(xì)胞骨架的顯示及觀察姓名：李思露學(xué)號(hào)：131140040細(xì)胞骨架：指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、 細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)。狹義的細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)骨架，管（microtubule ， MT）、微絲（microfilamentfilament ， IF ）。微管微管是細(xì)胞內(nèi)由微管蛋白形成的直徑約 2026 nm的長(zhǎng)度不一的小管。分布在核周

2、圍， 呈放射狀向胞質(zhì)四周擴(kuò)散，主要確定膜性細(xì) 胞器的位置和作為膜泡運(yùn)輸?shù)膶?dǎo)管。微管蛋 白有a和B 兩種。a B異二聚體沿縱向聚 合成絲，原絲成環(huán)狀排列形成微管的壁。微管 不穩(wěn)定，對(duì)低溫（冷凍）、高壓等物理因素及 秋水仙素（微管斷裂劑）等化學(xué)因素敏感。紫 杉醇可以和微管蛋白多聚體結(jié)合，抑制微管解 聚。精品文檔罰叩龍抵鹿j遍3. 微絲：真核細(xì)胞內(nèi)是主要由肌動(dòng)蛋白（actin ）組成的直徑為57nm的骨架纖絲。主要分布在細(xì)胞 質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)，作用是確定細(xì)胞表面特征、并與細(xì)胞 運(yùn)動(dòng)、收縮、內(nèi)吞等功能有關(guān)。脊椎動(dòng)物肌動(dòng)蛋白 分為a、B和丫三種類型，不同種類細(xì)胞中肌動(dòng)蛋 白組成不同。肌動(dòng)蛋白單體為球形，依次連

3、接成鏈， 兩串肌動(dòng)蛋白鏈互相纏繞扭曲成一股微絲。細(xì)胞松 弛素B為微絲斷裂劑。4. 中間纖維：直徑介于微絲和微管之間（711 nm）、由多種不同蛋白組成的細(xì)胞骨架成分。在細(xì)胞中圍繞著細(xì)胞核分布，成束成 網(wǎng)，并擴(kuò)展到細(xì)胞質(zhì)膜，與質(zhì)膜骨架相連結(jié)。 主要起機(jī)械支撐和加固作用。組成中間纖維 的蛋白：角蛋白，波形蛋白，結(jié)蛋白、神經(jīng)纖 維，神經(jīng)膠質(zhì)纖維和核纖層蛋白。不同組織來(lái) 源的細(xì)胞，組成其中間纖維的蛋白質(zhì)種類可能 不同。5. 研究細(xì)胞骨架的意義。（1）了解細(xì)胞骨架與細(xì)胞各種功能行使之間的關(guān)系。（2 ）了解理化因素是否通過(guò)影響細(xì)胞骨架對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，以便趨利避害。（3）鑒定發(fā)育中的細(xì)胞及腫瘤的來(lái)源。6

4、.顯示細(xì)胞骨架的常用方法：考馬氏亮藍(lán)染色法、免疫熒光染色法、鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法。原理：用去垢劑 Triton X-100 處理細(xì)胞適宜 時(shí)間，可以溶解膜脂，并與大部分非骨架蛋白 疏水區(qū)結(jié)合而將其溶解，剩下的纖維狀細(xì)胞骨 架蛋白比較穩(wěn)定而不被溶解，然后用蛋白染料考馬斯亮藍(lán)染色即可顯示其結(jié)構(gòu)。特點(diǎn)：非特異蛋白染色，不能區(qū)分微管、微絲、 中間纖維.（1 ）考馬斯亮藍(lán)染色法原理及特點(diǎn)（2）免疫熒光染色法原理及特點(diǎn)原理：用TritonX-100 處理固定處理過(guò)的細(xì)胞，可增加細(xì)胞膜通透性，使抗體 能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合。接 著用熒光素標(biāo)記的抗骨架蛋白抗體便可通 過(guò)直接免疫熒光法或間接免疫熒光法顯示

5、骨架。特點(diǎn)：特異顯示各種骨架蛋白（3）鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法原理及特點(diǎn)原理：鬼筆環(huán)肽可特異性地結(jié)合肌動(dòng)蛋 白，因此，用熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以 顯示微絲。特點(diǎn)：靈敏，能特異顯示微絲。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑及用品（一）材料：洋蔥（二）試劑（1）M緩沖液。（2）6mM磷酸鹽緩沖液（pH6.8 ）。（3）含 1%TritonX-100 的 M-緩沖液。（4）用M-緩沖液配制的3.0%戊二醛。(5) 0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染液。(6) 0.9%氯化鈉生理鹽水。(三) 用品普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、水浴箱(37 C)小剪刀、鑷子、5mL一次性塑料注射器、膠頭吸管、1.5mLEP管、1.5mL試管架四、實(shí)驗(yàn)操作

6、考馬斯亮藍(lán)染色法顯示洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架(1) 材料準(zhǔn)備：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，裁成大小0.5cm X0 . 5cm的小片。(2) PBS平衡：放入盛有1mL 6mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8 )的EP管中，靜置使 材料下沉(完全浸透)；然后用膠頭滴管吸棄液體。(3) TritonX-100 處理：加1mL 1% TritonX-100 溶液處理20min，然后用膠頭滴管 吸棄液體。(4) 洗滌：用M-緩沖液洗滌3次，每次加1.5mL溶液浸泡5min，然后用膠頭滴管 吸棄液體。(5) 固定：力口 1mL 3.0%戊二醛固定30min,然后用膠頭滴管吸棄液體。(6) 洗滌：用PBS洗滌3次

7、，每次浸泡5min,然后用膠頭滴管吸棄液體。(7) 染色：用0.51.0mL 0.2% 考馬斯藍(lán) R250染液染色10min。(8) 洗滌：用蒸餾水洗滌數(shù)遍。(9) 制備裝片：給載玻片中央加1滴水，用鑷子夾取樣品在其中展開(kāi)，然后加蓋玻片。(10) 顯微觀察：在普通光學(xué)顯微鏡下，洋蔥細(xì)胞骨架為布滿細(xì)胞的藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。(11) 對(duì)照樣品：省去步驟(3),不用Trit on X-100 處理；省去步驟(4),用Triton X-100處理后不用M-緩沖液洗滌。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論1. 實(shí)驗(yàn)樣品圖1洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架(400倍)實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞骨架分布細(xì)密均勻，視野中只剩下細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)，被考馬斯亮

8、藍(lán) 染成藍(lán)色。在視野的上半部分，細(xì)胞的背景呈現(xiàn)藍(lán)紫色，是由于最后洗滌不徹底所致。2. 對(duì)照樣品：不用 TritonX-100 處理圖2不用TritonX-100 處理的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架（400倍）不用TritonX-100處理的對(duì)照樣品的細(xì)胞中除了細(xì)胞骨架還有很多膜泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中還有藍(lán)色的細(xì)胞核。不用Triton X-100 處理，使得視野中有很多非骨架蛋白，這些非骨架蛋白被考馬斯亮藍(lán)染成藍(lán)色，影響對(duì)細(xì)胞骨架的觀察。3. 對(duì)照樣品：用 TritonX-100 處理后不用 M-緩沖液洗滌圖3用TritonX-100 處理后不用M-緩沖液洗滌的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架（400倍）圖3和圖2的情

9、況類似，視野中沒(méi)有均勻細(xì)密的細(xì)胞骨架，這是由于M緩沖液使細(xì)胞骨架中的微絲保持穩(wěn)定。在M緩沖液中，其中咪唑是緩沖劑，EGTA和EDTA螯合鈣離子，溶液并提供鎂離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于 觀察。用Trit on X-100處理后雖然可以溶解膜脂和非細(xì)胞骨架蛋白，但是保留下來(lái)的骨架蛋 白在沒(méi)有M-緩沖液的作用下，其結(jié)構(gòu)仍無(wú)法保持穩(wěn)定，影響觀察結(jié)果。六、作業(yè)與思考題1. 比較用與不用1%TritonX-100處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。答：見(jiàn)五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論 部分1、2。2. 查閱資料說(shuō)明 M-緩沖液中咪唑、MgC2、EGTA EDTA巰基乙醇或二硫蘇糖醇 （DTT） 在穩(wěn)定細(xì)胞

10、骨架中的作用。答：在M緩沖液中，咪唑是緩沖劑，MgCl2提供m6+,EGTA和EDTA螯合Ca2+，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察；巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）可以在二硫鍵被打開(kāi)后使蛋白質(zhì)的四級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，由于巰基乙醇能夠 打開(kāi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，它常常被用于蛋白質(zhì)分析，且?guī)€基乙醇也常常被用于保護(hù)蛋白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會(huì)錯(cuò)誤形成二硫鍵。3. 設(shè)計(jì)檢測(cè)微絲的間接免疫熒光法實(shí)驗(yàn)流程。（ 1） 用未標(biāo)記的微絲抗體加到微絲抗原標(biāo)本上，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗 滌，除去未結(jié)合的抗體。（ 2） 加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗 IgG、IgM 抗體，標(biāo)記的抗球蛋白抗體和 已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合。（3） 立即用熒光顯微鏡觀察。 觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度， 一般可用 “+”表示： （ - ）無(wú)熒光；（）極弱的可疑熒光； （ +）熒光較弱，但清楚可見(jiàn)； （ +） 熒光明亮； （ + -+ ）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“+”以上，而各種對(duì)照顯示為（）或（ - ），即可判定為陽(yáng)性七、反思與改進(jìn)1. 防止洋蔥鱗莖內(nèi)表皮卷曲、折疊，若卷曲折疊