細(xì)胞免疫組化

1、20、自來水洗返藍(lán)。21、梯度酒精脫水75,85,95,100%各3min。22二甲苯透明2次3min。23、中性樹膠封片。注意事項(xiàng)：1、良好得細(xì)胞爬片就是進(jìn)行免疫組織細(xì)胞得基礎(chǔ)，要獲得良 好細(xì)胞爬片須注意以下：a對(duì)于粘附分子較少得細(xì)胞爬片時(shí)間要達(dá)5天以上這樣細(xì)胞 爬片才較牢固沖洗時(shí)不易脫片；b接種得細(xì)胞密度適中以2*104/ml為宜，若密度太高5天后細(xì) 胞連接成片沖洗時(shí)易脫片；2、冰丙酮固定后玻片可密閉保存于4C冰箱，冰丙酮固定時(shí)會(huì) 使細(xì)胞收縮，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。3、沖洗時(shí)只須輕輕振蕩培養(yǎng)皿,（不可用吸管太用力吹，易脫 片）4、加一抗、二抗后沖洗時(shí)第一次須將玻片傾斜5Tri

2、ton X-100表面活性劑,脫去細(xì)胞膜中最主要得成分脂質(zhì), 對(duì)于抗原表達(dá)在胞漿或胞核者方使用,對(duì)于抗原表達(dá)在胞漿 者時(shí)間要控制好,使其破壞細(xì)胞膜而核膜破壞較少。細(xì)胞爬片固定后在孔板里做免疫組化還就是粘到載玻片上 再做？1、如果不瞧熒光倆種都可以，感覺粘好了再做要快一些，但就 是做得時(shí)候要防止脫落。如果瞧熒光，就不能用中性樹膠粘,直接在24扎或6孔板里做 才可以。中性樹膠要折光,散射得光干擾，沒辦法瞧細(xì)胞本身 得熒光。2、孔板里做免疫組化較方便,細(xì)胞比蓋玻片易貼壁，但染色后 不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。細(xì)胞爬片固定后粘到載玻片上不太可能，只有開始就讓細(xì)胞 貼在玻片上爬片。3、我沒有在多

3、孔板里做過，其實(shí)把細(xì)胞爬在蓋玻片上也不就 是很麻煩,偶這樣做很少掉片。先將消化好得細(xì)胞懸液滴幾滴在蓋玻片上，由于液體得表面 張力，細(xì)胞懸液一般不會(huì)流淌到蓋玻片外面，等細(xì)胞大概貼壁 后,不同細(xì)胞貼壁時(shí)間稍有不同，大概6、7個(gè)小時(shí)，差不多貼壁 再加生長(zhǎng)液,開始滴得細(xì)胞得數(shù)量您要摸索一下，到固定時(shí)細(xì) 胞生長(zhǎng)到80%左右比較合適。偶就是在蓋玻片上做得，首先細(xì)胞要爬得勻一些，象dongwp 戰(zhàn)友得就很好。然后傾去生長(zhǎng)液沖洗、固定之后，用小銀子或 手指把玻片從六孔板拿出來。擦干蓋玻片得背面，在玻片背面 四周涂一點(diǎn)凡士林，粘貼于載玻片上,這一點(diǎn)很重要，在以后得 操作里會(huì)省去蓋玻片經(jīng)常脫落麻煩。細(xì)胞爬片得保存

4、與抗原修復(fù)問題總結(jié)1、細(xì)胞爬片可以用 含 疊氮鈉PBS液保存、但不知道具體濃度,請(qǐng)告知、多謝!！加在液體中作為防腐劑得疊氮鈉濃度一般為0、04-0、 08%。但就是我建議對(duì)于細(xì)胞爬片，還就是盡量快得進(jìn)行處理, 以防不必要得問題！2、louischen wrote:但我得細(xì)胞爬片經(jīng)過4%多聚甲醛固 定,PBS沖洗后直接就放在了20度，還能用于免疫組化嗎？！應(yīng)該沒有問題，但就是還就是現(xiàn)作先染好些，以防抗原 得丟失3、mRNA原位雜交經(jīng)4%多聚甲醛固定，固定液需加 DEPC水。其它建議用甲醇固定。20度保存4、如果就是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存， 在4度冰箱里保存兩周沒問題。時(shí)間再長(zhǎng)就沒

5、試過了。5、丙酮中固定5-10分鐘，然后風(fēng)干，放置4度保存過夜 應(yīng)該就是沒有問題。不要固定過夜，蛋白質(zhì)固定過度,會(huì)影響 抗原得暴露，影響免疫組化結(jié)果。如果就是胞漿或胞核抗原岀 現(xiàn)假陰性結(jié)果，可考慮應(yīng)用0、5%得triton-100孵育30分鐘， 滲透細(xì)胞膜。如果玻片沒有經(jīng)過特殊處理，不要用其她抗原修 復(fù)得方法，會(huì)造成掉片，我曾有過這方面得體會(huì)6、丙酮固定后,PBS洗滌3次，即可保存至4度冰箱備 用。7、細(xì)胞爬片先用TBS洗3次，每次5分鐘(2) 4%多聚甲醛固定，室溫,20分鐘70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脫水，通風(fēng)櫥內(nèi) 干燥,度保存。2周沒有問題得，我保存過2個(gè)月都有信號(hào),

6、 不過還就是保存時(shí)間短一點(diǎn)得好8、我得心肌細(xì)胞爬片用不同濃度得乙醇依次脫水后， 就放在室溫中，因?yàn)榫褪且碾婄R，但就是學(xué)校電鏡壞了,呵呵, 所以放了一個(gè)月后去拍，還就是很好9、細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS沖 洗后，晾干，放在20度保存一個(gè)月沒有問題得。10、細(xì)胞爬片，有機(jī)溶劑如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定 后，輕輕搖動(dòng)玻片或培養(yǎng)皿等，靜置2min左右，棄去固定液，不 用PBS洗而就是采用空氣干燥，干燥后得標(biāo)本可于70C長(zhǎng)期 保存。解凍時(shí)要小心抗原破壞，應(yīng)先將標(biāo)本轉(zhuǎn)移于干冰預(yù)冷得 固定液，然后再將混合液轉(zhuǎn)移至室溫下,固定液到達(dá)室溫時(shí)取 出標(biāo)本，再用PBS沖洗，在做以后得步鄰11、

7、我也做過細(xì)胞爬片得組化染色，不過沒有遇到類似 得問題。細(xì)胞培養(yǎng)好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度 固定15分鐘，自然風(fēng)干。室溫保存幾周內(nèi)都可以用得。我想 這可能與抗原得類型有關(guān),有得對(duì)氧化等損傷比較敏感，有得 差一些。最好避光保存在4度,同時(shí)盡量隔絕空氣。免疫熒光 與普通DAB顯色差別只再二抗得標(biāo)記,樣品得保存應(yīng)該就是 沒有多大差別得。12、細(xì)胞爬片丙酮固定后20度保存，現(xiàn)在要再做免疫熒光，將保存得爬片拿出37度復(fù)溫然后常規(guī)操作就可以了13、爬片做免疫組化得優(yōu)勢(shì)在于抗原新鮮，細(xì)胞形態(tài)保 存較好。若爬片需長(zhǎng)期保存并出現(xiàn)您這樣得問題，原因可能就 是:1）試驗(yàn)步驟有誤，建議重復(fù)并加陽(yáng)性對(duì)照片。

8、2）加一抗前處 理同石蠟切片，可進(jìn)行抗原修復(fù)，如胰酶消化或熱修復(fù)。3）因?yàn)?抗原抗體反應(yīng)在液相中進(jìn)行，故對(duì)已極度干燥得爬片充分水 化很重要。建議試驗(yàn)前用PBS浸泡過夜。如不能解決您得問 題請(qǐng)QQ聯(lián)系：81825645c本人在湖南省腫瘤醫(yī)院病理科（長(zhǎng) 沙市）做免疫組化。14、4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用無水酒精 得，固定好后放20度,23個(gè)月就是沒有問題得。15、對(duì)于一般得細(xì)胞免疫組化，我得做法就是:細(xì)胞爬片 用冰得純丙酮固定20MIN,再在通風(fēng)柜將丙酮吹干,一20度 保存，用丙酮固定作用就是沉淀蛋白質(zhì)與糖，穿透性很強(qiáng)，保存 抗原得免疫活性好。所以丙酮常用做細(xì)胞細(xì)胞爬片得固定 劑。當(dāng)然

9、還就是要根據(jù)您得實(shí)驗(yàn)?zāi)康脹Q定用那種固定劑。如:1、多聚甲醛（常用4%）:可用于免疫電鏡;也可用于 免疫熒光染色。主要檢測(cè)組織內(nèi)一些性能嬌弱得抗原特別 就是細(xì)胞表而抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇（CD）、主要 組織相容性抗原等2、乙醇。優(yōu)點(diǎn):穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。缺點(diǎn)： 但醇類對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差,使蛋白變性得作用輕，固定后可再溶解;染色過程中，溫育時(shí)間 長(zhǎng),抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度 3、甲醛（福爾馬林）應(yīng)用最廣優(yōu)點(diǎn):形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好,且穿透性強(qiáng)，缺點(diǎn)：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH 降低，影響染色；分子間交聯(lián)形成得網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完 全掩蓋某些抗原決定簇，

10、使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘?染色結(jié)果。16、4度就是不能保存這么長(zhǎng)時(shí)間（1個(gè)月）得，如果抗原 已被分解，再修復(fù)也沒用！17、棄去固定液，不用PBS洗而就是采用空氣干燥，干燥 后得標(biāo)本可于70C長(zhǎng)期保存。18、爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒鐘，然 后在4%多聚甲醛中固定15分鐘，然后再用37度去離子水將 甲醛沖干凈，注意手法輕柔,要不然掉片很厲害。同時(shí)操作過 程中注意玻片得正反面,要不然真得就是前功盡棄。將做好得爬片置于濾紙上晾干,然后用中性樹膠粘在 載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹底干了之后才能做后續(xù) 實(shí)驗(yàn)，要不然玻片會(huì)掉下來得,就又就是前功盡棄了做好得 細(xì)胞爬片可以放在20

11、保存?zhèn)溆?具體能保存多長(zhǎng)時(shí)間不太清 楚，當(dāng)然盡量早用。19、固定后放點(diǎn)PBS,然后放在4度冰箱中保存，我最長(zhǎng)保存兩個(gè)月得，然后再做免疫組化，應(yīng)該沒有太大得問題得。20、固定后4度可以存放一周,20度存放半年,我現(xiàn)在也要做這個(gè)，實(shí)驗(yàn)室老師教得。21、四度放1周應(yīng)該沒問題得，您最好放在20度，我在 -20度放一個(gè)月都還岀結(jié)果得、很多人作得片子很多，不可能 一次作完，一個(gè)月沒問題、22、最佳得固定及保存方法：（1）中性緩沖福爾馬林（不必調(diào)pH）:福爾馬林（40%甲醛，用時(shí)加入過量堿式MgCO3中與）10、0mlNa2HPO4、12H2ol、9653gNaH2PO4、2H2O 0、5460g加0、85

12、 %NaCl溶液溶解,定容至lOOmlo（2）細(xì)胞固定:待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層時(shí)，用銀子取岀蓋玻 片,迅速于37CPBS中漂洗2次，每次3-5秒,以清除血清。（3）將蓋玻片投入中性緩沖福爾馬林溶液中室溫固定30mino（4）用銀子取出蓋玻片,PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干 保存于20C備用?？砷L(zhǎng)期保存，做實(shí)驗(yàn)時(shí)，取出片子，入PBS 濕潤(rùn)后即可進(jìn)行您得實(shí)驗(yàn)?？梢杂糜谧雒庖呒?xì)胞化學(xué)（H、E、）或免疫熒光。（本帖 沒有加分）23、細(xì)胞爬片固定以后要放在20度得冰箱、1個(gè)月內(nèi)可以用、24 skywalkerzz wrote:氧化氫處理這一步，用三蒸水 稀釋商品濃度為30%得過氧化氫，然后室溫下玻片放在

13、其中 浸泡lOmin,就是不就是過氧化氫導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重脫片？爬片應(yīng)該用甲醇/雙氧水，您得細(xì)胞極可能就是過氧 化氫導(dǎo)致嚴(yán)重脫片25、本人比較喜歡用4%得多聚甲醛,20分鐘很好用得。 保存得時(shí)候注意片子最好晾干，不要擠壓，防止粘片與碎裂。26、細(xì)胞爬片固定好以后，如果要保存，我們得做法就是 倒掉固定液,PBS漂洗后干片保存在4度，最長(zhǎng)半年沒問題。27、1、用新鮮配制得預(yù)冷得4%多聚甲醛緩沖液室溫 固定15 min,PBS （0、01 mol/1, pH7、4）洗滌3遍后就是否就 可以進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色了2、爬片PBS （0、01 mol/1, pH7、4）洗滌3遍后就是否 能保存，怎樣保存？1、洗

14、過就可以做免疫組化了。2、固定過后自然干燥，不要洗,20度保存。做之前再 洗。28、細(xì)胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛， 以免抗原交聯(lián)，這樣組化時(shí)不用再抗原修復(fù)。細(xì)胞固定后可室 溫保存在丙酮中,不使之干燥。29、如果就是檢測(cè)膜上得物質(zhì)，好象不能用酒精,30、適當(dāng)密度后取出固定（丙酮20固定1020min）,再 進(jìn)行免疫染色。31、一批細(xì)胞爬片，如果細(xì)胞爬片就是在玻璃上,冷丙酮 固定15-20分鐘,然后放20度，沒有問題。如果細(xì)胞爬片就是在24孔板或6孔板里進(jìn)行,冷丙酮 會(huì)腐蝕板子，最好4%多聚甲醛。32、細(xì)胞爬片用純丙酮固定10分鐘，取出干燥后用錫紙 包裹,70度保存。33、4%多聚

15、甲醛固定后PBS水洗,自然干燥后用錫紙包 裹,20度凍存不超過1月。34、如果細(xì)胞貼壁困難,可將片子先用純血清掛一層,7京 干后再養(yǎng)細(xì)胞。35、可以買NUNC公司得專用細(xì)胞培養(yǎng)用蓋玻片，商品 名Thermanox Coverslipso高分子材料，耐高溫滅菌， 經(jīng)過特殊表面處理，細(xì)胞容易貼附?？梢杂眉舻度我獠眉簦?用效果好。上海生工有現(xiàn)貨，不用國(guó)外定貨。我使用后，覺得效果 比玻璃蓋玻片效果好很多。36、我們通常就是把細(xì)胞玻片固定好后，用PBS沖洗干 凈，然后用酒精脫水（80%,90%,100%,100%酒精各一次，每次 10分鐘左右）,然后放在烘箱里烘干，這就是就相當(dāng)于石蠟切 片了，可以保存

16、一定得時(shí)間。這個(gè)方法我們?cè)囘^得，保持一段時(shí)間后做，效果還就是可以得。免疫細(xì)胞化學(xué)染色操作規(guī)程一、材料與1、玻片:須用免疫組化專用玻片，或用2%多聚賴氨酸包被處 理玻片。2、5-10%正常山羊血清封閉液，用PBS配。3、3%牛血清白蛋白(BSA),用PBS配。4、0、01M PH7、4 PBS5、1%BSA-PBS(含 0、05% Tween20)6、AEC底物底物緩沖液(20X)PH4、6醋酸(分子量60、6) 30、6mlTriton -100醋酸鈉3H2O(分子量136、1)66、68克加蒸丫留水到960ml,調(diào)PH到4、6,最后加蒸鐳水到總體積1000ml(2) AEC(20X)AEC

17、15mg/ml,7在DMF(二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量 73、10 中)(3) 0、6% H2O2(20X)臨用時(shí)，各50ul,在1ml雙蒸鐳水中混勻30分鐘內(nèi)有 效。7、DAB(B卩 DAB-4HCL)(1) 1、5 克 DAB 在 100ml 水溶液中(20X)(2) 1M Tris(20X),用 HCL 調(diào) PH 到 7、4(1)(2)(3)各滴加入1ml二蒸水中,新鮮配，避光,30分鐘內(nèi)有效。 溶解后(可加熱到500C),加水合氯醛50克(水合氯醛Chloral Hychate,分子量165 4),枸椽酸1克，充分溶解,于棕色瓶中, 室溫或40C保存。8、蘇木素復(fù)

18、染液蘇木素1克碘酸鈉0、2克鉀磯50克水 1000ml9、含10%及2%小牛血清得DMEM培養(yǎng)液。10、3%H2O2:30% H2O2 1份，加9份雙蒸水，臨用時(shí)配。11、細(xì)胞抗原玻片及96孔細(xì)胞抗原板(見ICC protocol 04)12、封片液:1克明膠，溶于30ml 350C水中，加入35ml甘油(或用甘油封片)與650mg石碳酸(先溶于0、6ml水中)。 二、細(xì)胞內(nèi)源過氧化物酶阻斷(使用HRP標(biāo)記二抗或SP法時(shí) 必須阻斷)1、從冰箱取出細(xì)胞片或細(xì)胞板，置室溫或370C 10-15分鐘， 使恢復(fù)溫度。2、加3%H2O2,細(xì)胞片20ul/孔,培養(yǎng)板lOOul/孔,使充分覆蓋住 細(xì)胞。3、

19、室溫10分鐘后，甩掉H2O2,用PBS輕輕淋洗2分鐘。用 濾紙吸干細(xì)胞周圍水份,96孔在濾水紙上扣干,但注意保持細(xì) 胞濕潤(rùn)。三、封閉細(xì)胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），細(xì)胞板用2- 5%BSA（PBS配制）100ul/孔,置370C孵育30分鐘后甩掉封 閉液,不洗。四、免疫化學(xué)染色1、分別加一抗與所有對(duì)照一抗，細(xì)胞法10-20U1/7L,細(xì)胞板50山/孔，使充分覆蓋細(xì)胞。37C1小時(shí)或4C冰箱過夜；2、棄去一抗，如為細(xì)胞涂片用PBST輕輕簡(jiǎn)單淋洗1次后，浸 于100mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速搖床上）35分鐘，轉(zhuǎn) 入第二杯PBS（ 1000ml）,如上法漂洗3-5分鐘。擦干

20、細(xì)胞片周 圍水分,96孔板則倒掉一抗后，每孔加滿PBST在搖床上搖洗3- 5分鐘后倒掉,在濾紙上扣干，但保持細(xì)胞濕潤(rùn)，反復(fù)3-4次；3、加S、P（S、P法，即放大法）加已優(yōu)選好得濃度得Biotin標(biāo)記二抗,細(xì)胞片10ul/孔，細(xì)胞 板50ul/孔，使充分復(fù)蓋細(xì)胞。37C溫與孵育30分鐘；按免疫化學(xué)染色2所述方法洗滌與擦干； （3）加已優(yōu)選好濃度得S、P,用量同（l）,37C孵 育30分鐘后按免疫化學(xué)染色2法洗滌及擦 干；4、間接法加二抗（不放大法）方法同S、P法,但不用Biotin標(biāo)記二抗,而改用HRP直接標(biāo) 記二抗。并省略（3）步驟；5、加底物顯色（1）、加足量得AEC顯色液，充分覆蓋細(xì)胞層

21、，細(xì)胞玻片20ul/ 扎板5OU1/7L,置于37C恒溫箱孵育5-10分鐘,一般在顯微鏡 下根據(jù)結(jié)果顏色得呈現(xiàn)情況掌握染色時(shí)間，以得到滿意得結(jié) 果（陽(yáng)性對(duì)照顯色程度為+卄）,用自來水即 可終止反應(yīng)；（2）、復(fù)染:蘇木素染液（使用時(shí)間最好不超過兩個(gè)月）加蘇木素 復(fù)染液12滴,1分鐘左右，在自來水龍頭下輕輕沖洗掉蘇木素, 再浸于PBS中約30秒鐘返藍(lán)色，最后在蒸鐳水中漂洗。6、封片洗后細(xì)胞片擦去周圍水分，滴加1滴甘油一明膠封片液，加蓋 玻片，除去氣泡,用指甲油或樹膠封固玻片。五、結(jié)果判斷 KSHV陽(yáng)性誘導(dǎo)后BCBL-1細(xì)胞有10%-30%顯紅色，強(qiáng)度不一,未誘導(dǎo)BCBL-1陽(yáng)性細(xì)11（1-30%）陰性一一誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)BCBL-1細(xì)胞完全不顯 色（排除邊緣效應(yīng)）MCMV/HVMV陽(yáng)性感染病毒得細(xì)胞有病灶反應(yīng)，顯紅色，強(qiáng)度不一,未感染細(xì)胞不顯紅色（排除非特異性染色）陰性一一感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞不顯紅色注意：1、一抗、二抗得稀釋采用 1 %B