禽流感新城疫和犬瘟熱病毒單克隆抗體篩選策略比較及應用研究

1、禽流感、新城疫和犬瘟熱病毒單克隆抗體篩選策略比較及應用研抗體是免疫球蛋白大蛋白家族成員 ,抗體蛋白結(jié)合特定表位 , 由淋巴細胞合 成或由攻擊性 （或非自體 ）有機體生成。單克隆抗體技術的發(fā)展和成熟為抗體應用奠定了基礎。單克隆抗體具有針對單一抗原表位、能夠無限傳代、穩(wěn)定分泌表達等特點 在疾病診斷及治療等方面有著極為明顯的優(yōu)勢。 抗體除了疾病診斷及治療應用外 ,還可作為基礎研究工具使用 , 根據(jù)其與抗原特異性結(jié)合特性 ,在研究中發(fā)揮作用。但是如何能獲得活性好、 效價高的抗體一直是廣大免疫學及其相關學者研究 的熱點和重點。本研究采用包括天然蛋白和重組蛋白在內(nèi)的不同免疫原進行免疫 根據(jù)所篩選的抗體用途

2、和特性，將ELISA、血凝抑制試驗及中和試驗等多種篩選 方法相結(jié)合 , 以期對雜交瘤技術更高效的篩選到滿足需求的抗體進行比較 , 為今 后抗體制備策略提供重要參考依據(jù)。本研究通過對禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）和犬瘟熱病毒（CDV）3種 動物重要疫病病毒的不同蛋白單克隆抗體的制備 , 從免疫原、篩選方法及制備過 程等方面入手 , 共計獲得穩(wěn)定分泌的單抗 21 株。分別對制備的單抗特性、 所針對 的抗原表位進行鑒定并進行應用研究探索。針對AIV共計制備獲得抗體7株。通過原核表達,獲得了 AIV-NS1蛋白,用重組蛋白免疫 BALB/c 小鼠。另外,經(jīng)SPF雞胚擴增。AIV病毒擴增后進

3、行蔗糖密度梯度離心純化,病毒純 化后,于電鏡下觀察病毒粒子,然后同樣免疫BALB/c小鼠。應用雜交瘤技術取免疫小鼠脾細胞與 SP2/0 細胞融合 ,AIV-NS1 蛋白免疫小鼠用蛋白ELISA試驗篩選?？笰IV-NS1蛋白獲得抗體2株,分別命名為：D7和D9b用血凝抑制試驗結(jié)合AIV-ELISA篩選獲得抗AIV-HA單抗5株,分別命名 為:D1C12、D3B2 D3B3 D3A11和 D12B3但所有5株均不具有中和活性。對AIV-NS1蛋白的兩株抗體D7及D9進行抗原表位鑒定。分別用噬菌體展示 肽技術對D7和D9各進行了 3輪生物淘選,并結(jié)合多肽芯片和截短表達技術鑒定出2株單抗的最短線性B細

4、胞抗原表位。D7識別的抗原表位為29DAPF32;DS識別的抗原表位為182WNDNT186經(jīng)SPF雞胚擴增NDV濃縮后免疫BALB/c小鼠。用NDV-Hhlg核表達蛋白ELISA試驗篩選到3株抗體,分別命名為：D5D2,D5G2 和D6A2該3株抗體均不具有血凝抑制活性及中和活性；用NDV全病毒ELISA方 法篩選到抗體5株,依次命名為：D1B4,D1D9,D3F1,D4F8和D5E11,其中2株具有血 凝抑制活性 ,但所有 5株均不具有中和活性 ;用血凝抑制試驗篩選到抗體 3株,分別命名為：D1H12,D5C5和D3C2其中D5C5體外雞胚中和試驗結(jié)果顯示,其能夠?qū)?強毒F48E9毒株、中

5、等毒力Mukteswar毒株和弱毒La Sota毒株均具有中和作用，其中和效價均大于1:2048。經(jīng)截短表達鑒定發(fā)現(xiàn),D5C5所識別的抗原中和表位為353DEQDYQIR360通過選取針對NDV舌性高的2株單克隆抗體D1H12和D5C5,結(jié)合HRP-anti-NDV多抗血清,建立抗體夾心ELISA檢測試劑盒及膠體金檢測試紙條,結(jié)果能夠快速對新城疫進行檢測 , 從而方便現(xiàn)地對于新城疫疫情的監(jiān)測。該檢測 方法的特異性均良好 , 與雞痘病毒、傳染性支氣管炎病毒、 傳染性喉氣管炎病毒、 小鵝瘟病毒、雞毒支原體、雞傳染性法氏囊病病毒、禽流感病毒均未見反應性。同時還發(fā)現(xiàn)ELISA與 RT-PCR敏感性相同

6、,均達到10-3尿囊液稀釋度；膠體金檢測試紙條能快速檢測NDV抗原,敏感性為10-2尿囊液稀釋度。在病毒蛋白與宿 主蛋白相互作用的研究中 , 抗體作為工具也發(fā)揮了重要作用。本研究應用針對NDV-HNS白的中和抗體與新城疫強毒F48E9感染的DF1細 胞裂解后進行免疫沉淀，獲得接毒與未接毒細胞的蛋白差異條帶，通過LTQ質(zhì)譜 分析得出與NDV-HNS白有相互作用的兩個蛋白,即Caveolin和Ap oli pop roteinB。 Caveolin 是細胞表面微囊標志蛋白 , 其與微囊形成和定位相關 , 也參與胞吞和 胞內(nèi)囊泡運輸、信號轉(zhuǎn)導、膽固醇穩(wěn)態(tài)和運輸。Apolipoprotein B 在脂

7、類和膽固醇的運輸和代謝過程中發(fā)揮重要作用。通 過原核表達CDV-F蛋白免疫BALB/c小鼠?？笷蛋白獲得2株抗體,分別命名為:D1G8和D3F1但與CDV反應性弱,不具 有中和活性。用Vero細胞擴增CDV通過蔗糖密度梯度離心方法對病毒進行純化 并通過電鏡觀察病毒粒子形態(tài)。免疫小鼠后用CDV全病毒ELISA方法結(jié)合中和試驗篩選到抗體1株,命名為DC2,該抗體具有中和活性,體外細胞中和試驗結(jié)果顯示,其中和效價為1:3200。結(jié)果表明 , 在篩選抗體之初 , 首先要明確所選抗體的主要用途 , 再結(jié)合抗原特性進 行設計 , 并結(jié)合多種篩選方法對抗體進行篩選 , 對于獲得所需抗體的幾率會大幅 提升。本

8、研究進而對通過雜交瘤技術制備的針對 NDV CDV勺高中和活性抗體D5C5和DC2進行動物體內(nèi)治療效果研究。選用Mukteswar中等毒力疫苗作為雛雞的感 染毒株建立動物疾病模型,確定感染劑量為106EID50/只,之后對發(fā)病雛雞用中 和抗體1mL/只進行肌肉注射,結(jié)果發(fā)現(xiàn),患雛雞成活率由15%!高為60%具有明 確的體內(nèi)治療效果?？谷翢岵《局泻涂贵w靜脈推注 CDV核酸陽性狐貍,結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射抗體后患病狐貍不但臨診狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn) , 而且其口腔、鼻拭子及血液中均未見檢出 CDV核酸,表明該抗體具有體內(nèi)中和病毒的作用。對兩株具有中和活性的抗體的可變 區(qū)測序,通過對5 RACE高簡并引物及巢式混合

9、引物 PCR3種方法的比較,最終確定巢式混合引物PCR具有較高的敏感性和特異性，可用于鼠源單抗的序列測定， 結(jié)果獲得了 D5C5和DC2的重鏈及輕鏈可變區(qū)序列。之后再根據(jù)可變區(qū)測序結(jié)果設計引物對其進行擴增，然后與鼠Ig Fc段連接,獲得了完整的鼠源抗體DNA流式細胞術篩選分泌抗體的單個B淋巴細胞也是近 幾年研究的熱點 , 本研究通過對經(jīng)濟動物狐貍的外周血淋巴細胞進行分離后 , 再 以Anti-CD19-FITC抗體作為探針對狐貍的B淋巴細胞進行識別并分選,確定了該 抗體可以識別狐貍的B淋巴細胞，為今后狐貍的相關疫病抗體篩選提供了技術支持。本研究從抗體制備、篩選方法入手 , 對獲得所需抗體的策略進行較為全面的 分析與闡述。從抗體應用角度出發(fā) , 對本研究獲得的抗體進行包括作為試驗工具、 建立診斷方法以及體內(nèi)治療等