生物工程畢業(yè)論文（設(shè)計）綠原酸對成骨細(xì)胞增殖的影響

1、畢業(yè)論文(設(shè)計)學(xué)院： 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)：生物工程專業(yè) 年級：2008級 題目: 綠原酸對成骨細(xì)胞增殖 的影響 學(xué)生姓名： 學(xué)號： 指導(dǎo)教師姓名： 職稱: 教授 2012年 5 月 11日中南民族大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計）原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。 作者簽名： 2012 年 5 月 11 日 目 錄摘要1abstract11 前言21.1 中藥材接骨草的化學(xué)成分及其藥用價值21.2 綠原酸簡介21.2.1

2、理化性質(zhì)21.2.2生物活性31.3 成骨細(xì)胞簡介41.4 細(xì)胞增殖速率的檢測方法52 實驗材料52.1 原材料52.2 試劑62.3 儀器63 實驗方法63.1 成骨細(xì)胞的分離、原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)63.2 接骨草中化學(xué)成分綠原酸溶液的配制73.3 綠原酸對成骨細(xì)胞增殖的檢測84 實驗結(jié)果84.1成骨細(xì)胞培養(yǎng)84.2 綠原酸對成骨細(xì)胞增殖的影響115結(jié)果與討論135.1 實驗結(jié)果分析135.2實驗影響因素分析15致 謝15參考文獻(xiàn)16綠原酸對成骨細(xì)胞增殖的影響摘要：目的：檢測接骨草所含化學(xué)成分綠原酸對小鼠成骨細(xì)胞增殖速率的影響。方法：從新生小鼠顱蓋骨中分離其成骨細(xì)胞，經(jīng)過原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)后，

3、接種于含有接骨草中綠原酸成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用mtt法檢測其生長速率。結(jié)果：接骨草所含化學(xué)成分綠原酸對成骨細(xì)胞的生長速率有一定的作用。當(dāng)綠原酸濃度較大時，其對小鼠的成骨細(xì)胞有一定的抑制作用，而當(dāng)綠原酸濃度較低時，其對小鼠成骨細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用。關(guān)鍵詞：綠原酸；成骨細(xì)胞；細(xì)胞增殖率the effect of chlorogenic acid on the proliferation rate of osteoblastsabstract: objective: to test the effects of the chemical composition chlorogenic acid fr

4、om sambucus chinensis lindl on the proliferation rate of primary osteoblasts culture from mice calvaria. method: osteoblasts from neonatal mice calvaria were cultured and subcultured .then they were grown in culture medium containing chlorogenic acid. mtt assay was applied to the effect of chlorogen

5、ic acid on proliferation rate of osteoblasts. result: the chemical composition chlorogenic acid of sambucus chinensis lindl have some effect on the proliferation rate of osteoblasts. when the concentration of chlorogenic acid is high, the mice osteoblasts growth will be inhibited. when the concentra

6、tion of chlorogenic acid is low, the mice osteoblasts growth will be improved.key words: chlorogenic acid; osteoblasts; cell proliferation rate1 前言1.1 中藥材接骨草的化學(xué)成分及其藥用價值圖1-1 接骨草接骨草（sambucus chinensis lindl）,別名陸英、白龍骨、冷抗蘭、猢猻接竹、痱癢草、血和山、烏骨麻、赤車使者、臭草，屬忍冬科接骨木屬植物，早在本草綱目中就有記載，是民間常用藥。分布浙江、安徽、江西、湖北、湖南、福建、廣東、廣西、

7、貴州、云南、四川等省區(qū)。日本也有分布，多年生高大草本或亞灌木，資源豐富1。全草入藥、根能祛風(fēng)消腫，舒筋活絡(luò)，治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，跌打損傷。莖、葉有發(fā)汗，利尿，通經(jīng)活血；治腎炎水腫。全草煎水洗治風(fēng)疹瘙癢。 全草含黃酮類、酚性成分、鞣質(zhì)、糖素：種子含氰甙類。唐本草：主水腫，腳氣，利大小便，消痰破癖，除積聚，消疔腫。本草拾遺：搗絞汁服，令人吐逆，除胸膈熱痰，亦主瘧及小兒痞滿。植物名實圖考：治筋骨及婦人調(diào)經(jīng)多用之。嶺南采藥錄：治淋濁，利小便，消熱毒。2廣西中藥志：治婦女白帶及痧氣。 但是，其治療骨折的有效成分尚不清楚。據(jù)研究，接骨草全草含黃酮類、酚性成分、鞣質(zhì)3，糖類、綠原酸(chlorogenic ac

8、id)；葉含-谷甾醇(-sitosterol)、-香樹精、熊果酸(ursolic acid)、菜油甾醇、豆甾醇(stigmasterol)和多量硝酸鉀；根含大量鞣質(zhì)、還原糖，還含生物堿4。莖、葉均含可水解鞣質(zhì)。全草含水量揮發(fā)油，其主成分為甲基壬基甲酮（methyl-n-nonylketone）。 1.50%煎劑對金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌有抑制作用。1.2 綠原酸簡介綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用5。與咖啡酸相似，口服或腹腔注射時，可提高大鼠的中樞興奮性?？稍黾哟笫蠹靶∈蟮男∧c蠕動和大鼠子宮的張力

9、。有利膽作用，能增進(jìn)大鼠的膽汁分泌 。對人有致敏作用，吸入含有本品的植物塵埃后，可發(fā)生氣喘、皮炎等。1.2.1理化性質(zhì) 半水合物為針狀結(jié)晶(水)。110 變?yōu)闊o水化合物，熔點 208 ， 24d-35.2 ( c=2.8)。25 水中溶解度為 4%，熱水中溶解度更大；易溶于乙醇及丙酮，極微溶于醋酸乙酯，難溶于三氯甲烷、乙 醚、苯等親脂性有機(jī)溶劑。 13cnmr(h2o)a：126.6(c-1), 114.1(c-2), 144.2(c-3), 147.0(c-4), 116.0(c-5), 122.6(c-6), 145.9(c-7), 115.2(c-8), 168.9(c-9); b: 7

10、6.6(c-1), 38.3(c-2), 70.6(c-3), 72.8(c-4), 71.0(c-5), 37.3(c-6), 180.1(c-7)1 。 綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚三個不穩(wěn)定部分。microherb研究表明，在從植物提取過程中，往往通過水解和分子內(nèi)酯基遷移而發(fā)生異構(gòu)化。由于綠原酸的特殊結(jié)構(gòu)，決定了其可以利用乙醇、丙酮、甲醇等極性溶劑從植物中提取出來，但是由于綠原酸本身的不穩(wěn)定性，提取時不能高溫、強(qiáng)光及長時間加熱。建議保存時避光密封低溫保存。1.2.2生物活性 綠原酸具有廣泛的生物活性，現(xiàn)代科學(xué)對綠原酸生物活性的研究已深入到食品、

11、保健、醫(yī)藥和日用化工等多個領(lǐng)域。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、止血6、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用。1.2.4.1抗菌、抗病毒 杜仲綠原酸有較強(qiáng)的抗菌消炎作用，桃葉珊瑚苷及其多聚體有明顯的抑菌作用，桃葉珊瑚苷元對革蘭氏陰性、陽性菌都有抑制作用。桃葉珊瑚苷有抑菌、利尿作用，并能促進(jìn)傷口愈合；桃葉珊瑚苷與葡萄糖苷一起預(yù)培養(yǎng)后還會產(chǎn)生明顯的抗病毒作用，但其本身開不具有抗病毒功能。日本愛知醫(yī)科大學(xué)加齡醫(yī)科學(xué)研究所經(jīng)研究確認(rèn)，從杜仲中提取的堿性物質(zhì)有抗破壞人體免疫系統(tǒng)病毒的功能，這種物質(zhì)有可能用于預(yù)防和治療艾滋病。1.2.4.2抗氧

12、化作用 綠原酸是一種有效的酚型抗氧化劑，其抗氧化能力要強(qiáng)于咖啡酸、對羥苯酸、阿魏酸、香豆酸等酚類物質(zhì)789。綠原酸之所以有抗氧化作用，是因為它含有一定量的r-oh基，能形成具有抗氧化作用的氫自由基，以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基的活性，從而保護(hù)組織免受氧化作用的損害。1.2.4.3清除自由基、抗衰老、抗肌肉骨骼老化 綠原酸及其衍生物具有比抗壞血酸、咖啡酸和生育酚 （維生素e） 更強(qiáng)的自由基清除效果，可有效清除dpph自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基，還可抑制低密度脂蛋白的氧化。綠原酸對ddph 自由基清除作用比維生素e、維生素c和咖啡酸要強(qiáng)，可有效清除ddph 自由基、羥基自由基和超

13、氧陰離子自由基。在由過氧化氫誘發(fā)的小鼠血紅細(xì)胞的溶血抑制實驗中，比較幾種有機(jī)多酚酸的抑制作用，以綠原酸的抑制作用最強(qiáng)10。綠原酸對自由基的有效清除，能維持機(jī)體細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能，防止和延緩諸如腫瘤、突變、衰老等病理生理現(xiàn)象的發(fā)生11。綠原酸對有效地清除體內(nèi)自由基、維持機(jī)體細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能、防止和延緩腫瘤突變和衰老等現(xiàn)象的發(fā)生具有重要作用。杜仲綠原酸含有一種可促進(jìn)人體的皮膚、骨骼、肌肉中膠蛋白的合成與分解的特殊成分，具有促進(jìn)代謝、防止衰退的功能，可用來預(yù)防宇航員因太空失重而引起的骨骼和肌肉衰退，同時發(fā)現(xiàn)杜仲綠原酸無論在體內(nèi)還是體外，均有明顯抗自由基作用。1.2.4.4抑制突變和抗腫瘤 現(xiàn)代

14、藥理實驗證明杜仲綠原酸有抗癌和抑癌之功效，日本學(xué)者研究了杜仲綠原酸的變異原性抑制作用(antimutagenicity)，發(fā)現(xiàn)該作用與綠原酸等抗變異原性成分有關(guān)，揭示了綠原酸對腫瘤預(yù)防的重要意義。 蔬菜、水果中的多酚類如綠原酸、咖啡酸等可通過抑制活化酶來抑制致癌物黃曲霉毒素b1和苯并a-芘的變異原性；綠原酸還可通過降低致癌物的利用率及其在肝臟中的運輸來達(dá)到防癌、抗癌的效果。綠原酸對大腸癌、肝癌和喉癌具有顯著的抑制作用，被認(rèn)為是癌癥的有效化學(xué)防護(hù)劑12。1.2.4.5對心血管保護(hù)作用 綠原酸作為一種自由基清除劑及抗氧化劑已被大量的試驗證明，綠原酸的這種生物活性，對心血管系統(tǒng)能產(chǎn)生保護(hù)作用。異綠原

15、酸b對大鼠具有較強(qiáng)促進(jìn)前異綠原酸b對大鼠具有較強(qiáng)促進(jìn)前列腺環(huán)素（pgi2）的釋放和抗血小板凝集作用；對豚鼠肺碎片感應(yīng)的抗體誘導(dǎo)srs-a釋放抑制率達(dá)62.3%。異綠原酸c也有促進(jìn)pgi2釋放作用。另外，異綠原酸b對血小板學(xué)栓素的生物合成和氫過氧化無誘發(fā)的內(nèi)皮素?fù)p傷有極強(qiáng)的抑制作用。1.2.4.6降壓作用 經(jīng)多年臨床試驗證實的，杜仲綠原酸有明顯的降壓作用，而且療效平穩(wěn)，無毒、無副作用。美國威斯康星大學(xué)研究發(fā)現(xiàn)杜仲綠降血壓的有效成分是松酯醇二葡萄糖苷，桃葉珊瑚甙，綠原酸，和杜仲綠原酸多糖類13。1.2.4.7其它生物活性 由于綠原酸對透明質(zhì)酸（haase）及葡萄糖-6-磷酸酶（gl-6-pase）

16、有特殊的抑制作用，所以綠原酸對于創(chuàng)傷的治愈、皮膚健康濕潤、潤滑關(guān)節(jié)、防止炎癥以及體內(nèi)血糖的平衡調(diào)控等都有一定得療效。綠原酸對多種疾病和病毒還有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用。綠原酸有降血壓、抗菌、抗病毒、消炎、增高白血球、預(yù)防糖尿病、顯著增加胃腸蠕動和促進(jìn)胃液分泌等藥理作用，對急性咽喉炎癥有明顯的療效。研究表明，口服綠原酸能夠顯著的刺激膽汁的分泌，具有利膽保肝的功效；它還可有效抑制h2o2引起的大鼠紅細(xì)胞溶血作用。1.3 成骨細(xì)胞簡介骨組織的細(xì)胞可分為四種：骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。骨原細(xì)胞是骨組織中的干細(xì)胞，在骨的生長發(fā)育時期，或成年后骨的改造或骨組織修復(fù)過程中，它可分裂增殖并分化為成骨細(xì)

17、胞。骨組織在人的一生中不斷更新，是一種代謝很活躍的組織。成骨細(xì)胞是骨發(fā)生和骨形成的重要細(xì)胞，具有合成、分泌組成骨基質(zhì)的膠原和糖蛋白的作用，并通過鈣化基質(zhì)形成骨組織14-16。另外成骨細(xì)胞在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，生理機(jī)制調(diào)節(jié)和骨代謝性疾病中亦發(fā)揮重要作用。 成骨細(xì)胞是由骨原細(xì)胞分化，比骨原細(xì)胞體大，呈矮柱狀或立方形，并帶有小突起。核大而圓、核仁清晰。胞質(zhì)嗜堿性，含有豐富的堿性磷酸酶，堿性磷酸酶是一種在堿性環(huán)境下能催化單磷酸水解得糖蛋白，被認(rèn)為參與礦化，與成骨細(xì)胞分化成熟有關(guān)17。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。成骨細(xì)胞具有產(chǎn)生細(xì)胞問質(zhì)中纖維和黏多糖蛋白的作用。新的細(xì)

18、胞問質(zhì)不斷產(chǎn)生，并經(jīng)過鈣化形成骨質(zhì)，成骨細(xì)胞被包埋其中，胞內(nèi)活動停止，腦漿減少，腦體變形，轉(zhuǎn)變?yōu)楣羌?xì)胞，具有造骨功能18。成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究成骨細(xì)胞生長代謝和骨組織工程的基礎(chǔ)，其基本方法有兩種：酶消化法和組織塊培養(yǎng)法。酶消化法是將組織塊以膠原酶和胰蛋白酶處理，經(jīng)離心收集細(xì)胞，此方法一次可獲得大量的細(xì)胞，且需時間短，但存在著明顯的缺點。酶消化處理時間長達(dá)1h以上，對細(xì)胞膜表面受體和抗原成分有損害。組織塊培養(yǎng)法是利用成骨細(xì)胞在體外可移行出骨組織的特點，將骨組織培養(yǎng)，收集爬行生長出的成骨細(xì)胞，此方法培養(yǎng)成骨細(xì)胞無需額外的酶消化處理，故該方法及可靠又簡便，但有培養(yǎng)時間長及細(xì)胞產(chǎn)出率低的缺點，一定

19、程度上限制了它的應(yīng)用。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞具有體內(nèi)成骨細(xì)胞的基本特征，常被用來作為研究藥物對成骨細(xì)胞影響的模型。因此，本研究從新生小鼠顱蓋骨分離純化成骨細(xì)胞，用于探討該藥物對成骨細(xì)胞增殖影響的研究。1.4 細(xì)胞增殖速率的檢測方法細(xì)胞的速率直接反應(yīng)細(xì)胞的生長情況。常用的mtt比色法，具有簡便、迅速、準(zhǔn)確、安全及價廉等優(yōu)點19。mtt漢語化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。mtt法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法）是mosmann201983年報告的，以后此方法得到迅速發(fā)展并在臨床上得以應(yīng)用。其原理是活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四氮唑化物

20、（mtt）由黃色還原為藍(lán)色的甲瓚，后者溶于有機(jī)溶劑（如二甲基亞砜、無水乙醇或酸化異丙醇等），在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，形成甲瓚的量與細(xì)胞數(shù)成正比關(guān)系。死細(xì)胞和不能進(jìn)行線粒體能量代謝的細(xì)胞不產(chǎn)生甲瓚，細(xì)胞所形成的甲瓚的沉淀可通過酶聯(lián)免疫檢測儀測定mtt的量，進(jìn)而了解細(xì)胞的情況21-23。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。缺點：由于mtt經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲臜的有機(jī)溶劑對實驗者也有損害。2 實驗材料2.1 原材料(

21、1)綠原酸粉劑：圖2-1 綠原酸粉劑(2)小鼠：從湖北疾控中心購買的無菌小鼠2.2 試劑dmem(gibco,usa)新生小牛血清(gibco,usa)胰蛋白酶trypsin溶液edta雙抗（青霉素，鏈霉素）75%酒精pbs緩沖液蒸餾水去離子水dmem培養(yǎng)液二甲基亞砜mtt溶液2.3 儀器小燒瓶燒杯10ml離心管電子天平co2培養(yǎng)箱（sanyo,co2 lncu bator）電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-1ab行型，天津市泰斯特儀器有限公司)冰箱(西門子)高速冷凍離心機(jī)（3k15型）倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）若干個96孔培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿立式壓力蒸汽滅菌鍋96孔板酶聯(lián)免疫檢測儀移液槍和槍頭實驗用的小剪

22、刀和鑷子3 實驗方法3.1 成骨細(xì)胞的分離、原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)（1）溶劑配制 按照試劑配制方法對pbs溶液、dmem培養(yǎng)基、0.1%trypsin-0.02%edta消化液、雙抗等溶液進(jìn)行配備。 pbs溶液的配制：稱取nacl 8克，kcl 0.2克，kh2po4 0.2克，na2hpo4.12h2o 2.89克，溶于1l的蒸餾水中，使其充分溶解。放4避光保存即可。mtt溶液的配制：稱取mtt 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液(pbs)或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。（2）滅菌 對實驗過程中所需要的

23、槍頭、培養(yǎng)皿、燒杯、pbs、剪刀等實驗所需物品進(jìn)行滅菌，烘干備用。用立式過濾器對配置好的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行過濾滅菌，并進(jìn)行分裝。用細(xì)胞過濾器分別對消化液、雙抗進(jìn)行過濾滅菌（以上操作應(yīng)在無菌超凈工作臺上操作）。（3）細(xì)胞培養(yǎng)液配制 在無菌超凈工作臺上按照含90%dmem培養(yǎng)基和10ml小牛血清進(jìn)行培養(yǎng)液配置，然后加入100ml雙抗備用，總體積為100ml。（4）成骨細(xì)胞的分離及傳代培養(yǎng) 拉頸處死出生2-3天的小鼠2只，將其投入裝有適量75%小燒杯中浸泡10min，以消滅其體表所帶的細(xì)菌。在超凈工作臺上用無菌鑷子取出小鼠。酒精燒杯即可作為廢液缸。將小鼠轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，傾入少量pbs溶液，沖洗2

24、-3次，為了洗去小鼠身上的酒精。 左手用鑷子夾住小鼠頭部，右手用小剪刀剪開小鼠兩耳后的皮膚，再剪開頭頂部中間的皮膚，然后用鑷子從頭部兩側(cè)撕開皮膚，往前撥，露出頭部顱蓋骨。用剪刀將可見的白色顱蓋骨剪下，左右各剪一刀剪下完整的頭蓋顱骨，并在培養(yǎng)皿上用剪刀剔除腦組織，分離出白色透明韌性塊狀組織，即為顱蓋骨。將顱蓋骨置于含pbs溶液的培養(yǎng)皿中，用小剪刀再次清除還殘留在顱蓋骨上的血管及結(jié)締組織，再用pbs清洗1-2次。 將所分離得到的所有顱蓋骨轉(zhuǎn)移至另一無菌培養(yǎng)皿中，用剪刀將其剪成1*1mm大小。加入0.1%trypsin-0.02%edta消化液1ml，并將含細(xì)胞的消化液移入無菌離心管內(nèi)，然后將其置于

25、37oc培養(yǎng)箱中消化40min。 在離心管中加入2ml上述配置好的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，然后采用2000rpm離心5min，溫度設(shè)為20oc。 棄去上清液，加入上述配置好的細(xì)胞培養(yǎng)液2ml，用移液管吹勻后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，蓋上培養(yǎng)瓶蓋后（瓶蓋子不要擰太緊），將其放入5%co2培養(yǎng)箱中，在37攝氏度條件下培養(yǎng)2-3個小時后再取出加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，一開始加入的2ml培養(yǎng)液是為了幫助細(xì)胞貼壁生長，然后在將其放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 原代培養(yǎng)細(xì)胞過程中，每隔3-4天需換液一次。在無菌超凈工作臺上，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液倒入廢液缸中，然后加入含10%小牛血清的新鮮培養(yǎng)液，并加入少許雙抗。將換好液的培養(yǎng)瓶放

26、入37oc，5%co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 每隔24h于倒置顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行觀察，并記錄細(xì)胞生長情況（將細(xì)胞培養(yǎng)瓶拿出co2培養(yǎng)箱時，注意將瓶蓋擰緊，以免造成污染）。（5）成骨細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶時，對細(xì)胞進(jìn)行傳代。將長滿的細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于無菌超凈工作臺上。首先傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，用3ml pbs清洗兩遍，然后向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入0.1%trypsin-0.02%edta消化液1ml，將其放入37oc培養(yǎng)箱中消化5min后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況。待大部分細(xì)胞變圓并脫落時，即可終止消化。 向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入等量的配置好的細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行終止消化。然后用移液管吸取瓶

27、內(nèi)細(xì)胞懸浮液，并輕輕吹打細(xì)胞瓶，將瓶壁上未脫落的細(xì)胞吹打下來（吹打過程不要太過于劇烈）。用移液管將細(xì)胞懸浮液移入離心管中，設(shè)置2000rpm離心5min。 傾去上清液，向離心管中加入2ml新鮮培養(yǎng)液，制備細(xì)胞懸浮液，蓋上培養(yǎng)瓶蓋放入37oc 5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3個小時后，再取出培養(yǎng)瓶再無菌超凈工作臺上向培養(yǎng)瓶中加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，然后再放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3.2 接骨草中化學(xué)成分綠原酸溶液的配制（1）稱取100mg綠原酸粉末溶于10ml無血清培養(yǎng)基中，過濾2次，使溶液濃度為10mg/ml。（2）取1ml上述綠原酸溶液+4ml含血清培養(yǎng)基，則綠原酸原液濃度為28.2mm/l。（3）將

28、原液依次稀釋20倍,得到不同濃度的綠原酸溶液，濃度依次為1.41mm/l、0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.0881mm/l、0.0441mm/l、0.022mm/l、0.011mm/l、0.00551mm/l。3.3 綠原酸對成骨細(xì)胞增殖的檢測取出正在進(jìn)行成骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶，倒出培養(yǎng)液。加入2mlpbs溶液清洗2次，再加入0.1%trypsin-0.02%edta消化液1.5ml進(jìn)行消化，消化5-8min，待90%細(xì)胞變圓并脫離瓶底時，加入3-4ml含10%小牛血清的新鮮培養(yǎng)液，輕輕吹打使其混勻，終止消化。將懸浮液轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管中，于2000rpm離心

29、5min，傾去上清液。用1-2ml培養(yǎng)液吹打懸浮細(xì)胞，然后用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。培養(yǎng)成骨細(xì)胞以1*104個/ml密度接種于96孔塑料培養(yǎng)板，讓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)3-4h左右后，加入配制好的綠原酸溶液（濃度分別為1.41mm/l、0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.088mm/l、0.044mm/l、0.022mm/l、0.011mm/l、0.00551mm/l）100ml,每組設(shè)5個平行孔，在周圍不用的孔中加入100ml pbs以保證培養(yǎng)基水分，以防培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中失去水分，然后將96孔板放入37oc培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在測定前4-6小時取出96孔板，在無菌超凈工作臺上加入20ml

30、 1.5mg/ml mtt，繼續(xù)37攝氏度孵育4小時。取出96孔板，在無菌超凈工作臺上將孔板內(nèi)的培養(yǎng)液吸出，加入100ml二甲基亞砜（dmso）溶液，并吹打使其充分混勻，待沉淀溶解充分。在酶標(biāo)儀上，波長為492nm的條件下測定各孔光吸收值（od值）。每組5個平行，并記錄數(shù)據(jù)。用配置好的不加藥的細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對照，其他步驟同上。分別于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的1、3天對細(xì)胞進(jìn)行取樣，其他步驟同上。以時間為橫軸，光吸收值（od值）為縱軸繪制各濃度下細(xì)胞生長的柱形圖，并作誤差線。4 實驗結(jié)果4.1成骨細(xì)胞培養(yǎng)圖4-1 細(xì)胞原代培養(yǎng)1天圖4-2 細(xì)胞原代培養(yǎng)3天圖4-3 細(xì)胞原代培養(yǎng)5天圖4-4 細(xì)胞原代培養(yǎng)

31、6天圖4-5 細(xì)胞原代培養(yǎng)9天圖4-5 細(xì)胞傳代培養(yǎng)1天圖4-6 細(xì)胞傳代培養(yǎng)3天4.2 綠原酸對成骨細(xì)胞增殖的影響（1） 接骨草化學(xué)成分綠原酸對成骨細(xì)胞增值速率的原始實驗數(shù)據(jù)表4-1 測成骨細(xì)胞培養(yǎng)一天的od值（1）濃度（mm/l)01.410.7050.3530.1760.2440.1830.1830.1790.180.2270.1830.1820.1830.1860.2170.1850.1830.1820.1790.2110.1820.1830.1830.1830.2010.1810.1810.1760.18平均值0.220.18280.18240.18060.1816標(biāo)準(zhǔn)偏差0.016

32、40.001480.0008940.0030490.002881表4-2 測成骨細(xì)胞培養(yǎng)一天的od值（2）濃度（mm/l) 0.0881 0.0441 0.022 0.011 0.005510.1750.2050.2640.2570.260.180.2220.2630.2540.2670.1780.280.2540.2590.2610.1790.2210.2560.2440.2590.1790.230.260.2440.247平均值0.17820.23160.25940.25160.2588標(biāo)準(zhǔn)偏差0.001920.02850.004340.007160.00729表4-3 測成骨細(xì)胞培養(yǎng)三天

33、的od值（1）濃度（mm/l)01.410.7050.3530.1760.2040.1840.1820.1850.1780.2330.1850.1840.1840.1780.2420.1820.1820.1860.180.2460.180.1840.1850.1770.270.180.1810.1840.178平均值0.2390.18220.18260.18480.1782標(biāo)準(zhǔn)偏差0.02390.002280.001340.0008370.001095表4-4 測成骨細(xì)胞培養(yǎng)三天的od值（2）濃度（mm/l) 0.0881 0.0441 0.022 0.011 0.005510.1910.25

34、40.280.2820.2650.1920.2590.2740.3060.2920.1930.2710.2880.3090.2990.1940.2910.2760.3040.2730.1920.2660.2720.2940.219平均值0.19240.26820.2780.2990.2696標(biāo)準(zhǔn)偏差0.001140.01430.006320.011050.0315（2） 加入不同濃度綠原酸溶液后成骨細(xì)胞生長柱形圖表4-5 成骨細(xì)胞不同濃度下的生長情況od值（1）濃度（mm/l)01.410.7050.3530.1760天0.1960.1960.1960.1960.1961天0.220.1828

35、0.18240.18060.18163天0.2390.18220.18260.18480.1782表4-6 成骨細(xì)胞不同濃度下的生長情況od值（2）濃度（mm/l)0.08810.04410.0220.0110.005510天0.1960.1960.1960.1960.1961天0.17820.23160.25940.25160.25883天0.19240.26820.2780.2990.2696圖4-1 不同濃度下成骨細(xì)胞生長情況柱形圖（1）圖4-2 不同濃度下成骨細(xì)胞生長情況柱形圖（2）5 結(jié)果與討論5.1 實驗結(jié)果分析從圖4-1可看出，與對照組相比，培養(yǎng)一天的成骨細(xì)胞的od值在不加藥的情

36、況下od 值增長，說明培養(yǎng)一天的成骨細(xì)胞有所增長，細(xì)胞變多。當(dāng)加入的綠原酸濃度在1.41mm/l-0.881mm/l時，所測得的od值相較于0天未加藥的出現(xiàn)了下降，說明成骨細(xì)胞受到了抑制生長。當(dāng)加入的綠原酸濃度降低到0.044mm/l-0.00551mm/l時，測得的od值比對照組的都要高，說明在此較低的綠原酸濃度下，接骨草的化學(xué)成分綠原酸對小鼠成骨細(xì)胞生長有一定的促進(jìn)作用。由于一次測得的數(shù)據(jù)是服從正態(tài)分布的，多次實驗數(shù)據(jù)會在一個范圍內(nèi)發(fā)生變動，本實驗做五組平行試驗以減小誤差，通過做顯著性差異分析（t檢驗）可判斷每組實驗數(shù)據(jù)組之間是否存在顯著性差異。此處就利用顯著性差異分析進(jìn)行試驗結(jié)果的分析。

37、當(dāng)p0.05時數(shù)據(jù)組之間無顯著差異；當(dāng)0.01p0.05是數(shù)據(jù)組之間存在顯著差異；當(dāng)p0.01時，數(shù)據(jù)組之間存在極顯著差異。表5-1 顯著性差異分析數(shù)據(jù)（1天）濃度（mm/l)01.410.7050.3530.176t檢驗0.0009880.0009090.0007450.000868od平均值0.220.18220.18240.18060.1816濃度（mm/l) 0.0881 0.0441 0.022 0.011 0.00551t檢驗0.0004760.4530.0008290.004250.00130od平均值0.17820.23160.25940.25160.2588將對照組的五個od

38、值數(shù)據(jù)與加不同濃度綠原酸后測得的不同組的五個數(shù)據(jù)做顯著性差異分析，可得除了當(dāng)加入的綠原酸濃度為1.41mm/l時，兩組數(shù)據(jù)之間無顯著性差異，其他加藥濃度的數(shù)據(jù)組與對照組數(shù)據(jù)之間都存在極顯著差異。然后再來分析它們的od值，可得加藥濃度為0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.0881mm/l時，它們的od值相較于對照組都有所下降，說明細(xì)胞數(shù)量較少，對小鼠成骨細(xì)胞有一定的抑制作用；而加藥濃度為0.0441mm/l、0.022mm/l、0.011mm/l、0.00551mm/l時，它們的od值相較于對照組都有所升高，說明細(xì)胞數(shù)量增加，對小鼠成骨細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用。表5-2

39、顯著性差異分析數(shù)據(jù)（3天）濃度（mm/l)01.410.7050.3530.176t檢驗0.0007320.0007520.0009610.00046od平均值0.2390.18220.18260.18480.1782濃度（mm/l) 0.0881 0.0441 0.022 0.011 0.00551t檢驗0.002410.046980.007720.000930.121od平均值0.19240.26820.2780.2990.2696將對照組的五個od值數(shù)據(jù)與加不同濃度綠原酸后測得的不同組的五個數(shù)據(jù)做顯著性差異分析，可得當(dāng)加藥濃度為0.00551mm/l時，與對照組數(shù)據(jù)間無顯著性差異，當(dāng)加藥

40、濃度為0.0441mm/l時，兩組數(shù)據(jù)之間有顯著性差異，其它加藥濃度的數(shù)據(jù)組與對照組之間都存在極顯著差異。然后分析他們的od值，可得加藥濃度為1.41mm/l、0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.0881mm/l時，它們的od值相較于對照組都有所下降，說明細(xì)胞數(shù)量較少，對小鼠成骨細(xì)胞有一定的抑制作用；而加藥濃度為0.022mm/l、0.011mm/l時，它們的od值相較于對照組都有所升高，說明細(xì)胞數(shù)量增加，對小鼠成骨細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用。綜上所述，當(dāng)加入綠原酸的濃度較低為0.0441mm/l、0.022mm/l、0.011mm/l、0.00551mm/l時，對小鼠成

41、骨細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用；當(dāng)加入的綠原酸濃度較高為1.41mm/l、0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.0881mm/l時，對小鼠成骨細(xì)胞有一定的抑制作用。5.2 實驗影響因素分析實驗過程中難免會有實驗的誤差從而影響實驗數(shù)據(jù)的精確度，其中包括了人為誤差及機(jī)器誤差。在mtt檢測的過程中要將孔內(nèi)液體充分吹打均勻，選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。避免血清干擾：一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。設(shè)空白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。mtt實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是

42、直線關(guān)系。用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞做mtt測細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少mtt和dmso合適，根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulmtt,150uldmso 加dmso之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于dmso溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定。一般每孔4000個細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在10000個/ml，mtt加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul dmso，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中要特別注意保持無菌，在超凈工作臺上操作，用離心機(jī)離心小鼠成骨細(xì)胞時，離心管也應(yīng)用薄膜緊緊封住，操作過程中都需帶好手套，并使用酒精。致 謝在這個夏季，

43、我四年的大學(xué)學(xué)生生涯即將劃上一個句號，記得剛到學(xué)校時，會對武漢的天氣報以哀怨，會嫌棄學(xué)校的食堂，會嫌棄圖書館前飄著“香氣”的南湖，還會很討厭洗澡時要排著長長的隊伍等候位置，但如今卻都成為了美好而獨特的回憶。四年的光景里，在老師、家人及同學(xué)的教導(dǎo)與支持下，我收獲了很多也成長了很多。此次接近三個多月完成的論文即將接近尾聲之際，我要向所有扶持我、指點我的人表達(dá)我的感恩和致謝之情。感謝王朝元老師給我的悉心指導(dǎo)和幫助，從論文題目的確定，論文實驗的指導(dǎo)到論文寫作的修改，都是在您的督促和指導(dǎo)下，我才能順利地完成此篇畢業(yè)論文。在與您的交流中，您治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，學(xué)識淵博，思想深邃，視野雄闊，為我營造了一種良好的精神氛

44、圍，使我受益頗豐。感謝指導(dǎo)我?guī)椭业难芯可鷮W(xué)長學(xué)姐們，感謝宋超學(xué)姐悉心指導(dǎo)我成骨細(xì)胞培養(yǎng)的操作，感謝易繼凌學(xué)姐在mtt檢測操作方面對我的幫助和指導(dǎo)，還要感謝唐俊龍學(xué)長在實驗數(shù)據(jù)處理方面對我的悉心教導(dǎo)和點撥。如果沒有他們的指導(dǎo)和幫助，我的畢業(yè)論文實驗也就不會進(jìn)行的如此順利。感謝爸爸媽媽還有爺爺奶奶對我的支持，養(yǎng)育之恩無以回報，他們的安康和快樂是我最大的心愿。有了他們在背后默默地支持，無論遇到什么樣的困難，我都能勇敢地面對。最后還要感謝我的同學(xué)們，他們會在時刻我的身邊陪伴我，陪我笑陪我哭，陪我度過大學(xué)生活里的每一個日子。在他們的關(guān)懷和照顧下，我的每一天都過得快樂并且健康。在論文寫作過程中，他們也給予了我很多的幫助，使我順利完成了我的論文。鍵入這畢業(yè)論文的最后一段話，我的心里思緒