免疫學實驗,凝集反應Microsoft PowerPoint 演示文稿

1、 臨床免疫學實驗指導臨床免疫學實驗指導 海南醫(yī)學院海南醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院 吳榮泉吳榮泉 實實 驗驗 要要 求求 與與 實實 驗驗 室室 規(guī)規(guī) 則則 實驗課要求：實驗課要求： 1. 課前預習，明確目的，了解實驗內容與方法。閱讀實驗指導課前預習，明確目的，了解實驗內容與方法。閱讀實驗指導 2. 實驗過程嚴肅認真，按實驗規(guī)程操作，要有嚴格的科學態(tài)度實驗過程嚴肅認真，按實驗規(guī)程操作，要有嚴格的科學態(tài)度 3. 仔細觀察如實記錄實驗現(xiàn)象與結果，按時獨立完成實驗報告仔細觀察如實記錄實驗現(xiàn)象與結果，按時獨立完成實驗報告 實驗室規(guī)則：實驗室規(guī)則： 1. 進入實驗室必須穿整潔的隔離衣，嚴禁在實驗室內高聲

2、喧嘩進入實驗室必須穿整潔的隔離衣，嚴禁在實驗室內高聲喧嘩 2. 禁止在實驗室內飲食，吸煙和做與實驗無關的其他事情禁止在實驗室內飲食，吸煙和做與實驗無關的其他事情 3. 節(jié)約實驗用品，愛護儀器設備，如有損壞及時報告老師節(jié)約實驗用品，愛護儀器設備，如有損壞及時報告老師 4. 強化安全意識，注意水電安全。值日小組認真整理衛(wèi)生，強化安全意識，注意水電安全。值日小組認真整理衛(wèi)生， 保持實驗臺面清潔整齊，實驗廢物放入指定的垃圾桶內。保持實驗臺面清潔整齊，實驗廢物放入指定的垃圾桶內。 臨床免疫學實驗指導臨床免疫學實驗指導 第一部分第一部分 抗原抗體反應抗原抗體反應 （Antigen-Antibody Rea

3、ctionAntigen-Antibody Reaction） 抗原抗體反應概念：抗原抗體反應概念： 是指相應的抗原是指相應的抗原- -抗體在體內或體外發(fā)生的特異性結抗體在體內或體外發(fā)生的特異性結 合反應。合反應。 主要應用：主要應用： 1.1.用已知抗原檢測未知抗體，抗體效價用已知抗原檢測未知抗體，抗體效價 2.2.用已知抗體檢測未知抗原，明確病原生物用已知抗體檢測未知抗原，明確病原生物 抗原抗原- -抗體結合反應常用實驗方法：抗體結合反應常用實驗方法： 凝集反應凝集反應 沉淀反應沉淀反應 補體結合實驗補體結合實驗 免疫標記實驗技術免疫標記實驗技術 實驗目的：實驗目的：掌握抗原抗體結合反應的

4、原理，方法及其應用掌握抗原抗體結合反應的原理，方法及其應用 第一節(jié)第一節(jié) 凝集反應（凝集反應（AgglutinationAgglutination） 反應原理：反應原理： 顆粒型抗原與相應抗體在電解質溶液中出現(xiàn)凝集的想象顆粒型抗原與相應抗體在電解質溶液中出現(xiàn)凝集的想象 凝集反應方法：凝集反應方法： 直接凝集：直接凝集：顆粒性抗原和相應抗體直接出現(xiàn)凝集反應顆粒性抗原和相應抗體直接出現(xiàn)凝集反應 間接凝集：間接凝集：先將可溶性抗原吸附于大分子顆粒載體先將可溶性抗原吸附于大分子顆粒載體 表面表面,再與相應抗體結合發(fā)生凝集反應。再與相應抗體結合發(fā)生凝集反應。 具體實驗內容與方法：具體實驗內容與方法： 玻

5、片凝集試驗：玻片凝集試驗：傷寒沙門氏菌與痢疾志賀式菌的檢測，用已知抗血清傷寒沙門氏菌與痢疾志賀式菌的檢測，用已知抗血清 檢測患者體內未知抗原。檢測患者體內未知抗原。 操作見實驗指導操作見實驗指導 試管凝集試驗（微量反應板法）：試管凝集試驗（微量反應板法）：用已知顆粒性抗原與被檢血清混合，用已知顆粒性抗原與被檢血清混合， 然后觀察試管內有無凝集，并觀察血清凝集效價，判斷抗體濃度。然后觀察試管內有無凝集，并觀察血清凝集效價，判斷抗體濃度。 間接凝集試驗（類風濕因子檢測間接凝集試驗（類風濕因子檢測 RF）：屬自身免疫性疾?。簩僮陨砻庖咝约膊?受外界刺激，機體受外界刺激，機體IgG變性，產生抗原性（

6、變性，產生抗原性（RF），刺激自身產生抗變性），刺激自身產生抗變性 IgG抗體，此抗體與抗體，此抗體與RF因子結合形成免疫復合物沉積于病變部位。因子結合形成免疫復合物沉積于病變部位。 抗原抗體反應示意圖抗原抗體反應示意圖 NaClNaCl 可見反應可見反應 直接凝集反應直接凝集反應 定義：定義： 凝集反應凝集反應指細菌、紅細胞等指細菌、紅細胞等顆粒性抗原顆粒性抗原或或 表面覆蓋抗原的顆粒狀物質表面覆蓋抗原的顆粒狀物質( (如紅細胞、聚苯如紅細胞、聚苯 乙烯膠乳等乙烯膠乳等) )，與相應抗體結合，在一定條件，與相應抗體結合，在一定條件 下，形成肉眼可見的凝集團塊現(xiàn)象。下，形成肉眼可見的凝集團塊現(xiàn)

7、象。 實驗目的：實驗目的： 掌握抗原抗體結合反應的原理，方法及其應用掌握抗原抗體結合反應的原理，方法及其應用 屬免疫學最簡單最直接最常用的基礎實驗屬免疫學最簡單最直接最常用的基礎實驗 實驗一實驗一 凝集反應凝集反應 用已知的抗血清檢測被檢樣品中有無相對應的抗原用已知的抗血清檢測被檢樣品中有無相對應的抗原 【實驗內容【實驗內容】 玻片凝集：玻片凝集： 常用已知抗血清檢測未知抗原，常用已知抗血清檢測未知抗原，定性定性 試管凝集：試管凝集：可檢測未知的抗原或抗體可檢測未知的抗原或抗體并能并能報告凝集效價報告凝集效價 一、玻片凝集反應（定義）一、玻片凝集反應（定義） 當顆粒性抗原與相應的抗體發(fā)生特異性

8、結合時，兩者當顆粒性抗原與相應的抗體發(fā)生特異性結合時，兩者 比例適宜，在電解質溶液中呈現(xiàn)肉眼可見的顆粒狀比例適宜，在電解質溶液中呈現(xiàn)肉眼可見的顆粒狀 凝集，此現(xiàn)象稱凝集反應。凝集，此現(xiàn)象稱凝集反應。 【實驗材料【實驗材料】 1. 1:201. 1:20痢疾免疫血清，痢疾免疫血清，1:201:20傷寒免疫血清。傷寒免疫血清。 2. 2. 傷寒沙門菌菌液，痢疾志賀菌菌液。傷寒沙門菌菌液，痢疾志賀菌菌液。 3. 3. 生理鹽水，玻片，微量移液器，消毒缸等。生理鹽水，玻片，微量移液器，消毒缸等。 一、玻片凝集反應一、玻片凝集反應 1 2 取清潔玻片兩張，用記號筆，玻璃蠟筆作出標記和畫好取清潔玻片兩張，

9、用記號筆，玻璃蠟筆作出標記和畫好 分區(qū)，按實驗指導要求加樣操作。分區(qū)，按實驗指導要求加樣操作。 【方法【方法】 1. 1. 取潔凈玻片取潔凈玻片2 2張，各用記號筆劃分三等份。張，各用記號筆劃分三等份。 2. 2. 在玻片的左上角分別標記在玻片的左上角分別標記1 1和和2 2。 3. 3. 按下列要求依次加入反應物。按下列要求依次加入反應物。各種加量均為各種加量均為2020微升微升 4. 4. 轉動玻片，充分混勻轉動玻片，充分混勻1-2min1-2min后觀察反應結果并后觀察反應結果并作出解釋。作出解釋。 解釋說明出現(xiàn)凝集和不出現(xiàn)凝集的依據。解釋說明出現(xiàn)凝集和不出現(xiàn)凝集的依據。 1 2 生理生

10、理 1：20傷傷 1：20痢痢 鹽水鹽水 血清血清 血清血清 + + + 傷寒沙傷寒沙 傷寒沙傷寒沙 傷寒沙傷寒沙 門菌門菌 門菌門菌 門門 菌菌 生理生理 1：20傷傷 1：20痢痢 鹽水鹽水 血清血清 血清血清 + + + 痢疾志痢疾志 痢疾志痢疾志 痢疾志痢疾志 賀菌賀菌 賀菌賀菌 賀賀 菌菌 二、試管凝集反應二、試管凝集反應 【實驗原理【實驗原理】 將待檢血清將待檢血清作對倍稀釋作對倍稀釋后，加入后，加入等量的已知顆粒性抗原等量的已知顆粒性抗原與待與待 檢血清混合，抗原與不同稀釋度的抗體在試管內直接結合而出檢血清混合，抗原與不同稀釋度的抗體在試管內直接結合而出 現(xiàn)的凝集現(xiàn)象稱為試管凝集

11、反應。此法是一種半定量法?，F(xiàn)的凝集現(xiàn)象稱為試管凝集反應。此法是一種半定量法。 常用已知抗原常用已知抗原( (如細菌懸液，如細菌懸液，RBCRBC懸液懸液) )來測定被檢血清中來測定被檢血清中 相應抗體的水平相應抗體的水平( (效價或滴度效價或滴度) )。 用于檢測被檢血清中是否存在和用于檢測被檢血清中是否存在和已知抗原已知抗原相應的抗體相應的抗體 及抗體的效價：如；患者血清中免疫性抗體檢測。及抗體的效價：如；患者血清中免疫性抗體檢測。 例如例如 孕婦血清中免疫性孕婦血清中免疫性IgGIgG檢測，用于新生兒溶血病的診斷、檢測，用于新生兒溶血病的診斷、 病毒感染后，患者抗病毒抗體產生情況的觀察病毒

12、感染后，患者抗病毒抗體產生情況的觀察 【材料【材料】 1 11:201:20傷寒免疫血清。傷寒免疫血清。 2 2傷寒沙門菌菌液，甲型副傷寒沙門菌菌液。傷寒沙門菌菌液，甲型副傷寒沙門菌菌液。 3 3生理鹽水，生理鹽水，TIPTIP頭，微量移液器，頭，微量移液器， 4. U4. U型微量反應板。見下圖型微量反應板。見下圖 5 5恒溫培養(yǎng)箱等。恒溫培養(yǎng)箱等。 方法方法: 取取U型微量反應板，做好標記，加樣型微量反應板，做好標記，加樣 小心加樣！小心加樣！ 取取U U型微量反應板（做好個人或小組標記）型微量反應板（做好個人或小組標記） 于兩橫排于兩橫排110孔中各加入生理鹽水孔中各加入生理鹽水 每孔每

13、孔50l50l。 分別在兩橫排的分別在兩橫排的第第1 1孔孔內加入內加入1:201:20傷寒免疫血清傷寒免疫血清 50l50l， 每排各從第每排各從第1 1孔開始作對倍稀釋至第孔開始作對倍稀釋至第9 9孔，孔， 從第從第9 9孔混勻后棄去孔混勻后棄去50l50l。 第一橫排從第一橫排從第第1010孔至第孔至第1 1孔孔各加入各加入傷寒沙門菌傷寒沙門菌菌液菌液50l/50l/孔孔 第二橫排第二橫排同法各加入同法各加入甲型副傷寒沙門菌菌液甲型副傷寒沙門菌菌液50l/50l/孔。孔。 充分混勻后，置充分混勻后，置4545恒溫箱孵育恒溫箱孵育1h1h后取出。后取出。 室溫靜置室溫靜置15min15mi

14、n，最好在黑色背景下，觀察并報告結果。，最好在黑色背景下，觀察并報告結果。 血清對倍稀釋方法：血清對倍稀釋方法： 用微量移液器將第用微量移液器將第1 1孔的溶液連續(xù)吸吹三次，使孔的溶液連續(xù)吸吹三次，使 其充分混勻。吸出其充分混勻。吸出50l50l移入第移入第2 2孔孔 。同法吸吹三次。同法吸吹三次 使充分混勻后再吸出使充分混勻后再吸出50l50l移入第移入第3 3孔，如此作對倍孔，如此作對倍 稀釋至第稀釋至第9 9孔，吸吹混勻后吸出孔，吸吹混勻后吸出50l50l棄去。此時第棄去。此時第 1 19 9孔的血清稀釋度依次增加一倍，即血清對倍稀孔的血清稀釋度依次增加一倍，即血清對倍稀 釋法或倍比稀釋

15、法。釋法或倍比稀釋法。 注意：注意：做倍比稀釋吸取時插到管底，吹出時離開做倍比稀釋吸取時插到管底，吹出時離開 液液 面，沿孔壁吹出。動作要連續(xù)輕巧，切勿出錯面，沿孔壁吹出。動作要連續(xù)輕巧，切勿出錯 孔孔 號號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 生理鹽水（生理鹽水（l） 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1:20傷寒傷寒 50 50 50 50 50 50 50 50 50 免疫血清（免疫血清（l） （棄去棄去50 ） 血清稀釋度血清稀釋度 1:40 1:80 1:160 - - - - -1:10240 菌液（菌液（ll） 50 50 50 50 50 50

16、50 50 50 50 血清最終血清最終 1:80 1:160 1:320 -1:20480 充分混勻后，置充分混勻后，置4545孵育孵育1h1h，取出室溫靜置，取出室溫靜置15min 15min 觀察結果觀察結果 試管凝集試驗操作與稀釋圖示 第一排：每孔加入第一排：每孔加入傷寒沙門菌傷寒沙門菌 菌液菌液 50l。 菌液要充分混勻！菌液要充分混勻！ 第二排：每孔加入第二排：每孔加入甲型副傷寒沙門菌甲型副傷寒沙門菌 菌液菌液 50l 。 【結果觀察與判定【結果觀察與判定】 觀察結果：觀察結果：先觀察生理鹽水陰性對照孔（先觀察生理鹽水陰性對照孔（10空）空） 此孔不發(fā)生凝集，呈混懸菌液。此孔不發(fā)生

17、凝集，呈混懸菌液。液體混濁，管底液體混濁，管底 沉淀物呈圓形，邊緣整齊沉淀物呈圓形，邊緣整齊。此沉淀物是在靜置。此沉淀物是在靜置 過程中細菌因重力作用自然下沉形成。輕輕搖動過程中細菌因重力作用自然下沉形成。輕輕搖動 呈混懸液。呈混懸液。 然后自第然后自第1 1孔開始依次觀察孔內液體的混濁程度及孔孔開始依次觀察孔內液體的混濁程度及孔 底凝集塊的大小。底凝集塊的大小。 以以出現(xiàn)明顯凝集出現(xiàn)明顯凝集（）管號的血清滴度報告結果）管號的血清滴度報告結果 如：如：4 4孔孔+，5 5孔孔+，6 6孔孔+ +。則報告為：。則報告為：1 1：640640 凝集物凝集物 上清液上清液 凝集程度凝集程度 全部凝集

18、全部凝集 澄清透明澄清透明 +（凝集塊大，為最強凝集）（凝集塊大，為最強凝集） 大部份凝集大部份凝集 基本透明基本透明 + （凝集塊較大，為強凝集）（凝集塊較大，為強凝集） 有明顯凝集有明顯凝集 半透明半透明 +（凝集塊明顯，為中度凝集）（凝集塊明顯，為中度凝集） 很少凝集很少凝集 基本混濁基本混濁 +（凝集塊不明顯，為弱凝集）（凝集塊不明顯，為弱凝集） 不凝集不凝集 混混 濁濁 - （未見凝集塊，為不凝集）（未見凝集塊，為不凝集） + + + + - 強凝集強凝集 明顯凝集明顯凝集 弱凝集弱凝集 凝集效價判定凝集效價判定 1. 1.觀察第一排觀察第一排1-91-9管的凝集情況，作出判定：管的凝集情況，作出判定： 凝集效價（血清凝集滴度）的判定凝集效價（血清凝集滴度）的判定： 以能與一定量的抗原發(fā)生肉眼可見的以能與一定量的抗原發(fā)生肉眼可見的 明顯凝集（明顯凝集（+）的血清最高稀釋度）的血清最高稀釋度 結果報告