第十四章 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

1、1 14.3 液相色譜液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法質(zhì)譜聯(lián)用分析法 14.3 Hyphenated Technology of HPLC-MS 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS聯(lián)用） 2 對于熱穩(wěn)定性差、不易汽化的樣品，GSMS聯(lián)用有一定的困難。 因此，近年來又發(fā)展了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。LC分離要使 用大量的液態(tài)流動相，如何有效地除去流動相而不損失樣品，是 LCMS聯(lián)用的難題之一。目前應(yīng)用較多的有兩種接口裝置。 LC-MS用傳送帶聯(lián)接裝置用傳送帶聯(lián)接裝置 3 一一 、高效液相色譜、高效液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀 二、二、 離子源離子源 三、三、 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器 四、四、 串聯(lián)四級質(zhì)譜法的掃

2、描方式和模式串聯(lián)四級質(zhì)譜法的掃描方式和模式 五、檢測器和真空泵五、檢測器和真空泵 六、六、 LC-MSLC-MS分離條件的選擇和優(yōu)化分離條件的選擇和優(yōu)化 七、注意事項見建議七、注意事項見建議 4 一、液相色譜一、液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀 1. 1. 液質(zhì)聯(lián)用儀組成流程液質(zhì)聯(lián)用儀組成流程 5 p 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS） p 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/MS）； p 也可以質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用（MS-MS）。 基于色譜和質(zhì)譜的儀器靈敏度相當(dāng)， 加之使分離效果好的色譜成為質(zhì)譜的進(jìn)樣 器，而速度快、分離好、應(yīng)用廣的質(zhì)譜儀 作為色譜的鑒定器，使它們成為目前最好 的用于分析微量的有機(jī)混

3、合物的儀器。 一、液相色譜一、液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀 2. 2. 液質(zhì)聯(lián)用儀類型液質(zhì)聯(lián)用儀類型 6 p 氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適 宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用 電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。 p 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題： 不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱 不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、 多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對 比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖 u 液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別: 7 LC-MS聯(lián)用儀系統(tǒng)構(gòu)成

4、8 廣適性檢測系統(tǒng) 3. 3. 液質(zhì)聯(lián)用的優(yōu)勢液質(zhì)聯(lián)用的優(yōu)勢 一、液相色譜一、液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀 9 分析熱不穩(wěn)定化合物 分析氣相色譜-質(zhì)譜無法分析的樣品 分析大分子量的化合物，如生化樣品 極高的靈敏度 10 進(jìn)一步增加 HPLC 的分離能力 11 4. LC-MS 4. LC-MS 聯(lián)用中的轉(zhuǎn)變過程聯(lián)用中的轉(zhuǎn)變過程 液相色譜的現(xiàn)實情況： 從高效液相色譜流出的化合 物存在于大氣壓條件下的溶液之中 質(zhì)譜的現(xiàn)實情況： 在高真空工作條件下的質(zhì)譜僅接 受氣相的離子: : 因此，液質(zhì)聯(lián)用的接口接口必須完成: 帶電狀態(tài): “中性 ”-離子 物態(tài)轉(zhuǎn)變：液態(tài) - 氣態(tài) 真空變化: 760 to

5、rr 760 torr - 10 10-5 -5 10 10-8 -8 torr torr 。 p 從從LC-MSLC-MS轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)變 p LC-MSLC-MS轉(zhuǎn)變過程轉(zhuǎn)變過程 l 去除溶劑 l 保留樣品 l 電離化合物 12 p 接口 13 p API API接口：接口：Z-Spray Z-Spray 接口接口 14 二、離子源 p 大氣壓電離大氣壓電離 (API) 技術(shù)技術(shù) 目前，LC-MS采用大氣壓離子化（Atmospheric pressure ionization, API)技術(shù)作為液質(zhì)聯(lián)用的接口技術(shù)，也是質(zhì)譜離子 化技術(shù)。 p APIAPI主要包括：主要包括： 電噴霧 electro

6、spray ionization, ESI 大氣壓化學(xué)電離 atmospheric pressure chemical ionization, APCI p 離子源：使樣品產(chǎn)生離子的裝置叫離子源。 15 （一）電噴霧離子源一）電噴霧離子源 ESIESI （二）大氣壓化學(xué)電離（二）大氣壓化學(xué)電離APCIAPCI （三）（三）ESIESI與與APCIAPCI比較比較 二、離子源 16 電噴霧離子化ESI接口 電噴霧離子化ESI特征 電噴霧離子化ESI過程 影響化合物 ESIESI電離的因素 （一）（一） 電噴霧離子化電噴霧離子化 ESIESI 17 1. ESI 1. ESI 接口接口 （一）（一

7、） 電噴霧離子源電噴霧離子源 氮氣用來做去溶劑氣和錐孔氣 氬氣做碰撞氣 先形成帶點電荷先形成帶點電荷 18 l 低分子量化合物一般產(chǎn)生單電荷離子(失去或得到一個 質(zhì)子) l 高分子量生物大分子和聚合物產(chǎn)生多電荷離子 l 幾乎沒有碎片離子 l 可能生成加合物和/或多聚體;常見的是溶劑加合物和 NH4+(M+18), Na+(M+23),和K+(M+39) 加合物 l 靈敏度取決于化合物本身和基質(zhì) （一）（一） 電噴霧離子源電噴霧離子源 2. ESI 特征 19 u（1）形成帶電小液滴 u （2）溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂 u （3）最終形成氣相離子 3. 電噴霧離子化電噴霧離子化ESIESI過程過程

8、（一）（一） 電噴霧離子源電噴霧離子源 20 u（1 1）形成帶點離子）形成帶點離子 3. 電噴霧離子化電噴霧離子化ESIESI過程過程 21 22 u （2 2）溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂）溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂 3. 電噴霧離子化電噴霧離子化ESIESI過程過程 23 u（3 3）形成氣相離子）形成氣相離子 對于半徑對于半徑 10nm10nm的液滴的液滴 , , 電荷的排斥作電荷的排斥作 用導(dǎo)致離子從用導(dǎo)致離子從 液滴表面蒸液滴表面蒸 發(fā)而不是液滴發(fā)而不是液滴 的分裂。離子的分裂。離子 從溶液中轉(zhuǎn)移從溶液中轉(zhuǎn)移 至氣相至氣相 3. 電噴霧離子化電噴霧離子化ESIESI過程過程 24 4. ESI-

9、MS4. ESI-MS的基本離子化原理是：的基本離子化原理是： 溶劑由液相泵輸送到ESI毛細(xì)管，經(jīng)其內(nèi)的不銹鋼毛 細(xì)管流出，在ESI高壓電極處施以負(fù)的高電壓, 小液滴 從毛細(xì)管高速噴出而帶有過量的負(fù)電荷. 從而產(chǎn)生電 化學(xué)反應(yīng)：通過溶劑組分氧化而去掉正離子或通過毛 細(xì)管自身的氧化而增加負(fù)離子。在高溫和氮氣的吹掃 下，溶劑逐漸揮發(fā)，變成小顆粒的液滴，由于高電場 作用，極性溶質(zhì)成為帶電離子溶解在溶劑液滴上，當(dāng) 溶劑顆粒逐漸減小，小到一定程度，帶電的溶質(zhì)粒子 便從液滴表面蒸發(fā)出來，形成帶電離子，完成離子化 25 （4）影響化合物 ESIESI電離的因素 l (a）化合物的濃度 l (b）基質(zhì)的性質(zhì)

10、l (c) 化合物的表面活性 l (d) 流速 26 離子的釋放取決 于濃度. 信號在 10 M 時達(dá)到飽和. 線性動態(tài)范圍 限制在2-3個數(shù)量 級 信號的飽和歸因 于離子在液滴表 面過于密集,致使 某些樣品離子不 能到達(dá)液滴表面. l ESI: 樣品濃度對其響應(yīng)的影響 27 28 l ESI:ESI: 基質(zhì)對樣品響應(yīng)的影響基質(zhì)對樣品響應(yīng)的影響 u 一般而言,樣品信號強度響應(yīng)隨著其 它電解質(zhì)濃度的增高而降低; u 這一現(xiàn)象叫作離子抑制。 u 樣品離子和電解質(zhì)離子對電荷及占 據(jù)液滴表面的競爭導(dǎo)致離子抑制。 表面競爭表面競爭 電荷競爭電荷競爭 29 p 基質(zhì)選擇一般原則基質(zhì)選擇一般原則 一般而言，

11、對于正離子檢測模式，樣品必須比基 質(zhì)更具堿性，以便形成 (M+H)+ 或足夠的極性去 形成穩(wěn)定的加和離子，例 (M+NH4)+。 對于負(fù)離子檢測模式，樣品必須比基質(zhì)更具酸性， 以便形成 (M-H)- 或足夠的極性去形成穩(wěn)定的加 和離子，例如 (M+OAc)-。 l ESI:ESI: 基質(zhì)對樣品響應(yīng)的影響基質(zhì)對樣品響應(yīng)的影響 30 l ESI: ESI: 流速對樣品響應(yīng)的影響流速對樣品響應(yīng)的影響 ESI 響應(yīng)隨流速 的增加而降低 對 ESI 接口來 說,最佳工作流 速為100-250 L/min. 31 大氣壓化學(xué)電離源 APCI接口 大氣壓化學(xué)電離源APCI特征 大氣壓化學(xué)電離源過程 ( (二

12、）二） 大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源 APCIAPCI 32 （二）（二） 大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源 APCI 1. APCI 1. APCI接口接口 霧化霧化 33 2. 大氣壓化學(xué)電離源APCI特征 一般而言, 只生成單電荷離子 幾乎沒有碎片離子 可能生成加合物和/或多聚體; 一般是溶劑加合 物及NH4+ (M+18), Na+ (M+23), 和 K+(M+39) 加合物 基質(zhì)影響較小 (相對于 ESI)。質(zhì)譜圖不受緩沖 鹽及其緩沖力變化的影響 34 3. 大氣化學(xué)電離過程 大氣壓化學(xué)電離可分為以下兩個 步驟: l （1）快速蒸發(fā) l （2）氣相化學(xué)電離(電暈放電) 35 l

13、 （1）快速蒸發(fā) 液流被強迫通過一根窄的管路以使其得到高的線速度 高溫加熱器和噴霧器使液流在脫離管路時蒸發(fā)成氣體 由于溶劑蒸汽的保護(hù)，樣品分子較少受熱裂解的影響，大量的 熱量用于溶劑的蒸發(fā)，但是有時也會有熱不穩(wěn)定樣品分解 36 l （2）氣相化學(xué)電離 37 Needle 噴霧針噴霧針 （ Corona Needle 電暈針電暈針 reagent gas 試劑氣試劑氣 離子離子-分子反應(yīng)分子反應(yīng) 2. 大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源 APCI 38 大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源 APCI 離子離子-分子反應(yīng)分子反應(yīng) 質(zhì)質(zhì) 子子 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 移移 電電 子子 捕捕 獲獲 電電 荷荷 交交 換換 離

14、離 子子 加加 和和 適合于熱穩(wěn)定、易氣化的小分子低極性化合物適合于熱穩(wěn)定、易氣化的小分子低極性化合物 39 （三）（三）ESI與與APCI的比較的比較 共同點 都屬于大氣壓電離法（都屬于大氣壓電離法（APIAPI） 通常產(chǎn)生通常產(chǎn)生 (M+H)+ 或或 (M-H)- 等準(zhǔn)分子離子等準(zhǔn)分子離子 都使用高電壓元件和霧化氣噴霧法產(chǎn)生氣相離子都使用高電壓元件和霧化氣噴霧法產(chǎn)生氣相離子 產(chǎn)生極少的碎片，但可以控制產(chǎn)生結(jié)構(gòu)碎片產(chǎn)生極少的碎片，但可以控制產(chǎn)生結(jié)構(gòu)碎片 40 ESI與與APCI的比較的比較 不同點 生成離子方式不同生成離子方式不同 樣品兼容性不同樣品兼容性不同 流速兼容性不同流速兼容性不同

15、ESI ：液相離子化：液相離子化 APCI ：氣相離子化：氣相離子化 ESI ：0.2-0.5ml/min APCI ：0.5-1ml/min ESI ：極性化合物和：極性化合物和 生物大分子生物大分子 APCI ：非極性：非極性, 小分子小分子 化合物化合物 (相對于用相對于用 ESI電電 離的化合物而言離的化合物而言) 且有一且有一 定的揮發(fā)性定的揮發(fā)性 41 42 樣品已經(jīng)變成氣相離子 樣品仍處于大氣壓下 必須把樣品送入質(zhì)譜高真空環(huán)境中 43 蒸氣通過樣品錐孔進(jìn)入一級真空區(qū)(離子源區(qū))并且膨脹 蒸氣在膨脹時會冷卻 這種冷卻可能導(dǎo)致在被分析物離子上的溶劑凍結(jié)從而生成各種 質(zhì)量數(shù)的簇離子 一

16、級真空一級真空 成簇過程成簇過程 簇離子會降低所要檢測的被分析物質(zhì) 量處的信號；簇離子會增加背景信號 44 l 加熱一級真空區(qū) (離子源區(qū)) 以阻止簇離子的生 成,使不帶溶劑的樣品離子被檢測 l 在通過加熱的離子源區(qū)以后,樣品離子在靜電場 作用下通過萃取錐孔 l 通過萃取錐孔后, 樣品離子進(jìn)入六極桿聚焦透鏡 l 從六極桿聚焦透鏡出來,樣品離子進(jìn)入四極桿質(zhì) 量分析器 45 三三. . 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器 雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector). 四極質(zhì)譜儀(Q). 飛行時間質(zhì)譜儀(TOF). 離子阱質(zhì)譜儀（TRAP） 四極四極+TOF+TOF（Q-TOFQ-TOF） 串列式多級質(zhì)譜儀串列

17、式多級質(zhì)譜儀三重四極（三重四極（QqQQqQ） (MS/MS) (MS/MS) TOF+TOF TOF+TOF 1. 1. 分類分類 46 單四極桿分析器單四極桿分析器 QuadrupoleQuadrupole 由四根棒狀電極組成由四根棒狀電極組成 直流電壓：直流電壓：DCDC 射頻電壓：射頻電壓：RFRF形成二維四極電場形成二維四極電場 離子在場的作用下產(chǎn)生振動，碰到四極桿而被吸收離子在場的作用下產(chǎn)生振動，碰到四極桿而被吸收 通過四極桿的離子到達(dá)檢測器被檢測通過四極桿的離子到達(dá)檢測器被檢測 2. 2. 四級桿分析器四級桿分析器 47 48 通過改變通過改變RF，從而改變通過的離子質(zhì)量，從而改

18、變通過的離子質(zhì)量 離子質(zhì)量離子質(zhì)量 時時 間間 掃描循環(huán)時間掃描循環(huán)時間 掃描時間掃描時間 回程回程 時間時間 程程 序序 處處 理理 時時 間間 49 串聯(lián)質(zhì)量分析器串聯(lián)質(zhì)量分析器 空間串聯(lián)空間串聯(lián) 時間串聯(lián)時間串聯(lián) 空間空間 - 時間串聯(lián)時間串聯(lián) 四極桿串聯(lián)四極桿串聯(lián) Q-Q-Q 離子阱離子阱 FTICR Q-Trap 都有碰撞活化室都有碰撞活化室 50 實驗室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類型：實驗室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類型： 串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(MS/MS) ： 三重四極（QqQ） 離子源第一分析器碰撞室第二分析器接收器 MS1 MS2 Q1 q2 Q3 第一級質(zhì)量分析器第一級質(zhì)量分析器：用于選擇一個前體離

19、子或母離子，然后，用：用于選擇一個前體離子或母離子，然后，用 適當(dāng)?shù)幕罨椒ㄊ沁@一離子裂解成產(chǎn)物離子或稱子離子及中性碎片。適當(dāng)?shù)幕罨椒ㄊ沁@一離子裂解成產(chǎn)物離子或稱子離子及中性碎片。 mmp p+ + m mf f + +m+mn n mmp p+ + 為前體離子； 為前體離子； mmf f+ + 為產(chǎn)物離子；為產(chǎn)物離子； mmn n為中性碎片為中性碎片； 第二級質(zhì)量分析器第二級質(zhì)量分析器：用于產(chǎn)物離子分析：用于產(chǎn)物離子分析 如從產(chǎn)物中再選擇一個離子，分析最后選擇的離子的碎片，則標(biāo)如從產(chǎn)物中再選擇一個離子，分析最后選擇的離子的碎片，則標(biāo) 記記MS/MS/MSMS/MS/MS，數(shù)級可進(jìn)一步增加至

20、，數(shù)級可進(jìn)一步增加至n n次，實現(xiàn)次，實現(xiàn)MSMSn n實驗實驗 51 串聯(lián)質(zhì)量分析器串聯(lián)質(zhì)量分析器 三重四極桿三重四極桿 三個四極桿串聯(lián)三個四極桿串聯(lián) Q-Q-Q Q1 質(zhì)量分離質(zhì)量分離 Q2 碰撞活化碰撞活化 CID Collision-Induced Dissociation Q3 質(zhì)量分離質(zhì)量分離 52 3. 碰撞誘導(dǎo)解離CID 質(zhì)譜 QqQ 檢測器中的碰撞反應(yīng)在CID 中進(jìn)行。 選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子，進(jìn)入 碰撞室，室內(nèi)充有靶子反應(yīng)氣體(本實驗室 選擇高純氦) ，發(fā)生離子分子碰撞反應(yīng)， 從而產(chǎn)生子離子，再經(jīng)MS2的分析器 及接受器得到子離子質(zhì)譜， 一般稱做CID (colli

21、sion-induced dissociation)譜。 53 CID CID 產(chǎn)生的過程產(chǎn)生的過程 54 4. 4. 影響影響CIDCID質(zhì)譜的因素：質(zhì)譜的因素： l 較大影響的因素有：所用碰撞氣體的種類，壓力，離子的能量， 儀器的配置以及離子電荷狀態(tài) l 由于在不同的儀器上不可能在完全相同的條件下去分析樣品， 任何一個給定的化合物將在不同的條件下給出差別或大或小的 質(zhì)譜，尤其是各個離子峰的相對豐度的差別幾乎是無法避免的。 因而目前尚難以建立商品化的譜庫供檢索使用，只能進(jìn)行人工 解析或自己建庫。 l 大氣壓電離技術(shù)中產(chǎn)生的離子為偶數(shù)電子離子，其主要的碎片 應(yīng)由化學(xué)鍵的誘導(dǎo)斷裂和重排反應(yīng)來產(chǎn)生

22、，所以在EI質(zhì)譜解析 中總結(jié)出的偶數(shù)電子離子的開裂規(guī)則一般可適用于CID質(zhì)譜的 解釋。 55 四、掃描方式和掃描模式四、掃描方式和掃描模式 p 全掃描(Full Scan) p 子離子掃描(Daughter Scan) p 母離子掃描(Parent Scan) p 中性碎片丟失掃描(Constant Neutral Loss Scan) p 選擇離子監(jiān)測(SIR) p 多反應(yīng)監(jiān)測(MRM) （一）掃描方式（一）掃描方式 （二）掃描模式（二）掃描模式 p 正離子模式 p 負(fù)離子模式 56 1 1、全掃描、全掃描 p 特征：特征： 質(zhì)譜掃描得到一段質(zhì)量范圍從而獲得質(zhì)譜圖 用于未知物的結(jié)構(gòu)分析 用于

23、SIR方法的開發(fā)以及MRM方法開發(fā)尋找母離子最佳電離參數(shù) Q3Q2Q1 = scanned = CID = selected m/z l 定性定性 尋找總分子離子峰尋找總分子離子峰 出峰時間出峰時間 57 p LC-MS LC-MS中常見的本底離子中常見的本底離子 m/z 50-150, 溶劑離子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549 m/z149, 管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233 m/z 288, 2mm 離心管的產(chǎn)生的特征離子 m/z 279, 管路中鄰苯二甲酸二丁酯 C16H22O

24、4H+, 279.1591 m/z 316, 2mm 離心管的產(chǎn)生的特征離子 m/z 384, 瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子 m/z391, 管路中鄰苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+, 391.2843 m/z413, 鄰苯二甲酸二辛酯+鈉, C24H38O4Na+, 413.2668 m/z 538, 乙酸+氧 +鐵（噴霧管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793 58 Q3Q2Q1 = scanned = selected m/z = CID p 過程：過程： 通過Q1 選擇目標(biāo)物質(zhì)的母離子，在Q2 發(fā)生碰撞反應(yīng)， Q3 對目標(biāo)物質(zhì)豐度最大的子離子進(jìn)行掃描。 2 2、子離子掃描

25、、子離子掃描 p 特征：特征： 監(jiān)測單個離子或一系列單個離子 目標(biāo)化合物的跟蹤 提高采集靈敏度 100230 59 p 子離子質(zhì)譜圖子離子質(zhì)譜圖 用MS2MS2質(zhì)量分析器掃描指定母離子的子離子碎片， 所得到的質(zhì)譜圖只能是由指定母離經(jīng)碰撞產(chǎn)生。 60 p 子離子掃描質(zhì)譜圖 61 用MS1MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定質(zhì)譜碎片的 母離子，所得到的母離子質(zhì)譜峰一定是能丟失 指定質(zhì)譜碎片的母離子。 p 母離子質(zhì)譜圖 3 3、母離子掃描、母離子掃描 62 p母離子掃描質(zhì)譜圖母離子掃描質(zhì)譜圖 63 4 4、中性碎片丟失、中性碎片丟失 母離子掃描、中性丟失掃描可用來研究結(jié) 構(gòu)相似性化合物（如具有相同結(jié)構(gòu)碎片

26、、 或相同結(jié)構(gòu)基團(tuán)的化合物） Q3Q2Q1 = scanned = CID = scanned with offset 64 p 中性碎片丟失掃描質(zhì)譜圖 MS1MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定中性碎片的母離子，MS2MS2質(zhì)量 分析器掃描丟失指定中性碎片的離子，所得到的質(zhì)譜圖是由 MS1MS1掃描的母離子，母離子只能是丟失指定中性碎片的離子 65 p 中性碎片丟失掃描質(zhì)譜圖 66 5. 選擇離子掃描 Q3Q2Q1 = scanned = selected m/z = CID 定 量 滿足一般要求 信噪比不如MRM 只監(jiān)測指定的離子 67 p 選擇離子記錄(SIR) MS1MS1質(zhì)量分析器是靜態(tài)，

27、并且只監(jiān)測指定的離子。 68 p 選擇離子記錄掃描 69 6.多反應(yīng)監(jiān)測多反應(yīng)監(jiān)測 SRM & MRMSRM & MRM p 特征：特征： 監(jiān)測特定母離子產(chǎn)生特定子離子碎片的化合物 目標(biāo)化合物的跟蹤 提高采集靈敏度，是靈敏度最高的定量采集方式 定定 量量 最佳選擇最佳選擇 干擾小干擾小 信噪比高信噪比高 Q3Q2Q1 = scanned = selected m/z = CID 70 p 子離子質(zhì)譜圖子離子質(zhì)譜圖 指定的母離子產(chǎn)生一指定的子離子，兩個質(zhì)量分析 器都是靜態(tài)的。 71 p 多反應(yīng)監(jiān)測掃描 72 串聯(lián)質(zhì)量分析器串聯(lián)質(zhì)量分析器 三重四極桿三重四極桿 73 化合物鑒別化合物鑒別 全掃描方

28、式（全掃描方式（Q1Q1掃描）掃描） 全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子， 從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有 未知物，并確認(rèn)一些判斷不清的化合物，如合成 化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu)。 子離子分析（子離子分析（ MS/MS MS/MS ） 子離子，用于結(jié)構(gòu)判斷(得到化合物的二級譜圖即 碎片離子)和選擇離子對作多種反應(yīng)監(jiān)測 （MRM）。 子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內(nèi)CID）可能 十分相似，所不同的是子離子質(zhì)譜圖已知只有一 種質(zhì)量通過MS1，因此也已知所有碎片離子都是 由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的，所以我們更相 信由MS/MS產(chǎn)生的譜圖的純度。 74 （二）掃描模式 一般的商品儀器中,

29、ESI 和APCI 接口都有正 負(fù)離子測定模式可供選擇。 一般不要選擇兩種模式同時進(jìn)行。 正、負(fù)離子模式建議根據(jù)文獻(xiàn)選擇。 75 正離子模式：正離子模式： 適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣 品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時 可優(yōu)先考慮使用正離子模式。 2. 2. 負(fù)離子模式：負(fù)離子模式： 適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣 品進(jìn)行堿化。樣品中有較多的強伏電性 基團(tuán)，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗 試使用負(fù)離子模式。 （二）掃描模式 選擇的一般原則為選擇的一般原則為 76 檢檢 測測 器器 數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 分分 析析 電電 子子 倍倍 增增 管管光光 電電 倍倍 增增 管管電電 子子 倍倍 增增

30、 管管 打打 拿拿 極極 PC Q3 五、檢測器和真空泵五、檢測器和真空泵 77 高真空泵高真空泵 10-6Torr 油擴(kuò)散泵油擴(kuò)散泵渦輪分子泵渦輪分子泵 極限真空可達(dá)極限真空可達(dá)10-5 -10-6Torr 蒸汽噴射泵蒸汽噴射泵 泵液蒸汽返流，提高本泵液蒸汽返流，提高本 底、易污染系統(tǒng)底、易污染系統(tǒng) 五、檢測器和真空泵五、檢測器和真空泵 78 高真空泵高真空泵 10-6Torr 油擴(kuò)散泵油擴(kuò)散泵渦輪分子泵渦輪分子泵 真空可達(dá)真空可達(dá)10-5 10-6Torr 小型蒸汽渦輪機(jī)小型蒸汽渦輪機(jī) 高速旋轉(zhuǎn)葉片高速旋轉(zhuǎn)葉片 貴、易損貴、易損 79 真空系統(tǒng)其他附件真空系統(tǒng)其他附件 真空規(guī)（真空計）真空

31、規(guī)（真空計） 真真 空空 管管 道道 真真 空空 閥閥 門門 吸吸 附附 阱阱 抽抽 氣氣 方方 式式 單泵抽氣方式單泵抽氣方式雙泵差動抽氣方式雙泵差動抽氣方式 80 1. 1. 樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理： u從保護(hù)儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵 塞進(jìn)樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低 分析背景，排除對分析結(jié)果的干擾。 u要求獲得最佳的分析結(jié)果，從ESI電離的過 程分析：ESI電荷是在液滴的表面，樣品與 雜質(zhì)在液滴表面存在競爭，不揮發(fā)物（如 磷酸鹽等）防礙帶電液滴表面揮發(fā)，大量 雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣相狀態(tài)，增 加電荷中和的可能。 六、六、 LC-MSLC-MS分離條件的選擇和優(yōu)化分離條件的

32、選擇和優(yōu)化 p分離條件選擇分離條件選擇 81 樣品的預(yù)處理常用方法樣品的預(yù)處理常用方法 a）超濾 b）溶劑萃取去鹽 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）凈化去鹽 e）色譜分離 反相色譜分離 親和技術(shù)分離 f）甲醇或乙腈沉淀蛋白 g）酸水解，酶解 h）衍生化 82 2. 2. 電離源的選擇電離源的選擇 ESI適合于中等極性到強極性的化合物分子，特 別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和 可以獲得多個質(zhì)子的大分子（蛋白質(zhì)）。只要 有相對強的極性，ESI對小分子的分析常?？梢?得到滿意的結(jié)果。 APCI不適合多電荷的大分子分析，它的優(yōu)勢在 于非極性或中等極性的小分子的分析。 83 電離方式

33、電離方式 ESI采用離子蒸發(fā)方式使樣品分子電離，而APCI電離是 放電探針促使溶劑和其它反應(yīng)物電離、碰撞及電荷轉(zhuǎn)移等方式 形成了反應(yīng)氣等離子區(qū)，樣品分子通過等離子區(qū)時，發(fā)生了質(zhì) 子轉(zhuǎn)移。 樣品流速樣品流速 APCI源允許的流量相對較大，0.2-2mL/min，而ESI源 允許流量相對較小，最大只能為1.0mL/min。 斷裂程度斷裂程度 APCI源的探頭處于高溫，可使熱不穩(wěn)定的化合物分解， 產(chǎn)生碎片；ESI源探頭處于常溫，常生成分子離子峰，不易產(chǎn)生 碎片。 靈敏度靈敏度 都很高。ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化 合物，而APCI更適合于分析極性小的化合物。 多電荷多電荷 APCI源

34、不能生成一系列多電荷離子，所以不適合分析生 物大分子。而ESI源特別適合于蛋白質(zhì)、多肽類的生物分子，由 于它能產(chǎn)生一系列的多電荷離子。 84 3. 3. 正負(fù)離子模式的選擇正負(fù)離子模式的選擇 l 正離子模式適合于堿性樣品，可用乙酸（pH 3-4）或甲酸（pH2-3）對樣品加以酸化。 l 負(fù)離子模式適合于酸性樣品，可用氨水或三 乙胺對樣品進(jìn)行堿化。 l 有些酸堿性并不明確的化合物，可優(yōu)先選用 APCI（+）進(jìn)行測定。 85 4. 4. 流動相的選擇流動相的選擇 u 常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物 以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可 以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸

35、和氨水等調(diào)節(jié)pH值。 u LCMS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩 沖液，含鈉和鉀的成分必須lmmol/l。（鹽分太高會抑制 離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸） 2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸銨 10一5 mmol/l。 u 送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合 MS要求。 86 不適合的溶劑和緩沖液不適合的溶劑和緩沖液 a 不揮發(fā)的鹽 b 表面活性劑/洗滌劑 c 無機(jī)酸 其它溶劑和調(diào)節(jié)劑其它溶劑和調(diào)節(jié)劑 a 異丙醇、2-甲氧基乙醇及乙醇等 b 三氟醋酸（TFA）常用于LC-MS分析肽 和蛋白質(zhì)的化合物 c 三乙胺（TEA） d 四氫呋喃

36、（THF) 87 5. 5. 流量和色譜柱的選擇流量和色譜柱的選擇 u不加熱ESI的最佳流速是150ulmin，應(yīng)用 4.6 mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多 采用 l2.1 mm內(nèi)徑的微柱 uAPCI的最佳流速lmlmin，常規(guī)的直徑 4.6mm柱最合適。 u為了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱 （此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜 定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組 分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可 以節(jié)省大量的時間。 88 6. 6. 輔助氣體流量和溫度的選擇輔助氣體流量和溫度的選擇 u 霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響 噴霧去溶劑效果，碰撞氣

37、影響二級質(zhì)譜的產(chǎn)生。 u操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥 氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分 析物的沸點20 左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合 物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。 u選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相 的組成，有機(jī)溶劑比例高時可采用適當(dāng)?shù)偷臏?度和流量小一點的。 89 用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息 正離子方式常出現(xiàn)如下離子: -Na 22 Da. higher than M+H -K 38 Da. higher than M+H -Li 6 Da. higher than M+H -NH4 17 Da. higher

38、 than M+H -ACN 40 Da. higher than M+H 2M+H,2M+Na等 負(fù)離子方式常出現(xiàn)如下離子: -TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background) -Acetate 60 Da. higher then M-H -Formic 46 Da. higher then M-H -Cl 36 Da. higher than M-H 90 影響分子量測定的因素 1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)離子方式pH要高些，除對 離子化有影響外，還影響LC的峰形。 2）氣流和溫度：當(dāng)水含量高及流量大時要相應(yīng)增加。 3）

39、溶劑和緩沖液流量：流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度。 4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負(fù)離子乙腈好些 5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱 6）合適的電壓：DP電壓高時，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓 時回使多電荷離子比例低，多聚體也減少 7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì) 太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好 9）樣品濃度不夠，有時需要濃縮 91 分子量測定失敗的原因 a）流動相不合適 b）不揮發(fā)性鹽的影響 c）成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多 d) 樣品濃度不夠 e）pH值不合適 f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂 92

40、一一 般般 步步 驟驟 確定離子源、正負(fù)模式確定離子源、正負(fù)模式 優(yōu)化流動相、離子源參數(shù)，使優(yōu)化流動相、離子源參數(shù)，使Q1信號最大化信號最大化 打開打開Q2、Q3，優(yōu)化，優(yōu)化CID，確定子離子，確定子離子 優(yōu)化優(yōu)化Detector、Scan time等等參數(shù)等等參數(shù) p 分離參數(shù)優(yōu)化分離參數(shù)優(yōu)化 93 分分 析析 待待 測測 物物 性性 質(zhì)質(zhì) 極極 性性 極性、弱極性極性、弱極性 ：ESI 非極性非極性：APCI 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性 熱不穩(wěn)定熱不穩(wěn)定 ：ESI 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定：APCI 分分 子子 量量 310LC-MS/MS 2000 特殊性質(zhì)特殊性質(zhì) 正正/負(fù)模式負(fù)模式 表面活性劑？污染？表面

41、活性劑？污染？ 影影 響響 定定 性性 結(jié)結(jié) 果果 94 儀儀 器器 參參 數(shù)數(shù) 的的 設(shè)設(shè) 置置 霧化針電壓霧化針電壓 霧化氣流量霧化氣流量 流動相比例、流速流動相比例、流速 色譜柱色譜柱 干燥氣溫度干燥氣溫度 干燥氣流量干燥氣流量 毛細(xì)管電壓毛細(xì)管電壓 碰撞活化能量碰撞活化能量 檢測器電壓檢測器電壓 掃描時間掃描時間 質(zhì)譜峰寬質(zhì)譜峰寬 離子源腔室溫度離子源腔室溫度 總總 結(jié)結(jié) 95 磺磺 胺胺 吡吡 啶啶 ESI Scan（+）200-300m/zScan（-）200-300m/z 確定離子源、正負(fù)模式確定離子源、正負(fù)模式 S/N = 10 96 SIM（+）（）（m/z=250.0） SIM（-）（）（m/z=247.5） S/N = 1100 97 優(yōu)化離子源參數(shù)，使優(yōu)化離子源參數(shù)，使Q1信號最大化信號最大化 干燥氣溫度干燥氣溫度 250 300 35