細(xì)胞生物學(xué)：第四章 細(xì)胞質(zhì)、核糖體與RNA

1、第第四四章章 細(xì)胞質(zhì)、核糖體與細(xì)胞質(zhì)、核糖體與RNARNA 第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì) 第二節(jié)第二節(jié) 核糖體核糖體 第三節(jié)第三節(jié) 非編碼非編碼RNARNA 第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)又稱胞漿,是細(xì)胞質(zhì)膜包圍的 除核區(qū)外的一切半透明、膠狀、顆粒狀物質(zhì)的總稱， 由細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)胞骨架和包涵物組成。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中主要含有與細(xì)胞內(nèi)各種中間代謝反 應(yīng)相關(guān)的數(shù)以千計(jì)的酶類和與維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi) 物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)的細(xì)胞質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞質(zhì)骨架是細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)結(jié)構(gòu)體系的組織者，為 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的各種成分和細(xì)胞器提供錨定位點(diǎn)，保 證細(xì)胞內(nèi)各種復(fù)雜代謝反應(yīng)高效而有序的進(jìn)行。 p 細(xì)

2、胞質(zhì)的組成 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和胞質(zhì)溶膠 化學(xué)組成：小分子：水、無(wú)機(jī)離子；中等分子： 脂類、糖類、氨基酸、核苷酸及其衍生物；大分 子：多糖、蛋白質(zhì)、脂蛋白、RNA “酶溶液”vs 區(qū)域性分布 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與蛋白質(zhì)的壽命控制 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì) 微管、微絲和中間絲組成的高度動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)體系 不同細(xì)胞間差異很大 細(xì)胞特定形狀的維持 細(xì)胞內(nèi)部布局 細(xì)胞運(yùn)動(dòng) 細(xì)胞質(zhì)骨架 母牛內(nèi)皮細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白纖維(微絲) 母牛內(nèi)皮細(xì)胞的微管 沒(méi)有代謝活性，有特定形態(tài)的結(jié)構(gòu) 貯存能源物質(zhì)、分泌顆粒 糖原顆粒 脂滴 分泌顆粒 包涵物 胰腺外分泌腺細(xì)胞內(nèi) 大量胰酶原分泌顆粒 肝細(xì)胞內(nèi)大量糖原顆粒 分泌類固醇激素 的細(xì)胞內(nèi)脂滴 葉綠體和線粒體中含

3、有的DNA 胞質(zhì)遺傳因子與核基因的獨(dú)立性 多種表現(xiàn)形式，以母系遺傳為主 p 細(xì)胞質(zhì)遺傳 基質(zhì)基質(zhì)基質(zhì)類囊體基質(zhì)類囊體基粒類囊體基粒類囊體 電鏡下的葉綠體超微結(jié)構(gòu) 電鏡下的線粒體超微結(jié)構(gòu) 核糖體是細(xì)胞質(zhì)中最重要的細(xì)胞器之一。 在細(xì)胞將DNA的基因信息翻譯為蛋白質(zhì)的過(guò)程 中，核糖體在mRNA的指導(dǎo)下合成相應(yīng)的蛋白 質(zhì)。在翻譯過(guò)程中，核糖體需要解讀mRNA的 密碼子，招集相應(yīng)的氨酰tRNA，并催化肽鏈 的生成。 第二節(jié)第二節(jié) 核糖體核糖體 p核糖體的基本類型 u 按存在的生物類型 真核生物核糖體 原核生物核糖體 沉降系數(shù) (sedimentation coefficient, s) u 按存在部位

4、細(xì)胞質(zhì)核糖體 線粒體核糖體 （55S，由35S 和25S大、小 亞基組成） p 核糖體的基本類型 基本特點(diǎn)原核生物核糖體真核生物核糖體 沉降系數(shù)70S80S 相對(duì)分子量(kDa）2.5103 3.94.5103 亞基組成50S30S60S40S 豐度(每個(gè)細(xì)胞)15102-18103個(gè)106-107 個(gè) 其他 游離核糖體（free ribosome） 和附著核糖體（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)） p 原核/真核細(xì)胞核糖體的特點(diǎn)比較 p 核糖體的成分 核糖體無(wú)膜結(jié)構(gòu)，主要由核糖體蛋白(ribosomal protein, r蛋白質(zhì))和核糖體RNA(ribosomal RNA, rRNA)構(gòu)成。 成分組成原核生物真核生

5、物 基本組成比列rRNA約占2/3 r蛋白質(zhì)約為1/3 rRNA約占3 /5 r蛋白質(zhì)約為2/5 大亞基組分31種蛋白質(zhì) 2種rRNA （23S和5S) 49種蛋白質(zhì) 3種rRNA （28S、5.8S、5S） 小亞基組分21種蛋白質(zhì) 1種rRNA（16S） 33種蛋白質(zhì) 1種rRNA（18S） p 核糖體的成分 rRNA占細(xì)胞總RNA的絕大部分 去除rRNA的核糖體不能維持正常形態(tài) rRNA含有不同比例的A、U、G、CrRNA為單 鏈RNA，但有雙鏈區(qū) p 核糖體的結(jié)構(gòu) 核糖體大小亞基的結(jié)構(gòu)示意圖 大小亞基的結(jié)構(gòu) 大亞基(11.52323nm)： 略對(duì)稱的皇冠狀，中間為 “鼻”，兩側(cè)為“脊”和

6、“柄” 小亞基(5.52222nm): 長(zhǎng)條形的扁平不對(duì)稱顆粒， 由頭和體兩部分組成。 大小亞基結(jié)合在一起形成核糖體， 凹陷部位彼此對(duì)應(yīng)形成一個(gè)隧道， 供蛋白質(zhì)翻譯時(shí)mRNA穿行 p 核糖體的結(jié)構(gòu) 16S rRNA的結(jié)構(gòu) 16S rRNA的一級(jí)和二 級(jí)結(jié)構(gòu)均十分保守，具 有臂環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop structure)。 16S rRNA的空間結(jié)構(gòu)在 電鏡下呈V字形 16S rRNA的二級(jí) 結(jié)構(gòu)（上） 空間結(jié)構(gòu)（右） p 核糖體的生物發(fā)生 rRNA的轉(zhuǎn)錄與加工 rRNA基因在基因組中具有多個(gè)拷貝，E.coli中有7套拷貝，真 核生物中有數(shù)百到數(shù)千個(gè)拷貝，其中5S rRNA有50000個(gè)拷貝

7、 真核生物的染色體中28S，18S和5.8S rRNA基因是串聯(lián)分布的， 基因間有間隔區(qū)分開(kāi); 5S rRNA基因?yàn)楠?dú)立存在 原核生物中5S rRNA基因與其他兩種rRNA基因位于同一染色體 上 在生命活躍的細(xì)胞中，rRNA的拷貝數(shù)或細(xì)胞核的數(shù)量增加，以 適應(yīng)蛋白質(zhì)大量合成的需要。 p 核糖體的生物發(fā)生 核糖體的自我裝配： 核糖體由各種RNA和蛋白零件組成完整的核糖 體不需要其它任何因子參與，屬于自我裝配 真核生物和原核生物的核糖體裝配方式不同 p 核糖體的生物發(fā)生 真核生物的核糖體裝配流程： p 核糖體的生物發(fā)生 鎂離子對(duì)核糖體存在形式的影響： 細(xì)胞質(zhì)中，核糖體的存在形式受到鎂離子濃度的影響

8、 Mg2+1mM，核糖體以大、小亞基分離的形式存在 1mMMg2+10mM，核糖體形成100S大小的二聚體 p 核糖體的生物發(fā)生 原核生物的核糖體裝配流程(E.coli) 小亞基的裝配： 1.大約2/3的蛋白質(zhì)在較低溫度條 件下先與16SrRNA結(jié)合，形成一個(gè) 21S的中間顆粒 2.當(dāng)溫度上升到37后，核糖體 中間物發(fā)生構(gòu)象改變，不增加蛋 白質(zhì)但沉降系數(shù)改變?yōu)?6S 3.由于構(gòu)象變化，產(chǎn)生一些新結(jié) 合位點(diǎn)。其余的蛋白質(zhì)(占1/3)再 次在較低溫度條件下與26S顆粒結(jié) 合，形成完整的有功能的30S顆粒 p 核糖體的生物發(fā)生 原核生物的核糖體裝配流程(E.coli) 大亞基的裝配： 大亞基的裝配過(guò)

9、程需要孵育條件(44、4mmol/L Mg2+) 和四步裝配過(guò)程： 1.由兩種rRNA (23S、5S)和大約20種蛋白質(zhì)組成33S顆粒 2.當(dāng)溫度上升到44時(shí)，沉降系數(shù)從33S增至41S 3.41S與另一些蛋白質(zhì)結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)?8S 4.溫度上升到50，48S轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?0S大亞基 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 作為蛋白質(zhì)的裝配機(jī)，核糖體的許多結(jié)構(gòu) 都對(duì)蛋白質(zhì)的合成過(guò)程有著重要意義 核糖體的功能活性位點(diǎn) p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 A位點(diǎn)（A site）：氨基酸位點(diǎn)。主要分布在大亞基上，是 與新?lián)饺氲陌滨；?tRNA結(jié)合的部位，可接受氨酰基-tRNA p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)

10、的生物合成 P位點(diǎn)（P site）：肽酰基位點(diǎn)。主要分布在大亞基上，是 與延伸中的肽酰tRNA結(jié)合的部位，即釋放tRNA的部位。 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 E位點(diǎn)(exit site)：是脫氨酰tRNA離開(kāi)A位點(diǎn)到完全從核糖體釋放 出來(lái)的一個(gè)中間?？奎c(diǎn)，只是暫時(shí)的停留點(diǎn)。E位點(diǎn)被占據(jù)時(shí)，A 位點(diǎn)與氨酰基tRNA的親和力降低，可防止與另一個(gè)氨酰tRNA的結(jié) 合。直到核糖體準(zhǔn)備就緒，E位點(diǎn)空出，才會(huì)接受下一個(gè)氨酰tRNA。 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 mRNA結(jié)合位點(diǎn)：原核生物的核糖體中，與mRNA結(jié)合位點(diǎn)位于16S rRNA 的3端。mRNA與核糖體結(jié)合的序列稱為SD序列，是m

11、RNA中5端富含嘌 呤的短核苷酸序列，一般位于mRNA的起始密碼AUG的上游5-10bp處，并 且同16S rRNA3端的序列互補(bǔ)。真核生物沒(méi)有SD序列，mRNA同核糖體 小亞基的結(jié)合主要依賴于mRNA5端甲基化帽子結(jié)構(gòu)的識(shí)別。 核糖體的蛋白合成功能主要是依靠rRNA來(lái)完成的，突變的rRNA能夠?qū)?蛋白合成抑制劑產(chǎn)生抗性。 n 具有肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性 n 為tRNA提供結(jié)合位點(diǎn) n 為多種蛋白質(zhì)合成因子提供結(jié)合位點(diǎn) n 在蛋白質(zhì)合成起始時(shí)參與同mRNA選擇性地結(jié)合以及在肽鏈的延伸 中與mRNA結(jié)合 n 核糖體大小亞單位的結(jié)合、校正閱讀(proof reading)、無(wú)意義鏈 或框架漂移的校正、以

12、及與抗菌素作用 r蛋白質(zhì)的作用很可能是對(duì)核糖體功能的“微調(diào)”及對(duì)核糖體的合成、 穩(wěn)定起到輔助作用，r蛋白質(zhì)的缺失并不能完全阻止蛋白質(zhì)的合成。 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 核糖體中rRNA及r蛋白質(zhì)的作用 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 蛋白質(zhì)的生物合成 蛋白質(zhì)合成不僅要有合成的場(chǎng)所,而且還必須有mRNA、tRNA、 20種氨基酸按照密碼精確地?fù)饺攵嚯逆溨校鞍踪|(zhì)因子、酶、Mg、 K離子等參與由ATP、GTP提供能量等。每一個(gè)核糖體一秒鐘可翻 譯40個(gè)密碼子而形成40個(gè)氨基酸肽鍵，其合成肽鏈效率極高。 蛋白質(zhì)合成分為3大步驟： 氨基酸的活化及其與專一轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)的連接 肽

13、鏈的合成（包括起始、延伸和終止） 新生肽鏈加工成為成熟的蛋白質(zhì) p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 此步驟在胞質(zhì)中進(jìn)行 氨基酸本身不識(shí)別密碼，不直接反應(yīng)生成肽鏈，不直接到達(dá) 核糖體上，需借助轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA） 特異性的氨酞tRNA合成酶催化氨基酸的羧基與其對(duì)應(yīng)的tRNA 的3端羥基反應(yīng)，生成含高能酯鍵的氨酰tRNA 氨基酸+ATPtRNA 氨酰tRNAAMPPPi 反應(yīng)都是在氨酰tRNA合成酶催化下進(jìn)行的，具有高度專一性。 每一種氨基酸均有專一的氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA） 氨基酸的活化及其與專一tRNA的連接 肽鏈的合成 分3個(gè)步驟：起始、延伸、終止 蛋白質(zhì)合成方向從

14、氨基端（N端）向羧基端（C端）進(jìn)行 mRNA的翻譯方向是從5端到3端 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 肽鏈的合成-起始 1. 小亞基與mRNA起始密碼子的結(jié)合 2. 第一個(gè)氨酰-tRNA進(jìn)入核糖體 3. 完整起始復(fù)合物的裝配（assembling） 肽鏈的合成-起始 原核生物的蛋白質(zhì)合成的起始(引自Gerald Karp,Cell and Molecular Biology,2004) p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 肽鏈的合成-延伸 1. 氨酰-tRNA進(jìn)入A位點(diǎn) 2. 肽鍵（peptide bond）的形成 3

15、. 轉(zhuǎn)位（translocation） 4. 去氨酰tRNA的釋放 肽鏈的合成-延伸 原核生物的蛋白質(zhì)合成的延伸(引自Gerald Karp,Cell and Molecular Biology,2004) p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 64個(gè)密碼子中有3個(gè)終止密碼子，不編碼氨基酸而終止多肽的裝 配。當(dāng)核糖體到達(dá)UAA、UAG和UGA任何一個(gè)密碼子，由于沒(méi)有與之相 匹配的反密碼子，終止蛋白質(zhì)的延伸，導(dǎo)致多肽鏈從tRNA中脫離出來(lái) p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 肽鏈的合成-終止 肽鏈的加工 除去N端的甲酰甲硫氨酸（原核）或甲硫氨酸（真核） 切除沒(méi)有功能卻存在于前體中的肽段 氧化二個(gè)半

16、胱氨酸的巰基生成二硫鍵 氨基酸殘基的修飾，如：磷?；⑻腔?、甲基化、乙 ?；土u基化 結(jié)構(gòu)蛋白需經(jīng)過(guò)修飾、剪接后形成四級(jí)結(jié)構(gòu)而發(fā)揮功能 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 嘌呤霉素對(duì)蛋白質(zhì)合成抑制 p 核糖體的作用與蛋白質(zhì)的生物合成 p 多聚核糖體 核糖體在細(xì)胞內(nèi)并不是單個(gè)獨(dú)立地執(zhí)行功能，而是由多個(gè)甚至 幾十個(gè)核糖體串連在一條mRNA分子上高效地進(jìn)行肽鏈的合成， 這種具有特殊功能與形態(tài)結(jié)構(gòu)的核糖體與mRNA的聚合體稱為多 聚核糖體（polyribosomes或polysome）。 多聚核糖體的生物學(xué)意義 n 細(xì)胞內(nèi)各種多肽的合成，不論其分子量的大小或是mRNA的 長(zhǎng)短如何，單位時(shí)間內(nèi)所合成的

17、多肽分子數(shù)目都大體相等。 n 以多聚核糖體的形式進(jìn)行多肽合成，對(duì)mRNA的利用及對(duì)其 濃度的調(diào)控更為經(jīng)濟(jì)和有效。 p 多聚核糖體 電鏡下的多聚核糖體 p 多聚核糖體 第三節(jié) 非編碼RNA 一、核酶 二、小RNA 三、lncRNA Proportion of functional elements within genomes 17% 0.5% Drosophila 85% 2% 13% E. coli 70% 2% 28% Yeast S. cerevisiae 1.5% 0.5% 98% Human 28% 0.5% 71% Nematode C. elegans 0.5% 0.01% Lu

18、nfish (dipnoi) Coding (protein) RNA Non-coding 82% 99.5% 基因組和轉(zhuǎn)錄 Genome and transcription (tiling array data) 編碼蛋白序列 Protein coding sequence 人 (Human) 基因組的 2-3 % 線蟲(chóng)(c.elegans) 基因組的 25 % 基因組的轉(zhuǎn)錄水平 Transcriptional activity 人基因組的 90 % (40-50X) 線蟲(chóng) 基因組的 70 % (2-3X) 絕大部分的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是 非編碼RNA 物種間最主要的差別也是 非編碼RNA 基因組的

19、轉(zhuǎn)錄情況 Transcriptional output/complexity 名稱名稱定義定義功能功能大小大小( (ntnt) ) mRNAsMessenger RNA編碼蛋白質(zhì)的信使RNA變化大 rRNAsRibosomal RNA核糖體RNA，催化蛋白質(zhì)合成 人：120,160, 1868,5024 tRNAsTransfer RNA 運(yùn)輸RNA,蛋白質(zhì)合成中作為mRNA和氨 基酸之間的橋梁 70-90 snRNAsSmall nuclear RNA 小的細(xì)胞核RNA，在細(xì)胞核加工中起 作用，如pre-mRNA的加工 100-300 snoRNAs Small nucleolar RNA

20、小核仁RNA，對(duì)rRNA進(jìn)行加工和修飾60-300 scaRNAs Small Cajal body- associated RNA 在cajal小體中發(fā)現(xiàn)，用于修飾snRNA 200-300 miRNAsMicroRNAs小RNA，用于降解mRNA和阻斷翻譯 21-22 siRNAsSmall interfere RNAs 小干擾RNA，直接降解mRNA和建立壓 縮的染色質(zhì)結(jié)構(gòu) 20-25 piRNAsPiwi-interacting RNA 生殖細(xì)胞中的小RNA，維持轉(zhuǎn)座子沉默, 抵抗轉(zhuǎn)座子，在配子發(fā)生中起作用 23-30 lncRNAsLong noncoding RNA 長(zhǎng)鏈非編碼RN

21、A,用多種功能，如調(diào)控 基因的轉(zhuǎn)錄等 200以上 細(xì)胞中主要的RNA種類 具有催化功能的RNA稱為酶性RNA，又稱核酶(ribozyme， Rz)；具有催化功能的DNA稱為酶性DNA，又稱脫氧核酶 (deoxyribozyme，DRz)，兩者統(tǒng)稱核酶(nucleozyme)。 與蛋白質(zhì)酶相比，核酶的催化效率較低，是一種較為原 始的催化酶。 核酶的發(fā)現(xiàn)突破了酶是蛋白質(zhì)的經(jīng)典觀念，是人類對(duì)酶 化學(xué)本質(zhì)認(rèn)識(shí)的飛躍，補(bǔ)充和發(fā)展了“中心法則”。 一、一、 核核 酶酶 發(fā)現(xiàn) n1980s nThomas Cech等發(fā)現(xiàn) n研究四膜蟲(chóng)的26SrRNA前體加工 n發(fā)現(xiàn):26S rRNA前體可進(jìn)行自剪切(sel

22、f- splicing) 證明 n26SrRNA基因克隆 n無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄 n研究26SrRNA的前體分子剪切 p 核酶的發(fā)現(xiàn) p 核酶的類型 Rz廣泛存在于由低等到高等的多種生物中，參與細(xì) 胞內(nèi)RNA及其前體的加工和成熟過(guò)程。目前自然界發(fā) 現(xiàn)的核酶按分子大小分類，可分為大分子核酶和小 分子核酶兩類。 DRz是利用體外分子生化技術(shù)獲得的一種具有高效催 化活性和結(jié)構(gòu)識(shí)別能力的單鏈DNA片段。迄今已發(fā)現(xiàn) 的DRz有幾十種，但有類似催化活性的DRz在自然界 中還沒(méi)找到。 p 核酶的類型 大分子Rz的類型： 核糖核酸酶P(RnaseP）催化切割tRNA、rRNA I類內(nèi)含子 II類內(nèi)含子 小分子Rz

23、的類型： 錘頭型 發(fā)夾型 HDV（丁型肝炎病毒）核酶 VS核酶 p 核酶的類型 具有RNA切割活性 具有DNA連接酶活性 具有卟啉金屬化酶和過(guò)氧化酶活性 具有DNA水解活性 具有DNA激酶活性 具有N2糖基化酶活性 具有DNA戴帽活性 DRz的類型 p 核酶的類型 Rz與DRz的比較： 特性DRzRz 化學(xué)組分 DNARNA 催化特性 高度專一性和高效性，與底物嚴(yán)格按照堿基 配對(duì)原則結(jié)合。DRz-mRNA雜交分子較Rz- mRNA雜交分子易解離；催化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Rz 高度專一性和高效性， 與底物嚴(yán)格按照堿基 配對(duì)原則結(jié)合 成構(gòu)及活 性中心特 點(diǎn) 缺少2-羥基，分子量較小，受靶序列二級(jí)結(jié) 構(gòu)的影

24、響較弱，活性中心結(jié)構(gòu)有更大的選擇 性，對(duì)底物的趨近性比Rz好，一般DRz較Rz 有更多的剪切靶位可供選擇 每個(gè)核苷酸都具有一 個(gè)2-羥基，結(jié)構(gòu)相對(duì) 復(fù)雜 p 核酶的類型 Rz與DRz的比較： 特性DRzRz 底物DNA或RNARNA 穩(wěn)定性 在生理pH、溫度和離子強(qiáng)度等條 件下，穩(wěn)定性約為RNA的105 倍； 在細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)環(huán)境中，對(duì)核 酸的降解作用比Rz高得多 與DRz相比穩(wěn)定性差 p 核酶的作用機(jī)制 各種核酶的RNA分子中內(nèi)含子（Intron）切除機(jī)制的 不同，可分為剪切型和剪接型兩大類型 剪接型：相當(dāng)于內(nèi)切酶和連接酶兩種酶的聯(lián)合作用， 催化自身RNA進(jìn)行剪切和連接 剪切型：相當(dāng)于內(nèi)切核

25、酸酶的作用，可催化RNA分子 切除一段核苷酸序列 核酶的剪切作用和剪接作用都不需要其它酶（蛋白質(zhì)） 參與，稱為自我剪切(self-cleavage)和自我剪接 （Self-Splicing）作用。 p 核酶的作用機(jī)制 剪接型核酶的作用機(jī)制第一類自我剪接 包括I型內(nèi)含子和II型內(nèi)含子 需要外源性親和物質(zhì)：外源鳥(niǎo)苷或其它親和物質(zhì) 催化反應(yīng)需Mg2+參與 剪接型核酶的作用機(jī)制第二類自我剪接 不需要外源性親和物質(zhì)，利用自身內(nèi)部的腺苷作為親 和物質(zhì) 催化反應(yīng)需Mg2+參與 剪下的內(nèi)含子生成一個(gè)套索(lariut)形式的中間產(chǎn)物 p 核酶的作用機(jī)制 剪切型核酶的作用機(jī)制 剪切型核酶是將自身RNA或異體RN

26、A切除一段特異的 核苷酸序列 剪切型核酶的作用特點(diǎn)是只剪不接 剪切型核酶都是通過(guò)同樣可逆的磷酸二酯斷裂反應(yīng) 來(lái)破壞RNA鏈 目前，關(guān)于磷酸二酯的斷裂機(jī)制尚有爭(zhēng)議。 p 核酶的作用機(jī)制 p 核酶的作用機(jī)制 錘頭型核酶 錘頭型核酶(hammerhead ribozyme) 是植物病毒中的一種核酶 催化時(shí)形成一種特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，類似錘頭 有一個(gè)雙鏈螺旋的柄結(jié)構(gòu)(柄II) 核酶同靶RNA配對(duì)形成柄和柄 切點(diǎn)在靶RNA的柄、柄配對(duì)區(qū)之間 p 核酶的作用機(jī)制 p 核酶在演化中的地位 因發(fā)現(xiàn)RNA具有催化和自 復(fù)制(不同于病毒RNA的自復(fù) 制)功能而提出的一種假說(shuō)， 認(rèn)為生物進(jìn)化過(guò)程中，最早 出現(xiàn)的生物大分

27、子是RNA，而 不是DNA和蛋白質(zhì)，即在進(jìn)化 某個(gè)階段有一個(gè)“RNA世界”。 RNA世界假說(shuō) p 核酶的應(yīng)用研究進(jìn)展 用于生命起源的研究 用于植物病毒防治的研究 用于人類疾病防治的研究 二、小二、小 RNARNA 小RNA（microRNA 或 small RNA）是一種 長(zhǎng)度介于20-24個(gè)核苷酸的單鏈RNA，作為一種負(fù) 調(diào)控因子，miRNA作用于它們的靶標(biāo)mRNA，能夠 在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上對(duì)基因的表達(dá)起到調(diào)控作用。 不同物種中大量的小RNA被報(bào)道 p 小RNA的分類 siRNA 由DICER(植物中為DCL4)識(shí)別并且切割的任何來(lái)源 （內(nèi)源或者外源）的雙鏈RNA分子而形成 miRNA 由I

28、I型聚合酶轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過(guò)DICER(植物中為DCL1)切 割,成為成熟的功能小分子RNA p 小RNA的發(fā)生 siRNA 源于外源病毒入侵或內(nèi) 源RNA產(chǎn)生的小分子雙 鏈RNA 長(zhǎng)度一般為21nt-25nt siRNA能夠在細(xì)胞之間 短暫轉(zhuǎn)移 植物病毒入侵誘導(dǎo)初生siRNA p 小RNA的發(fā)生 miRNA 從自身基因組中轉(zhuǎn)錄并加 工而成 pri-miRNA - pre-miRNA - miRNA 一個(gè)miRNA可調(diào)節(jié)具有共同 功能域的幾個(gè)不同基因 p 小RNA的作用機(jī)制 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體 （RISC） RISC一種由多個(gè)蛋白質(zhì)分 子與siRNA組合而成的復(fù) 合物，可切斷雙鏈RNA， 或是與短小

29、的反義RNA結(jié) 合。當(dāng)RISC與互補(bǔ)鏈結(jié)合 之后，會(huì)活化RNase，并 將RNA切斷。 miRNA與siRNA參與調(diào)控基因沉默過(guò)程的異同 p 小RNA的作用機(jī)制 p 小RNA的作用機(jī)制 除通過(guò)RISC對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控外，siRNA還可以通過(guò)DNA 甲基化、組蛋白甲基化等方式對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起到調(diào)控作用 RdDM: RNA dependent DNA methylation，only observed in plants p 小RNA的生物學(xué)意義 參與發(fā)育 參與病毒防御 參與環(huán)境脅迫響應(yīng) miRNAmiRNASiRNASiRNApiRNApiRNA 來(lái)源來(lái)源內(nèi)源產(chǎn)生內(nèi)源產(chǎn)生內(nèi)源或外源合成導(dǎo)入內(nèi)源

30、或外源合成導(dǎo)入內(nèi)源產(chǎn)生內(nèi)源產(chǎn)生 轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄酶RNARNA聚合酶聚合酶IIIIRNARNA聚合酶聚合酶IIIIRNARNA聚合酶聚合酶IIII 形成形成單鏈單鏈RNARNA形成形成雙鏈雙鏈RNARNA單鏈單鏈RNARNA形成形成 加工加工加工過(guò)程：剪切一個(gè)側(cè)臂，加工過(guò)程：剪切一個(gè)側(cè)臂， 其他部分降解，加工成熟依賴其他部分降解，加工成熟依賴 DicerDicer 對(duì)稱地來(lái)源于雙鏈對(duì)稱地來(lái)源于雙鏈RNA RNA 前前 體的兩側(cè)臂，加工成熟依賴體的兩側(cè)臂，加工成熟依賴 DicerDicer 大的大的RNARNA前體，被加工成大量前體，被加工成大量 的的piRNApiRNA 作用的作用的mRNAmRNA

31、部位部位作用于靶標(biāo)基因作用于靶標(biāo)基因3 3-UTR-UTR 區(qū)區(qū) 作用于作用于mRNAmRNA任何部位任何部位作用于轉(zhuǎn)座子作用于轉(zhuǎn)座子RNARNA任何部位任何部位 位點(diǎn)數(shù)位點(diǎn)數(shù)一個(gè)基因上可有多個(gè)作用一個(gè)基因上可有多個(gè)作用 位點(diǎn)位點(diǎn) 一個(gè)作用位點(diǎn)一個(gè)作用位點(diǎn)一個(gè)基因上可有多個(gè)作用位點(diǎn)一個(gè)基因上可有多個(gè)作用位點(diǎn) 結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白需要需要ArgonauteArgonaute家族蛋白家族蛋白 形成形成RICSRICS復(fù)合物復(fù)合物 與與Arg2Arg2等蛋白形成等蛋白形成RICSRICS復(fù)復(fù) 合物合物 與與PiwiPiwi、ago3ago3、AubergineAubergine等等 蛋白形成復(fù)合物蛋白形

32、成復(fù)合物 效果效果抑制翻譯或者導(dǎo)致抑制翻譯或者導(dǎo)致mRNAmRNA降降 解解 靶標(biāo)靶標(biāo)mRNAmRNA降解降解轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄水平（水平（PiwiPiwi）和轉(zhuǎn)錄后切）和轉(zhuǎn)錄后切 割割(ago3(ago3、AubAub) )抑制轉(zhuǎn)座子活性抑制轉(zhuǎn)座子活性 存在的細(xì)胞存在的細(xì)胞廣泛存在廣泛存在廣泛存在廣泛存在僅在部分動(dòng)物生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)僅在部分動(dòng)物生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) 功能功能主要參與發(fā)育過(guò)程，調(diào)節(jié)主要參與發(fā)育過(guò)程，調(diào)節(jié) 表達(dá)表達(dá) RNAiRNAi產(chǎn)物，抑制轉(zhuǎn)座子活產(chǎn)物，抑制轉(zhuǎn)座子活 性和病毒感染性和病毒感染 只作用于轉(zhuǎn)座子只作用于轉(zhuǎn)座子mRNAmRNA miRNA、 siRNA和piRNA的異同 p 小RNA的

33、應(yīng)用 RNAi RNA干擾（RNA interference，縮寫(xiě)為RNAi）是指一種分子 生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過(guò)阻 礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與 內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo) 致基因表達(dá)沉默，siRNA和miRNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象均可稱 為RNAi。 RNAi現(xiàn)象可以廣泛地應(yīng)用于研究或治療領(lǐng)域 p 小RNA的應(yīng)用 用于疾病治療 RNAi主要通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達(dá)，導(dǎo)致蛋白無(wú)法 合成，出現(xiàn)“基因沉默”。理論上說(shuō)，我們可以關(guān)閉非必需 或致病基因的功能，以達(dá)到治療疾病的作用。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明，可以通過(guò)

34、RNAi的方法使導(dǎo)致血膽固醇升高 的基因“沉默”；病毒性疾?。℉IV，肝炎等），心血管代 謝性疾病等方面的臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中；這一方法為病毒 性肝炎、艾滋病和腫瘤等人類頑疾的治療指了一條新路 。 p 小RNA的應(yīng)用 用于科學(xué)研究 在科學(xué)研究中，很多時(shí)候需要用到基因敲除技術(shù)來(lái)對(duì)某一基 因的功能進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的在基因組水平上剔除基因費(fèi)時(shí)費(fèi) 力，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。利用RNAi技術(shù)，可以方便地通過(guò)siRNA或 siRNA表達(dá)載體對(duì)目標(biāo)基因基因進(jìn)行沉默，已成為研究基因 功能的重要手段。 p 小RNA的應(yīng)用 用于動(dòng)植物品種改良 通過(guò)RNAi的方法，利用基 因工程的手段對(duì)動(dòng)植物的 遺傳特性進(jìn)行改變，以獲 得新的

35、品種 p 小RNA的應(yīng)用 用于病毒防御 Hu WY等證明了siRNA能阻抑逆轉(zhuǎn)錄Rous 肉瘤病毒（RSV） 感染脊椎動(dòng)物； Leonid等發(fā)現(xiàn)針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒中編碼衣殼蛋白或編 碼病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒復(fù)制，加速清除 受染細(xì)胞中的脊髓灰質(zhì)炎病毒； Jia等發(fā)現(xiàn)Rta-siRNA( Rta是皰疹病毒基因表達(dá)的一種起 始轉(zhuǎn)錄因子)和ORF45-siRNA能特異阻止皰疹病毒復(fù)制。 三、長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 長(zhǎng)鏈非編碼RNA(1ong non coding RNA, lncRNA)： 不編碼蛋白且轉(zhuǎn)錄本超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子， lncRNAs和mRNA類似，主要由RNA

36、聚合酶II (RNA PII) 轉(zhuǎn) 錄，有可變剪接，有些具有poly(A)尾巴，有些沒(méi)有 poly(A)尾巴。 Figure 1. Paradigms for how long ncRNAs function. Recent studies have identified a variety of regulatory paradigms for how long ncRNAs function, many of which are highlighted here. Transcription from an upstream noncoding promoter (orange) can

37、negatively (1) or positively (2) affect expression of the downstream gene (blue) by inhibiting RNA polymerase II recruitment or inducing chromatin remodeling, respectively. (3) An antisense transcript (purple) is able to hybridize to the overlapping sense transcript (blue) and block recognition of t

38、he splice sites by the spliceosome, thus resulting in an alternatively spliced transcript. (4) Alternatively, hybridization of the sense and antisense transcripts can allow Dicer to generate endogenous siRNAs. By binding to specific protein partners, a noncoding transcript (green) can modulate the a

39、ctivity of the protein (5), serve as a structural component that allows a larger RNAproteincomplex to form (6), or alter where the protein localizes in the cell (7). (8) Long ncRNAs (pink) can be processed to yield small RNAs, such as miRNAs, piRNAs, and other less well-characterized classes of smal

40、l transcripts. Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world Genes Dev. 2009 23: 1494-1504 Access the most recent version at doi:10.1101/gad.1800909 lncRNAslncRNAs轉(zhuǎn)錄干擾的調(diào)控機(jī)制轉(zhuǎn)錄干擾的調(diào)控機(jī)制: : （1）抑制RNA聚合酶（RNAPII）的活性 （2）作為共調(diào)節(jié)子干擾轉(zhuǎn)錄因子的活性 （3）通過(guò)核小體的重置來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄干擾 （4）通過(guò)招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄干擾 （5）通過(guò)促進(jìn)啟動(dòng)子DNA甲基化來(lái)

41、進(jìn)行轉(zhuǎn)錄干擾 （6）在沉默啟動(dòng)子上維持染色質(zhì)阻抑結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄干擾 lncRNAslncRNAs轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)控機(jī)制轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)控機(jī)制: : （1）lncRNA創(chuàng)造了一個(gè)自由的染色質(zhì)環(huán)境，最近報(bào)道ncRNA可以 直接從轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子上轉(zhuǎn)錄(稱為增強(qiáng)子或eRNA)，可能介導(dǎo)復(fù)合物與 核心轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的相互作用，鎖定穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程。 （2）ncRNA 和位點(diǎn)激活，另一種lncRNA激活基因表達(dá)的方式是 阻止阻遏復(fù)合物的進(jìn)入，如人的HOXA基因簇的活化表達(dá)與lncRNA 及 PCG/染色質(zhì)相互作用失活有關(guān)。 lncRNAlncRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和其它作用的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和其它作用 （1）參與可變剪接,即ln

42、cRNA可以與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈 干擾mRNA的剪切，進(jìn)而產(chǎn)生不同的剪切形式； （2）lncRNA與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶作用下產(chǎn) 生內(nèi)源性的siRNA，負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)水平； （3）可作為小分子RNA（如miRNA）的前體分子，負(fù)調(diào)控基因表達(dá)； （4）lncRNA結(jié)合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性。 內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNARNA（ceRNAceRNA） ceRNA（competing endogenous RNAs）假說(shuō)揭示了一種RNA間相互作用 的新機(jī)制。ceRNA可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miRNA來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。ceRNA可 以通過(guò)應(yīng)答元件（mi

43、croRNA response elements，MREs)與miRNA結(jié)合從而 影響miRNA導(dǎo)致的基因沉默，這揭示了一條RNA-miRNA調(diào)節(jié)通路的存在 A Large Intergenic Noncoding RNA Induced by p53 Mediates Global Gene Repression in the p53 Response Cell 142, 409419, August 6, 2010 在這篇文章，作者發(fā)現(xiàn)P53可以直接提高lncRNA-P21的表達(dá)，然后 lincRNA-P21與蛋白hnRNP-K結(jié)合，再調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)（如圖） A ceRNA Hypot

44、hesis: The Rosetta Stone of a Hidden RNA Language? Cell, Volume 146, Issue 3, 353-358, 28 July 2011 競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA) Figure 1. The Basis of the ceRNA Language How mRNAs affect microRNAs is less well characterized than how microRNAs affect mRNAs. (A)The relationship between mRNAs and microRNAs could be reciprocal (Seitz, 2009), causing the level of one mRNA to influence the level and activity of another mRNA. (B) Thus, RNA molecules could communicate with each other through microRNA and microRNA response sequences (MREs). The greater the number