Redzol一步法總RNA提取試劑

1、Redzol （步法總 RNA提取試劑）使用說明用戶請自備以下試劑1. 氯仿2. 異丙醇3. 75聽醇（用DEP（處理的水）4. DEPC水或 0.5%SDS溶液操作方法1準備估算Redzol或組織細胞的用量。每1ml Redzol的組織用量為50100mg細 胞用量為510X 106個細胞。2. 組織或細胞的裂解a、貼壁細胞吸盡培養(yǎng)液，加入 Redzol，用槍反復(fù)吹打數(shù)次，確保全部裂解，然后轉(zhuǎn)移 至新的離心管中。裂解10cm細胞需要1ml Redzol。注：Redzo的加入量不是根據(jù)細胞數(shù)目來決定，而是根據(jù)細胞培養(yǎng)皿的面積（10cn?/m）來決定。b、懸浮細胞離心收集細胞，吸盡液體，加入 R

2、edzol用槍吹打數(shù)次，確保全部裂解（某 些酵母和細菌要用勻漿器勻漿才能全部裂解），然后轉(zhuǎn)移至新的離心管中。按1ml Redzol可裂解510X 106動物、植物、酵母細胞或 1X107細菌細胞的比例加入 Redzol裂解細胞。注：應(yīng)避免在Redzo加入前洗滌細胞，這樣會增加 mRNA降解的幾率。c、組織先將新鮮組織剪成小塊，放入勻漿器內(nèi)，加入 Redzol用勻漿器勻漿，然后 轉(zhuǎn)移至新的離心管中。或者將組織在液氮中研磨成粉末后，加入Redzol中。每50100mg的組織加入1ml Redzol進行裂解注：樣品總體積不要超過所用 Redzo體積的10%3. 分相a將勻漿液1530C靜置5分鐘使其

3、充分裂解。b每1ml Redzol中加入0.2ml的氯仿，震蕩混勻后1530C靜置23分鐘。c 2 8C 12,000g離心15分鐘。離心后混合物分成三相（下面的酚/氯仿相、中間的白色界面、上面的無色水相）。RNA全部在無色的水相中。注 ：對于含有高濃度蛋白、脂肪、多糖或纖維素（肌肉、脂肪組織、植物的微管組織）的樣品，在分相前可以附加一個分離步驟：勻漿后28C 12,000g離心10分鐘棄沉淀。RNA溶解在上清液中，纖維素、多糖、大分子量的DNA以不溶的形式沉淀從而與 RNA 分離。對于脂肪組織的樣品，上面一層脂肪組織可 以被清除掉，將清澈的勻漿液轉(zhuǎn)移到另一新管中，繼續(xù)進行第3步分相。4. 沉

4、淀 RNA轉(zhuǎn)移上層水相到另一新離心管中，按 0.5ml異丙醇/1ml Redzol比例加入異丙醇，充分混勻后1530C靜置10分鐘，然后28C 12,000g離心10分鐘，RNA 形成白色的小團沉淀在離心管的底部和側(cè)面。注：一定不要吸取中間界面；若同時提取 DNA和蛋白質(zhì)，于4C保留下層 酚相。5. 洗滌 RNA棄上清，RNA沉淀于管底。按1ml 75%S醇/1ml Redzol加入75%S醇，漂洗23次RNA沉淀，28C 7,500g離心5分鐘，盡量棄上清。6. 溶解 RNA在無菌工作臺中干燥 RNA沉淀510分鐘。可用DEPC處理的50卩l(xiāng) H 2O TEbuffer 或0.5% SDS溶

5、解RNA樣品，55-60 C溫育10分鐘使RNA完全溶解。注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。常見問題解答每 mg 組織或 106 培養(yǎng)細胞的RNA 產(chǎn)率肝和脾610 腎34血骨骼肌和腦11.5 胎盤14 4上皮細胞58馮纖維原細胞57血RNA 產(chǎn)率低樣品裂解或勻漿不完全；提取的 RNA溶解不完全A260 /A2801.65紫外檢測時RNA樣品應(yīng)用水稀釋，不能用 TE稀釋，低鹽離子溶液和低 pH 值溶液致使其在 280nm的吸收值增加（Wilfinger, W.et. AL, Biotechniques 22: 474-481; Fox, D.K.（1998） Focus 20: 2 p

6、.37 ）。樣品勻漿時加入試劑體積太少， 勻漿后溶液分層不明顯，水相被酚污染。最后提取的RNA羊品不能完全溶解。RNA 降解使用的動物組織沒有被立即凍上或放入 Redzol 中勻漿； 分離使用的樣品或 制備的RNA長期貯存在-5-20 C,而不是貯存在-60 C -70 C。提取RNA的細胞 被胰蛋白酶分解，易導(dǎo)致提取的RNA降解。水相或使用的離心管沒有完全處理仍 殘留有RNase變性凝膠電泳使用的甲醛 pH值低于3.5。RNA 污染樣品勻漿時加入試劑體積太少； 分離使用的樣品含有有機溶劑 （乙醇， DMSO 等），鹽離子或堿溶液。蛋白多糖和多糖污染改進RNA沉淀方法：起始勻漿中每加 1ml的Redzol，水相中加入0.25ml 的異丙醇和0.25ml的高鹽溶液（0.8M的檸檬酸鈉，1.2M的NaCI）,混勻，離