分析化學(xué)：第十八章 高效液相色譜法

1、第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 high performance high performance liquid chromatographyliquid chromatography；HPLCHPLC 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 u經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)， u引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)， u高壓輸送流動(dòng)相，高壓輸送流動(dòng)相， u高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器，高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器， u現(xiàn)代液相色譜分析方法。現(xiàn)代液相色譜分析方法。 第十八章第十八章 高效液

2、相色譜法高效液相色譜法 與經(jīng)典液相色譜法相比與經(jīng)典液相色譜法相比 u顆粒極細(xì)（一般為顆粒極細(xì)（一般為1010 m m以下）、規(guī)則均勻的以下）、規(guī)則均勻的 固定相，固定相，( (鍵合相鍵合相) )傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分 離效率高；離效率高； u高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度 快；快； u高靈敏度檢測(cè)器，靈敏度大大提高。紫外檢高靈敏度檢測(cè)器，靈敏度大大提高。紫外檢 測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)1010 9 9g g，而熒光檢測(cè)器最，而熒光檢測(cè)器最 小檢測(cè)限可達(dá)小檢測(cè)限可達(dá)1010 12 12g g。 。 第十八章第十八章

3、高效液相色譜法高效液相色譜法 與氣相色譜法相比與氣相色譜法相比 u不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制， 應(yīng)用范圍廣；應(yīng)用范圍廣； u可選用各種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)分離的可選用各種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)分離的 選擇性有很大作用，選擇性高；選擇性有很大作用，選擇性高； u一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高 柱溫。柱溫。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型高效液相色譜法的主要類型 和原理和原理 一、主要類型主要類型 四類基本類型色譜法四類基本類型色譜法 分配色譜法（分配色譜法（partit

4、ion chromatographypartition chromatography） 吸附色譜法（吸附色譜法（adsorption chromatographyadsorption chromatography） 離子交換色譜法（離子交換色譜法（IECIEC） 空間排阻色譜法（空間排阻色譜法（SECSEC） 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型和高效液相色譜法的主要類型和 原理原理 一、一、主要類型主要類型 四類基本類型色譜法四類基本類型色譜法 分配色譜法（分配色譜法（partition chromatographypartition chr

5、omatography） 吸附色譜法（吸附色譜法（adsorption chromatographyadsorption chromatography） 離子交換色譜法（離子交換色譜法（IECIEC） 空間排阻色譜法（空間排阻色譜法（SECSEC） 化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 其他色譜類型其他色譜類型 u親合色譜法親合色譜法（affinity chromatographyaffinity chromatography；ACAC） u手性色譜法手性色譜法（chiral chromatographychiral chromatography；C

6、CCC） u膠束色譜法膠束色譜法（micellar chromatographymicellar chromatography；MCMC） u電色譜法電色譜法（electrochromatographyelectrochromatography；ECEC） 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 u以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合 相色譜法相色譜法(bonded phase chromatography(bonded phase chromatography； BPC)BPC) u化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)

7、的方法將官能團(tuán) 鍵合在載體表面所形成的固定相鍵合在載體表面所形成的固定相 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： u固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過程固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過程 中不易流失，使用周期長(zhǎng)；中不易流失，使用周期長(zhǎng)； u柱效高；重現(xiàn)性好；柱效高；重現(xiàn)性好； u能使用的流動(dòng)相和鍵合相的種類多，分離能使用的流動(dòng)相和鍵合相的種類多，分離 的選擇性高的選擇性高 正相（正相（normal phasenormal phase，NPNP）和反相）和反相 （reversed phasereversed phase，RPRP）鍵合相色譜法）鍵合相色譜法： 根據(jù)化學(xué)鍵合

8、相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)弱根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)弱 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 （一）正相鍵合相色譜法（一）正相鍵合相色譜法 u固定相：固定相：極性鍵合相極性鍵合相 如氰基（如氰基（CNCN）、氨基（）、氨基（NHNH2 2）或二羥基）或二羥基 鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠）鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠） u流動(dòng)相：流動(dòng)相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑 如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑）如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑） u適用范圍：適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性 的分子型化合物的分子型化合物

9、 如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì)如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì) 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法 u分離機(jī)制？分離機(jī)制？ 分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相 的溶解的溶解 吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作 用用 u分離選擇性分離選擇性： 極性強(qiáng)的組分極性強(qiáng)的組分k k大，后洗脫出柱。大，后洗脫出柱。 流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分k k減小，減小， t tR R 減小。減小。 第十八章第十八章

10、 高效液相色譜法高效液相色譜法 （二）反相鍵合相色譜法（二）反相鍵合相色譜法 u固定相固定相：非極性鍵合相：非極性鍵合相 如十八烷基硅烷（如十八烷基硅烷（C C18 18，ODS ODS）、辛烷基（）、辛烷基（C C8 8）鍵）鍵 合硅膠合硅膠 u流動(dòng)相流動(dòng)相：水水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶 的極性調(diào)整劑的極性調(diào)整劑 常用甲醇水、乙腈水等常用甲醇水、乙腈水等 應(yīng)用：最廣應(yīng)用：最廣 非極性至中等極性的組分，非極性至中等極性的組分， （還有有機(jī)酸、堿及鹽等）（還有有機(jī)酸、堿及鹽等） 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 保留機(jī)制保留機(jī)制 疏溶劑疏溶劑 （

11、solvophobic theorysolvophobic theory） 溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì) 分子與極性溶劑分子間分子與極性溶劑分子間 的的排斥力排斥力，促使溶質(zhì)分促使溶質(zhì)分 子與鍵合相的烴基發(fā)生子與鍵合相的烴基發(fā)生 疏水締合疏水締合。 不是溶質(zhì)分子與鍵合相不是溶質(zhì)分子與鍵合相 間的色散力。間的色散力。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法 u保留行為的主要影響因素保留行為的主要影響因素 1 1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性） 極性越弱，疏水性越強(qiáng)，極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k k越大，越大，t tR R也越大也越

12、大。 同系物碳數(shù)越多，極性越弱，同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k k越大；越大； 引入極性取代基，降低疏水性，引入極性取代基，降低疏水性，k k值變小。值變小。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 2 2、固定相、固定相 鍵合烷基的疏水性隨鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長(zhǎng)碳鏈的延長(zhǎng)而增而增 加，溶質(zhì)的加，溶質(zhì)的k k也增大。也增大。 硅膠表面硅膠表面鍵合烷基的濃度越大鍵合烷基的濃度越大，則溶則溶 質(zhì)的質(zhì)的k k越大越大。 反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法 u保留行為的主要影響因素保留行為的主要影響因素 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法 u保留

13、行為的主要影響因素保留行為的主要影響因素 3 3、流動(dòng)相、流動(dòng)相 極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k k越大越大 溶劑種類溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑 溶劑比例溶劑比例：水的比例增加，使：水的比例增加，使k k增大增大 中性鹽的加入中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的：使中性溶質(zhì)的k k增大增大 pHpH：影響弱酸、弱減的離解：影響弱酸、弱減的離解 流動(dòng)相的流動(dòng)相的pHpH降低，弱酸降低，弱酸k k增大，增大，t tR R增大；增大； 弱堿弱堿k k變小。變小。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 u離子抑制色譜法（離子抑制色譜法（

14、ion suppression ion suppression chromatographychromatography；ISC ISC ） u用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動(dòng)相用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動(dòng)相 的的pHpH，抑制有機(jī)弱酸、弱堿的離解，增加疏，抑制有機(jī)弱酸、弱堿的離解，增加疏 水締合作用，使水締合作用，使k k變大。變大。 u適用于適用于3p3pK Ka7a7的弱酸、的弱酸、7p7pK Ka8a8的弱堿的弱堿 反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 把離子對(duì)試劑加入到含水流動(dòng)相中，組把離子對(duì)試劑加入到含水流動(dòng)相中，組 分離子在

15、流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離分離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離 子（子（counter ioncounter ion）生成）生成中性離子對(duì)中性離子對(duì)， 增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k k 增加，改善分離效果。增加，改善分離效果。 （三）反相離子對(duì)色譜法（三）反相離子對(duì)色譜法 paired ionpaired ionchromatographychromatography；PICPIC ion pair chromatography ion pair chromatography；IPCIPC 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 反相離子對(duì)色譜法反相

16、離子對(duì)色譜法 離子對(duì)模型離子對(duì)模型 33 + + () + 3s3 ( + 固定相固定相 + () + B) + B + H+BH RSO NaRSO + Na+ BH RSORSO ) BH 離子對(duì) m B + A B A m A ( s m BAm mm s m s B AA AB AB B AB EK 流動(dòng)相流動(dòng)相 通式通式 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 影響容量因子的因素影響容量因子的因素 離子對(duì)試劑的種類和濃度離子對(duì)試劑的種類和濃度：碳鏈長(zhǎng)度增加，：碳鏈長(zhǎng)度增加， 溶質(zhì)的溶質(zhì)的k k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高， 溶質(zhì)的溶質(zhì)的k

17、 k增大增大 流動(dòng)相的流動(dòng)相的pHpH：有利于組分和離子對(duì)試劑離子：有利于組分和離子對(duì)試劑離子 化時(shí)（離子對(duì)的形成），組分的化時(shí)（離子對(duì)的形成），組分的k k值最大值最大 固定相固定相 、流動(dòng)相性質(zhì)、流動(dòng)相性質(zhì)（同一般（同一般RP-HPLCRP-HPLC）。）。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 適用范圍和離子對(duì)試劑的選擇適用范圍和離子對(duì)試劑的選擇 u適用范圍 適用范圍：有機(jī)酸、堿、鹽，離子型和非離子型化：有機(jī)酸、堿、鹽，離子型和非離子型化 合物的混合物。合物的混合物。 u分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì) 分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨：用季銨鹽，如四丁基銨 磷酸鹽（磷酸鹽（

18、TBATBA）和溴化十六烷基三甲基銨（）和溴化十六烷基三甲基銨（CTABCTAB） 等。等。 u分析堿類或帶正電荷的物質(zhì) 分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸：用烷基磺酸鹽或硫酸 鹽，如正戊烷基磺酸鈉（鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICBPICB5 5）、正己烷基磺酸）、正己烷基磺酸 鈉（鈉（PICBPICB6 6）。）。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 u固定相應(yīng)符合下列要求固定相應(yīng)符合下列要求： 顆粒細(xì)且均勻；顆粒細(xì)且均勻； 傳質(zhì)快；傳質(zhì)快； 機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓；機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓； 化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動(dòng)相發(fā)生化化學(xué)穩(wěn)

19、定性好，不與流動(dòng)相發(fā)生化 學(xué)反應(yīng)。學(xué)反應(yīng)。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 一、化學(xué)鍵合相色譜法的固定相一、化學(xué)鍵合相色譜法的固定相 （一）鍵合相的種類（一）鍵合相的種類 非極性鍵合相非極性鍵合相 ： 非極性烴基，如非極性烴基，如C C18 18 C C8 8C C1 1與苯基等鍵合在硅膠表與苯基等鍵合在硅膠表 面；面； 用于反相色譜；用于反相色譜； 長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的k k增大，選擇性改善，載樣量增大，選擇性改善，載樣量 提高，穩(wěn)定性更好。提高，穩(wěn)定性更好。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 鍵合相的種類鍵合相的種類 u弱極性鍵合相：弱極性鍵合

20、相： 醚基和二羥基等鍵合相醚基和二羥基等鍵合相 用于反相或正相色譜用于反相或正相色譜 u極性鍵合相：極性鍵合相： 常用氨基常用氨基氰基鍵合相（氰乙硅烷基氰基鍵合相（氰乙硅烷基Si(CHSi(CH2 2) )2 2CN)CN) 鍵合硅膠鍵合硅膠 一般用于正相色譜一般用于正相色譜 u特殊用途的鍵合相特殊用途的鍵合相 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 （二）鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)（二）鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn) u鍵合反應(yīng)鍵合反應(yīng) 硅氧烷（硅氧烷（SiSiO OSiSiC C）型：氯硅烷與硅）型：氯硅烷與硅 膠進(jìn)行膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng)硅烷化反應(yīng) 2 2 SiOHClC H +SiSiSi Cl H 1

21、8 O R 1 18H C 37 37 R R R1 如：如：YWGYWGC C18 18H H3737，無定形硅膠 ，無定形硅膠YWGYWG上鍵合了上鍵合了 十八硅烷基；十八硅烷基；Spherisorb ODSSpherisorb ODS，球形硅膠，球形硅膠 Spherisorb Spherisorb 上鍵合了上鍵合了ODSODS。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn) u鍵合相的性質(zhì)鍵合相的性質(zhì) 含碳量：含碳的百分?jǐn)?shù)含碳量：含碳的百分?jǐn)?shù) 覆蓋度覆蓋度 ：已反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面：已反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面 硅醇基總數(shù)的比例硅醇基總數(shù)的比

22、例 封尾（封尾（end-cappingend-capping）：在鍵合反應(yīng)后，用）：在鍵合反應(yīng)后，用 三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，減少殘余硅三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，減少殘余硅 醇基。醇基。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 u鍵合相的特點(diǎn)鍵合相的特點(diǎn) 使用過程中不流失；使用過程中不流失； 化學(xué)穩(wěn)定性好；化學(xué)穩(wěn)定性好； 適于梯度洗脫；適于梯度洗脫； 載樣量大載樣量大 u注意注意： 流動(dòng)相的流動(dòng)相的pHpH一般應(yīng)在一般應(yīng)在3-83-8，否則會(huì)引起硅，否則會(huì)引起硅 膠溶解；膠溶解；( (也有適用寬也有適用寬pHpH范圍的鍵合相范圍的鍵合相) )。 鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)鍵合相的性質(zhì)和特

23、點(diǎn) 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 二、化學(xué)鍵合相色譜法的流動(dòng)相二、化學(xué)鍵合相色譜法的流動(dòng)相 u對(duì)流動(dòng)相的要求：對(duì)流動(dòng)相的要求： 與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 對(duì)試樣有適宜的溶解度。使對(duì)試樣有適宜的溶解度。使k k在在1 11010范圍內(nèi)，范圍內(nèi)， 與檢測(cè)器相適應(yīng)。例如用紫外檢測(cè)器時(shí)，選與檢測(cè)器相適應(yīng)。例如用紫外檢測(cè)器時(shí)，選 用截止波長(zhǎng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)的溶劑。用截止波長(zhǎng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)的溶劑。 純度高，粘度小。低粘度流動(dòng)相如甲醇純度高，粘度小。低粘度流動(dòng)相如甲醇乙乙 腈等可以降低柱壓，提高柱效。腈等可以降低柱壓，提高柱效。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色

24、譜法 （一）（一）流動(dòng)相對(duì)分離的影響流動(dòng)相對(duì)分離的影響 n n由色譜柱（固定相）性能決定，由色譜柱（固定相）性能決定， 主要受溶劑種類的影響，主要受溶劑種類的影響， k k受溶劑配比的影響。受溶劑配比的影響。 2 2 1 1- 4 n k k R 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 （二）流動(dòng)相的強(qiáng)度和選擇性（二）流動(dòng)相的強(qiáng)度和選擇性 u溶劑的極性（強(qiáng)度）溶劑的極性（強(qiáng)度） 正相色譜：溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)正相色譜：溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng) 反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強(qiáng)反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強(qiáng) u溶劑的選擇性溶劑的選擇性 不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，不同種

25、類的溶劑，分子間的作用力不同， 故選擇性不同故選擇性不同 u混合溶劑混合溶劑（二元或多元流動(dòng)相）（二元或多元流動(dòng)相） 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 u（一）一）HPLCHPLC中的速率理論中的速率理論 渦流擴(kuò)散渦流擴(kuò)散A A=2=2ddp p 球形、小粒度、均勻（球形、小粒度、均勻（RSDRSD5%5%）固定相，）固定相， 勻漿高壓填充，以降低勻漿高壓填充，以降低A A。 縱向擴(kuò)散縱向擴(kuò)散=2=2DDm m 可以忽略 可以忽略。 因?yàn)橐驗(yàn)镈 Dl l很小，室溫操作，且很小，室溫操作，且U U大于大于U U最佳 最佳， ， 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 HPL

26、CHPLC中的速率理論中的速率理論 傳質(zhì)阻抗傳質(zhì)阻抗 u固定相傳質(zhì)阻抗固定相傳質(zhì)阻抗C CS S可以忽略可以忽略 ，因，因d df f極極 小小 u流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗C Cm m u要求：要求： d dp p小，小，D Dm m大大 m 2 Pm m D d C 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 u靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗： u由于部分流動(dòng)相在固定相微孔內(nèi)的滯留由于部分流動(dòng)相在固定相微孔內(nèi)的滯留 u靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗系數(shù)靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗系數(shù)C Csm sm uC Csm sm d dp p2 2， C Csm sm 1 1/D/Dm m，而，而D Dm m

27、TT/ / u要求要求: : 固定相固定相d dp p2 2、 流動(dòng)相流動(dòng)相都小都小 HPLCHPLC中的速率理論中的速率理論 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 H H = =A A + + C Cm mu u + + C Csm smu u 原因原因：化學(xué)鍵合相，液體流動(dòng)相：化學(xué)鍵合相，液體流動(dòng)相 結(jié)果結(jié)果：HPLCHPLC的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是：的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是： 小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相；小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相； 低粘度流動(dòng)相，流速不宜過快；柱低粘度流動(dòng)相，流速不宜過快；柱 溫適當(dāng)。溫適當(dāng)。 HPLCHPLC中的速率理論中的速率理論 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效

28、液相色譜法 （二）正相鍵合相色譜法的分離條件（二）正相鍵合相色譜法的分離條件 u固定相固定相 極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相 等等 u流動(dòng)相流動(dòng)相 烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 （三）反相鍵合相色譜法的分離條件（三）反相鍵合相色譜法的分離條件 u固定相固定相非極性鍵合相如非極性鍵合相如ODSODS u流動(dòng)相流動(dòng)相以水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、以水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、 乙腈等極性調(diào)節(jié)劑乙腈等極性調(diào)節(jié)劑 弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制 劑劑 加入加入0.1%0.1%1%1%的醋酸鹽、磷

29、酸鹽可減的醋酸鹽、磷酸鹽可減 少殘余硅醇基的作用少殘余硅醇基的作用 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 （四）反相離子對(duì)色譜法的分離條件（四）反相離子對(duì)色譜法的分離條件 u固定相固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且盡可能選擇表面覆蓋度高且 疏水性強(qiáng)的非極性鍵合相，疏水性強(qiáng)的非極性鍵合相， u離子對(duì)試劑離子對(duì)試劑 離子對(duì)試劑所帶的電荷離子對(duì)試劑所帶的電荷 應(yīng)與試樣離子的電荷相反應(yīng)與試樣離子的電荷相反 u流動(dòng)相流動(dòng)相pHpH使試樣組分與離子對(duì)試劑全使試樣組分與離子對(duì)試劑全 部離子化部離子化 u有機(jī)溶劑及其濃度有機(jī)溶劑及其濃度 同一般同一般HPLCHPLC 第十八章第十八章 高效液相色譜法高

30、效液相色譜法 第三節(jié)高效液相色譜儀第三節(jié)高效液相色譜儀 u組成組成 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 色譜柱系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng) 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng) 數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 一、輸液系統(tǒng)一、輸液系統(tǒng) u高壓輸液泵高壓輸液泵 恒流泵：在輸送流動(dòng)相過程中流量恒流泵：在輸送流動(dòng)相過程中流量 恒定。常用柱塞往復(fù)泵恒定。常用柱塞往復(fù)泵 雙泵：為了克服流量的脈動(dòng)。雙泵：為了克服流量的脈動(dòng)。 有串聯(lián)式和并聯(lián)式有串聯(lián)式和并聯(lián)式 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng) 輸液泵應(yīng)具備的性能：輸液泵應(yīng)具備的性能： u流量精度高且穩(wěn)定流量精

31、度高且穩(wěn)定 u流量范圍寬流量范圍寬 u能在高壓下連續(xù)工作能在高壓下連續(xù)工作 u液缸容積小液缸容積小 u密封性能好，耐腐蝕密封性能好，耐腐蝕 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng) 輸液泵操作注意事項(xiàng)：輸液泵操作注意事項(xiàng)： u防止固體微粒進(jìn)入泵體防止固體微粒進(jìn)入泵體 u流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì) u防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完 u不超過規(guī)定的最高壓力不超過規(guī)定的最高壓力 u流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 二、分離和進(jìn)樣系統(tǒng)二、分離和進(jìn)樣系統(tǒng) u進(jìn)樣器進(jìn)樣器 進(jìn)樣閥（六

32、通閥）、自動(dòng)進(jìn)樣裝置進(jìn)樣閥（六通閥）、自動(dòng)進(jìn)樣裝置 u色譜柱色譜柱（columncolumn） 由柱管和固定相組成由柱管和固定相組成 分析柱、制備柱分析柱、制備柱 性能評(píng)價(jià)性能評(píng)價(jià) H H、n n、f fs s、k k和和的重復(fù)性，或的重復(fù)性，或R R。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 三、檢測(cè)系統(tǒng)三、檢測(cè)系統(tǒng) u（一）檢測(cè)器（一）檢測(cè)器(detector)(detector)的主要性能的主要性能 要求要求： 靈敏度（靈敏度（sensitivitysensitivity）高（檢測(cè)限低）高（檢測(cè)限低） 噪音（噪音（noisenoise）低）低 線性范圍（線性范圍（linear r

33、angelinear range）寬）寬 重復(fù)性（重復(fù)性（repeatabilityrepeatability）好）好 適用范圍廣（通用型、專屬型）適用范圍廣（通用型、專屬型） 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 （二）紫外檢測(cè)器（二）紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector)(ultraviolet detector) u檢測(cè)原理檢測(cè)原理： 朗伯比爾朗伯比爾 (Lambert-Beer) (Lambert-Beer) 定律，響應(yīng)定律，響應(yīng) 信號(hào)（吸光度）與濃度成正比信號(hào)（吸光度）與濃度成正比A A= =ClCl u特點(diǎn)特點(diǎn)： 靈敏度較高（靈敏度較高（1010-6 -6

34、 1010-9 -9 g/ml g/ml），噪音低，），噪音低， 線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞 樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 u局限局限： 只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng) 相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。 u專屬型、濃度型檢測(cè)器專屬型、濃度型檢測(cè)器 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器 u固定波長(zhǎng)檢測(cè)器固定波長(zhǎng)檢測(cè)器 ：254nm254nm u可變波長(zhǎng)檢測(cè)器：可變波長(zhǎng)檢測(cè)器： 光源：氘燈

35、（和鎢燈），光源：氘燈（和鎢燈）， 200200400400（800800）nmnm， 單色器，流通池（試樣），光電管單色器，流通池（試樣），光電管 光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似 u光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器 (photodiode array detector(photodiode array detector； PDAD)PDAD)： 一系列光電二極管，一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上約一系列光電二極管，一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上約 1nm1nm譜帶寬的單色光譜帶寬的單色光 第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法 紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器 u光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣