生物科學專業(yè)論文人參總皂苷對小鼠骨髓干細胞M719的影響研究

1、本科生畢業(yè)論文(設計)開題報告書 題 目 人參總皂苷對小鼠骨髓干_細胞M719的影響研究_ 學生姓名 曾平文 學 號 2 專業(yè)班級 生科11101 指導老師 唐琳 2015年 01 月 10日論文（設計）題目人參總皂苷對小鼠骨髓干細胞M719的影響研究課題目的、意義及相關研究動態(tài)： 目的意義：通過體外貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的小鼠骨髓干細胞系M719并利用藥物對其進行處理，驗證人參總皂苷是否對其有促進增殖的作用；為臨床上骨髓移植種子干細胞的體外擴增提供借鑒。人參總皂苷(Total Ginsenoside Ginseng Root)，又名人參總皂甙，是人參提取物的主要成分。人參提取物可使皮膚光滑，柔軟有彈

2、性，延緩衰老，還可以抑制黑色素的產生。 用在護發(fā)產品中，可以提高頭發(fā)的強度，防止脫發(fā)，白發(fā)，長期使用可使頭發(fā)烏黑亮澤。骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived Mesenchymal stemcells，骨髓MSCs）是骨髓內除造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSC）之外的另一類干細胞，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，在體內外均具有支持和調控造血的作用。因其比較容易貼壁，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。骨髓間充質干細胞由于其來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，并且具有較強的分化潛能和可自體移

3、植等優(yōu)點，越來越受到學者們的青睞，被認為是不久即將被引入臨床治療的最優(yōu)干細胞。 相關研究動態(tài)：有關研究人士通過實驗得出人參皂苷能促進體外原代培養(yǎng)的小鼠骨髓MSCs及其傳代擴增細胞的增殖3;人參總皂苷不僅能抑制人慢性粒細胞白血病細胞（K562細胞）增殖,還可以誘導其分化,人參總皂苷增殖抑制作用可能與誘導K562細胞凋亡有關4; 中國預防獸醫(yī)學報上刊登的有關論文得出人參總皂苷對馬立克氏病腫瘤細胞系MSB一1細胞的增殖存在抑制作用5；還有研究者通過實驗表明在一定的濃度,人參三醇組皂苷Rh1和ppt能減低小鼠原代骨髓MSC的集落生成能力,抑制MSC傳代細胞的增殖,而Re、Rg對這些細胞的體外增殖無明顯

4、影響6; 在環(huán)磷酸胺導致的骨髓抑制移植狀態(tài)下,人參皂苷可促進骨髓造血功能的恢復,增加骨髓細胞總數,提高HSCP、硯犯P及ER二的比例,但是否促進骨髓干細胞的動員或分化還需進一步研究7。貼壁培養(yǎng)篩選得到的小鼠MSCs，除了具有多能性的干細胞，還可能含有各胚層的原始細胞推測體外誘導分化所觀察到的定向分化現象，既可能是多能性細胞被定向誘導分化，也可能是由存在骨髓的各胚層原始細胞在誘導條件下優(yōu)勢增殖的結果，有待進一步的研究證實。課題的主要內容（觀點）、創(chuàng)新之處： 課題的主要內容： 通過對小鼠骨髓干細胞系M719進行人參總皂苷藥物處理，并利用酶標檢測儀分析軟件對小鼠骨髓干細胞系M719進行數據分析，從而

5、探討本實驗室所建小鼠骨髓干細胞系M719在經過藥物（人參總皂苷）處理后的增殖影響。 創(chuàng)新之處：在哺乳類實驗動物中，由于小鼠體小，飼養(yǎng)管理方便，易于控制，生產繁殖快，研究最深，有明確的質量控制標準，已擁有大量的近交系、突變系和封閉群，因此在各種實驗研究中，用量最大，用途最多。但是以活鼠做實驗，成本較高，通過建立小鼠干細胞系，培養(yǎng)出生長快速的小鼠干細胞，可以大大降低對小鼠干細胞的研究成本，且為實驗取材提供方便。通過建立小鼠干細胞系，培養(yǎng)出生長快速的小鼠干細胞，可以大大降低對小鼠干細胞的研究成本，且為實驗取材提供方便。本次實驗為求驗證所建小鼠骨髓干細胞系M719與原代小鼠細胞在經過藥物（人參總皂苷）

6、處理后是否具有促進增殖的作用，可為以后對臨床上骨髓移植種子干細胞的體外擴增提供借鑒。研究方法、設計方案或論文撰寫提綱：1. 材料和方法：1.1 實驗材料：小鼠骨髓干細胞系M719細胞1.2 實驗試劑：DMEM培養(yǎng)液(Dulbeccos Modified Eagles Medium)：DMEM粉(低糖，Sigma公司生產)用三蒸水溶解，培養(yǎng)基加入NaHCO3 3.7 g/L，調pH至7.2，過濾除菌，4保存，使用期2個月以內。胎牛血清(FBS)：杭州四季青公司產品（批號：20070704、20070616、20070510、20061024、），56滅活30min，分裝后-20貯存。胰蛋白酶溶液

7、：取0.25g胰蛋白酶溶于100 ml PBS緩沖液(pH8.0)中，充分溶解，過濾除菌。磷酸鹽生理鹽水緩沖液(PBS)：取NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4H2O 1.56 g，KH2PO4 0.20 g，用三蒸水溶解，定容至1 L，高壓滅菌，4保存?zhèn)溆?。藥物（人參總皂苷藥?00mmol/ml）、1.25%Et-OH（酒精）、MTT檢測試劑、DMSO細胞裂解試劑。1.3 實驗設備與器材：小試劑瓶若干，小離心管 ，細胞培養(yǎng)瓶（新），計時器，移液槍，槍頭（5ml、1ml、0.1ml各若干支），血球計數板、超凈工作臺。2. 實驗流程2.1小鼠骨髓干細胞系M719細胞的培

8、養(yǎng)2.2 藥物處理： （1）取兩日內傳代的M719細胞，通過胰酶處理，離心去除死細胞，混勻計后配制成4104個/ml 的細胞混合液，給96孔板加注100ul細胞混合液備用。（2） 取10個1.5毫升的離心管依次排好，配置含不同濃度的Rb1液，加入NBS和DMEM混勻，給98孔板標上濃度梯度后依次加入藥物混合液，每個梯度組滴加8個孔，蓋上蓋子，標上日期等信息。（3） 待細胞貼壁大致完成前加入MTT處理4小時，然后倒掉板子里的液體，加入100-150ul的DMSO,放至搖床搖勻（10分鐘），最后用酶標儀檢測，得出數據。2.3 數據的整理：去除不合理數據，求平均數，得出最適的人參總皂苷藥劑濃度。2.

9、4 最適濃度的藥物處理細胞：取兩瓶同代的小鼠骨髓干細胞系M719細胞，一瓶加入最適濃度的人參總皂苷藥劑，另一瓶作為對照，不加人參總皂苷藥劑。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后用流式細胞儀檢測細胞的周期和活性，從而驗證試驗的結論。完成期限和預期進度：2014.12-2015.01 相關文獻查詢，實驗設計，實驗材料準備與預備試驗2015.01-2015.03 畢業(yè)論文實驗實施，數據處理與分析2015.04-2015.05 畢業(yè)論文寫作與答辯相關參考資料：1 于美娟，張雅尼，馮善偉，熊符，張成；小鼠骨髓間充質干細胞分離培養(yǎng)方法的建立J；解剖學研究；2009年9月31卷6期424-427. 2 周進明，鄒仲敏

10、，郭朝華，何穎，張勇，王勁，王蒙，羅成基，程天民;小鼠骨髓間質干細胞的生物學特點及分化潛能鑒定J；第三軍醫(yī)大學學報；2002年1月24卷1期58-61.3 吳晶晶；人參皂苷對小鼠骨髓MSC體外增殖及成骨分化的影響D；2010年4月.4 雷翠蓉,姜 蓉,王紅寧,何 軒,左國偉,陳地龍,官 濤,王建偉；人參總皂苷對K562細胞的增殖抑制及誘導分化作用J；激光雜志；2011年32卷2期69-73.5 付本懂，許小琴，申海清，王春元，王魯，褚秀玲礴，韋旭斌人參總皂苷對MSB一1細胞的增殖抑制作用及其機理初探J；中國預防獸醫(yī)學報；2007年6月29卷6期471-474.6 朱海林；人參三醇組皂昔對小鼠骨髓MSC體外生長的影響及相關實驗技術的研究D；2009年5月.7 徐尚福，余麗梅，方寧，劉杰，吳芹；人參皂苷Rg1對小鼠