氨基酸酵工藝學PPT課件

1、第三章第三章 氨基酸發(fā)酵工藝學氨基酸發(fā)酵工藝學 學習氨基酸發(fā)酵工藝學的目的、研究對象、任務及內容學習氨基酸發(fā)酵工藝學的目的、研究對象、任務及內容 氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵，由發(fā)酵所生成的產物氨基酸， 都是微生物的中間代謝產物，它的積累是建立在對微生物正常代謝的抑制。 在脫氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改變、控制微生物的代謝，使有用產 物大量生成、積累。 以探討氨基酸發(fā)酵工廠的生產技術為主要目的。氨基酸的生產以發(fā)酵 為主，發(fā)酵過程的控制是整個生產的關鍵，產物的提純及設備選用當否， 也會影響產物得率。氨基酸發(fā)酵工藝學研究的對象應該包括從投入原料到 最終獲得產品的整個過程，其中有微生物生化問

2、題、生化工程問題，也有 分析與設備問題。 今后的發(fā)展是采用誘變、細胞工程、基因工程的手段選育出從遺傳角 度解除了反饋調節(jié)和遺傳性穩(wěn)定的更理想菌種，提高產酸；采用過程控制， 優(yōu)化工藝進行連續(xù)、自動化生產獲得穩(wěn)產高產；探求新工藝、新設備,以提 高產率；研究發(fā)酵機制問題，以便能更好地控制氨基酸微生物中間代謝產 物的發(fā)酵。 緒論緒論 第一節(jié)、氨基酸概論 1、氨基酸簡介 構成蛋白質的基本分子單元。 碳原子分別以共價鍵連接氫原子、羧基和氨 基及側鏈。側鏈不同，氨基酸的性質不同。 目前世界上可用發(fā)酵法生產氨基酸有20多種。 NH3 CH COOH R CHNH2COO - R + 2、氨基酸的用途 （1）食

3、品工業(yè)： 強化食品：賴氨酸， 蘇氨酸，色氨酸于小麥 中 增鮮劑：谷氨酸單鈉 和天冬氨酸 苯丙氨酸與天冬氨酸 可用于制造低熱量二肽 甜味劑(-天冬酰苯丙 氨酸甲酯),此產品1981 年獲FDA批準,現在每年 產量已達數萬噸。 （2）飼料工業(yè)： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動物飼料 ，添加 蛋氨酸、賴氨酸、精氨酸等必須氨基酸可促進動物生長 發(fā)育、改善肉質、節(jié)省蛋白飼料、降低成本等。 （3 ）醫(yī)藥工業(yè)： 多種復合氨基酸制劑可通過輸液治療營養(yǎng)或代謝失調 氨基酸注射液由1985年的100萬瓶增長到2003的1.5萬瓶， 每年以15-20%的速度遞增，全行業(yè)的年產值預計能達到 10億元 苯丙氨酸與氮芥子

4、氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對骨 髓腫瘤治療有效,且副作用低。 （4）化學工業(yè)： 谷氨基鈉作洗滌劑,丙氨酸制造丙氨酸纖維（合成高 分子化合物）。能保持皮膚濕潤的潤膚劑焦谷氨 酸鈉和質量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人 造纖維和涂料。 表表3-8 世界氨基酸主要生產廠家生產能力世界氨基酸主要生產廠家生產能力 品名 廠家生產能 力 品名廠家生產能 力 蛋氨酸日本曹達20000谷氨酸味之素60000 蛋氨酸日本住友化學5000谷氨酸日本旭化成15000 蛋氨酸日本化藥2500谷氨酸協和發(fā)酵15000 蛋氨酸德國迪高沙85000谷氨酸日本武田藥品15000 蛋氨酸法國AEC105000色氨酸味之素10

5、0 蛋氨酸美國孟山都45000色氨酸昭和電工200 蛋氨酸墨西哥阿爾拜梅克斯5000色氨酸三井東壓100 蛋氨酸西班牙Sodeti4000色氨酸田造制藥50 蛋氨酸蘇聯Volgograd4000色氨酸日本化藥50 色氨酸協和發(fā)酵50 賴氨酸日本味之素55000甘氨酸日本有機合成化學6000 賴氨酸日本協和發(fā)酵20500甘氨酸協和發(fā)酵5000 賴氨酸日本東麗6500甘氨酸日本化藥1000 賴氨酸南朝鮮味元10000丙氨酸武藏野化學研究所 丙氨酸日本化藥 3、氨基酸的生產方法 w 發(fā)酵法： 直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、 抗氨基酸結構類似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸結構類似物突 變株的營

6、養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營養(yǎng)缺陷型回復突變株發(fā)酵。 包括添加前體發(fā)酵法：如用鄰氨基苯甲酸，生產L-色氨酸； 甘氨酸生產L-絲氨酸。 w 酶法：利用微生物細胞或產生的酶來制造氨基酸。延胡索 酸和銨鹽為原料，經天冬氨酸酶催化生產L-天冬氨酸。 w 提取法：常用毛發(fā)、血粉等蛋白質原料水解，從中提取。 如胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 w 合成法：合成法獲得DL-蛋氨酸、不對稱合成法獲得L-氨 基酸。如丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學合成法由于前體物的成本 高，工藝復雜，難以達到工業(yè)化生產的目的。 第二節(jié)、氨基酸發(fā)酵菌株的育種 是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之一 w 發(fā)酵工程要求微生物大量地合

7、成特定的代 謝產物，這一目的只有當微生物的部分代 謝調控機制遭到破壞時才能達到。用人工 誘變的方法有目的地改變微生物固有的調 節(jié)機制，使合成產物的途徑暢通無阻，最 大限度地積累特定產物，這種發(fā)酵稱為代 謝控制發(fā)酵。 1、用野生菌株的方法 w 分離的野生菌株具備積累產物的特性，可用 于直接發(fā)酵（產率低）。如谷氨酸發(fā)酵。 w 通過轉換發(fā)酵，可延伸獲得其它產物。主要 采用改變培養(yǎng)條件。如谷氨酸發(fā)酵中改變銨 離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉向谷氨酰 胺和纈氨酸發(fā)酵。 2.用營養(yǎng)缺陷變異株的方法 w 通過誘變出菌體內氨基酸生物合成某步反應 阻遏的營養(yǎng)缺陷型變異體，使生物合成在中 途停止，不讓最終產物起調控

8、作用。 w 如用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，谷氨酸 缺陷株的鳥氨酸發(fā)酵，異亮氨酸缺陷菌株的 脯氨酸發(fā)酵。 3.類似物抗性變異株的方法 w 用一種與自己想獲得的氨基酸結構相類似 的化合物加入培養(yǎng)基內，使其發(fā)生控制作 用，從而抑制微生物的生長。這樣，就可 以得到在這種培養(yǎng)基中能夠生長的變異株， 而這種變異株正是解除了調控機制的，能 夠生成過量的氨基酸。 w 利用此方法發(fā)酵的有:蘇氨酸、賴氨酸、異 亮氨酸、組氨酸和精氨酸。 高絲氨酸脫氫酶 4. 體內及體外基因重組的方法 w 基因工程包括細胞內基因重組方法和試管內 的體外基因重組方法。 w 體內基因重組在應用上又稱為雜交育種，主 要方法包括：轉化、轉

9、染、接合轉移、轉導 和細胞融合等，這都是在細胞內暫時地產生 染色體的局部二倍體，在兩條DNA鏈之間引起 兩次以上的交叉，是遺傳性重組現象。 w 細胞內基因重組技術的缺點是，現在只在同 種或有近緣關系的微生物之間進行并較難成 功。 代謝工程 在闡明代謝途徑及其調控規(guī)律的基礎上，應用重組DNA 技術可以改變代謝途徑分支點上的流量或引入新的 代謝步驟與構建新的代謝網絡。 其主要步驟為: w 鑒定目標代謝途徑涉及的酶(特別是限速酶); w 取得酶基因，必要時可用蛋白質工程技術，如定點誘變， 基因剪接等，使蛋白具有新的特點(增強活性或穩(wěn)定性、 解除反饋抑制等); w 將一種或多種異源的或改造后的酶基因與

10、調節(jié)元件一起 克隆進目標生物; w 使調節(jié)元件的作用及培育條件最優(yōu)化。 5、基因工程菌 通過基因工程技術，構建理想的工程菌株通過基因工程技術，構建理想的工程菌株 5.1載體-受體系統(tǒng)及克隆表達的研究 受體的獲得 w 目前使用的氨基酸工程菌受體主要是大腸桿菌K-12及棒狀桿 菌家族，通常是通過誘變選育出的基礎產率較高的菌株。 w 大腸桿菌遺傳背景研究得清楚，載體系統(tǒng)完善，利于工程菌 的構建，但它含有內毒素且不能將蛋白產物分泌至胞外，為 應用帶來困難。 w 棒狀桿菌能克服這兩個缺點，但載體受體系統(tǒng)研究較晚且有 限制修飾系統(tǒng)的障礙，所以獲得利于外源基因導入及表達且 能穩(wěn)定遺傳的受體菌是尚待解決的問題

11、。 5.2載體的構建 w 有效的載體需要有在受體菌中可啟動的復制起始位點，這 可從棒狀桿菌家族內源小質粒中獲得; w 載體所需的篩選標記及外源基因插入的多克隆位點，可從 常用的克隆載體中獲得。 5.3基因轉移手段 w 通常采用的方法有:原生質體轉化、轉導，電轉化， 接合轉移。 w 原生質體轉化的方法是較早采用的方法，由于受到原 生質體再生條件的局限，效率不高; w 電轉化方法由于高效，快速被廣泛使用，目前它的轉 化效率可達到原生質體轉化法的100-1000倍。 w 接合轉移可用于基因在親緣關系遠的物種之間的轉移， 并且可將外源基因整合于染色體上，易于穩(wěn)定遺傳。 第三節(jié)第三節(jié) 氨基酸發(fā)酵的代謝控

12、制氨基酸發(fā)酵的代謝控制 w 控制發(fā)酵的條件 w 控制細胞滲透性 w 控制旁路代謝 w 降低反饋作用物的濃度 w 消除終產物的反饋抑制與阻遏作用 w 促進ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 一、菌種的代謝調控 是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之二是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之二 1、控制發(fā)酵環(huán)境條件 專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改變代謝途徑和 產物。 2、控制細胞滲透性 生物素、油酸和表面活性劑，引 起細胞膜的脂肪酸成分的改變。 細胞內生物素水平高，Glu不能 通過細胞膜 青霉素：抑制細胞壁的合成，由 于細胞面內外的滲透壓而泄露出 來。 表面活性劑增加細胞膜通透性 氨基酸發(fā)酵必須考慮的重要因素 細

13、胞透性的調節(jié) 細胞透性的調節(jié)，一般通過向培養(yǎng)基中添加化學成分 （如生物素、油酸、甘油、表面活性劑、青霉素等，達到抑 制磷脂、細胞膜的形成或阻礙細胞壁的正常生物合成，使谷 氨酸生產菌處于異常生理狀態(tài)，解除細胞對谷氨酸向胞外漏 出的滲透障礙。 w 生物素：影響磷脂的合成及細胞膜的完整性。 w 油酸：直接影響磷脂的合成及細胞膜 w 甘油：甘油缺陷型菌株喪失-磷酸甘油脫氫酶，不能合成 -磷酸甘油和磷脂。限量供應， 控制了細胞膜中與滲透性 直接關系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而積累。 w 表面活性劑：對生物素有拮抗作用，拮抗不飽和脂肪酸的合 成，導致磷脂合成不足，影響細胞膜的完整性，提供細胞膜 對谷氨酸

14、的滲透性。 w 青霉素：抑制細菌細胞壁的后期合成，形成不完整的細胞壁， 使細胞膜失去保護，使胞內外的滲透壓差導致細胞膜的物理 損傷，增大谷氨酸向胞外漏出的滲透性、 生物素阻斷脂肪酸的合成影響細胞膜的合成 表面活性劑對生物素有拮抗阻斷脂肪酸的合成影響細胞膜的合成 在對數生長期添加青霉素抑制細胞壁合成細胞膜損傷 甘油缺陷型磷脂的合成受阻 影響細胞膜的合成 油酸缺陷型阻斷不飽和脂肪酸的合成影響細胞膜的合成 3、控制旁路代謝 4、降低反饋作用物的濃度 w 利用營養(yǎng)缺陷 型突變株進行 氨基酸發(fā)酵必 須限制所要求 的氨基酸的量。 限制瓜氨酸的 濃度可解除反 饋抑制，實現 鳥氨酸的生物 合成。 5、消除終產

15、物的反饋抑制與阻遏作用 使用抗氨基酸結構類似物突變株的方法或者通過選 育營養(yǎng)缺陷型菌株。 6、促進ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 w ATP的積累可促進氨基酸的生物合成 第四節(jié)、谷氨酸生物合成及其發(fā)酵生產調控 HOOC CH 2 CH 2 CH COOH NH 2 代謝控制發(fā)酵是用遺傳學或其他生物化學的方法，人為 地在分子水平上改變和控制微生物的代謝，打破微 生物正常的代謝調節(jié)，使有用產物大量生成和積累。 氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵，發(fā)酵技術的關鍵是 打破微生物的正常代謝調節(jié)，人為控制微生物的代謝。 一一. 谷氨酸的生物合成途徑谷氨酸的生物合成途徑 異檸檬酸 裂解酶 -酮戊二酸脫氫酶

16、1、谷氨酸生物合成中的幾個途徑（正常途徑） （1）糖酵解途徑 （EMPEMP） （2）磷酸已糖途徑 （HMP)HMP) （3）三羧酸循環(huán)(TCA環(huán)) （4）乙醛酸循環(huán) （DCA環(huán)） （5）二氧化碳固定反應 PEP+CO2+GTP 草酰乙酸+GDP 丙酮酸+CO2+NADH 蘋果酸+NAD 草酰乙酸 CO2 NAD+ NADH+H+ （6）-KGA的還原氨基化反應 PEPPEP羧化酶羧化酶 蘋果酸酶蘋果酸酶 蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶 C6H12O6 + NH3 + O2 C5H9O4N + CO2 + 3H2O 在GA產生菌菌體內CO2固定反應有以下兩條途徑： 蘋果酸酶蘋果酸酶 丙酮酸羧化酶丙酮

17、酸羧化酶 磷酸烯醇丙酮磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶酸羧化酶 CO2固定反應固定反應(丙酮酸羧化支路丙酮酸羧化支路) 2、GA生物合成的理想途徑 （1）GA產生菌必須具備以下條件（內在因素 ） -酮戊二酸脫氫酶的活性微弱或缺失 TCA環(huán)阻斷， -酮戊二酸積累 琥珀酸輔酶A TCA環(huán)正常 GA產生菌體內的NADPH的氧化能力欠缺或喪失 積累NADPH，抑制KGA的脫羧氧化 GA產生菌體內必須有乙醛酸循環(huán)（DCA）的關鍵酶異檸檬酸裂解酶 通過該酶酶活性調節(jié)實現DCA循環(huán)的封閉，GA 發(fā)酵積累 菌體有強烈的L谷氨酸脫氫酶活性 KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP 提供NADPH,用于還

18、原-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化還原共扼體系 該反應的關鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯 3/2Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸 乙酰輔酶A + 乙酰輔酶A + 乙酰輔酶A 檸檬酸 則有： 3/2 C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4N+ 4 CO2 產率：147 /（180*3/2） = 54.4% CO2 谷氨酸 在前述GA 合成所必需的條件的基礎上，體系不存在CO2固定反應，則有： 體系存在CO2的固定反應 結論 通過DCA環(huán)提供C4二羧酸時谷氨酸對糖的 轉化率僅為54.4% 在谷氨酸發(fā)酵中，DCA環(huán) 可以作為TCA循環(huán)有缺陷 時C4二羧酸的補充 .在前述GA

19、 合成所必需的條件的基礎上（封閉乙醛酸循環(huán)）存在CO2固定反應， 則有： Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2 則有： C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 N + CO2 （來自何方） 產率：147 / 180 = 81.7% 乙酰輔酶A + C4二羧酸 CO2 草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶） 蘋果酸（蘋果酸激酶） 檸檬酸（DCA循環(huán)封閉） 谷氨酸 四碳二羧酸的來源 在生產菌中檢出 CO2固定反應酶活性 磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和蘋果酸酶 谷氨酸對糖的轉化率達到81.7% C6H12O6+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2+3H2O 需要Mn+做催化劑，所以

20、，在GA發(fā)酵過程中需要向培養(yǎng)基中補充Mn+ 實際上，發(fā)酵過程中不可能控制檸檬酸合成所需的C4二羧酸完全來自于CO2 固定反應，體系也不可能完全不存在CO2固定反應，因此，GA 發(fā)酵的糖酸 轉化率應在：54.4%81.7%。目前，國內的GA生產企業(yè)的糖酸轉化率通 常都在50%以內： 提高GA的潛力是很大的，具體表現在： （1）強化CO2固定反應，具體措施：Mn+ ，生物素？ （2）控制溶氧濃度是非常重要的 低的溶氧濃度，則丙酮酸向乳酸方向轉化 高的溶氧濃度，則NADPH 有被氧化的可能， 氨的導入 合成谷氨酸的反應有3種： -酮戊二酸 + 天冬氨酸或丙氨酸 谷氨酸轉氨酶AT 谷氨酸-酮戊二酸+

21、-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP + 谷氨酸合成酶GS -酮戊二酸NH4+NADPH谷氨酸H2ONADP+ 谷氨酸脫氫酶GHD + （2）影響谷氨酸合成的外在因素 a、生物素對糖代謝的影響 生物素參與糖代謝作用：增加糖代謝的速度(對TCA有促進作用） 乳酸積累 碳源利用率降低，發(fā)酵液的pH值下降。 而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變丙酮酸積累 A、生物素對GA發(fā)酵的影響 主要影響糖降解速度，不影響EMP與HMP途徑的比率。生物素充足 的條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也得到提高，但由于糖降 解速度顯著提高，打破了糖降解速度與丙酮酸氧化速度之間的平 衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應，引起乳

22、酸的溢出。 研究表明，異檸檬酸裂解酶活性 為醋酸誘導 受琥珀酸的阻遏，抑制 當VH缺乏時： （1）丙酮酸的有氧氧化就會減弱？則：乙酰輔酶A的生成 量就會少，醋酸濃度降低，它的誘導作用降低；通過控制生 物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性 （2）VH對TCA循環(huán)的促進作用的降低，使得其中間產物 琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和 抑制作用加強；乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，代謝流向異檸 檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移動 兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失，DCA 循環(huán)得到封閉。 b、控制VH的濃度，以實現對于乙醛酸循環(huán)的封閉 c、生物素對氮代謝的影響 VH豐富

23、時，出現“只長菌，不產酸只長菌，不產酸”的現象 GA發(fā)酵過程中，前期，菌體的增殖期，一定的量 的生物素是菌體增殖所必需的；而在產物合成期， 則要限制生物素的濃度，以保證產物的正常合成。 結論 氨的導入時生物素缺乏， NH4+影響糖代謝速度：提高糖代謝速度 高效合成谷氨酸 生物素充足時， NH4+不影響糖代謝速度 關于氮代謝的調節(jié)： 控制谷氨酸發(fā)酵的關鍵之一就是降低蛋白質的合成 能力，使合成的谷氨酸不能轉化成其他氨基酸或參與 蛋白質合成。 在生物素亞適量的情況下，幾乎沒有異檸檬酸裂解 酶，琥珀酸氧化能力弱，蘋果酸和草酰乙酸脫羧反 應停滯，在銨離子適量存在下，生成積累谷氨酸。 生成的谷氨酸也不通過

24、轉氨作用生成其他氨基酸和 合成蛋白質。 在生物素充足的條件下，異檸檬酸裂解酶活性增強， 琥珀酸氧化能力增強，丙酮酸氧化力加強，乙醛酸 循環(huán)的比例增加，草酰乙酸、蘋果酸脫羧反應增強， 蛋白質合成增強，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過 轉氨作用生成的其他氨基酸量增加。 d、VH對菌體細胞膜通透性的影響 通常谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是VH-，而VH又是菌體細胞膜合成的必須物 質，因此，可以通過控制VH的濃度（干擾磷脂中的脂肪酸的生物合成）干擾磷脂中的脂肪酸的生物合成） 來實現的來實現對菌體細胞膜通透性的調節(jié) 。 葡萄糖 丙酮酸 + 丙酮酸 乙酰輔酶A 乙酰輔酶 乙酰輔酶A羧化酶 （輔酶是VH ） CO2

25、丙二酰輔酶A 丙二酰輔酶A C4 C6 CO2 培養(yǎng)基中生物素限量時，胞內AA 92% 胞外 培養(yǎng)基中生物素豐富時，胞內AA 12% 胞外 CO2 Glu生產菌大多是生物素缺陷型，發(fā)酵時控制生物素亞適 量，使細胞變形拉長，改變了細胞膜的通透性引起代謝失 調使Glu得以積累。 生物素貧乏時，細胞內的Glu含量少而且容易析出，而培 養(yǎng)基中積累大量的Glu；生物素豐富時，培養(yǎng)基中幾乎不 積累Glu，而細胞內卻含有大量的Glu，且不易被析出。 這說明生物素對細胞膜通透性有重要影響。這說明生物素對細胞膜通透性有重要影響。 谷氨酸發(fā)酵的關鍵在于發(fā)酵培養(yǎng)期間谷氨酸生產菌細胞膜結 構與功能發(fā)生特異性變化，使細

26、胞膜轉變成有利于谷氨酸向膜 外滲透的形態(tài)，使終產物不斷排出細胞外，胞內谷氨酸不能積 累到引起反饋調節(jié)的濃度，胞內谷氨酸源源不斷被優(yōu)先合成， 分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中積累。 B、供氧濃度 過量：NADPH的再氧化能力會加強，使-KGA的還原氨基化受到影響， 不利于GA 的生成。 供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產生，同 時，一部分葡萄糖轉成了乳酸，影響了糖酸轉化率，降低了產物的提出率。 C、NH4+濃度 （1）影響到發(fā)酵液的pH值 （2）與產物的形成有關： 過低，不利于-KGA的還原氨基化；過高，產生谷 氨酰胺。 NH4+的供給方式： （1）液氨 （2）流加尿素 D、磷酸鹽

27、 過量：（1）促進EMP途徑，打破EMP與TCA之 間的平衡，積累丙酮酸，產生乳酸等 （2）產生并積累Val， Glucose 丙酮酸 丙酮酸 + 活性乙醛 -乙酰乳酸 Val Val（1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止 （2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸轉化率 （3）發(fā)酵液中的Val存在，嚴重的影響GA 的結晶、提出 n 研究證明：研究證明： 谷氨酸生產菌種存在EMP途徑的全部酶和HMP途徑有關 的酶 TCA循環(huán)中的檸檬酸、順烏頭酸、異檸檬酸能定量地生 成谷氨酸，其相應的酶與谷氨酸合成有關 以醋酸和乙醇為原料進行谷氨酸發(fā)酵時，DCA循環(huán)是C4 二羧酸的唯一補充來源；但是以葡萄糖

28、為原料時，在谷 氨酸生成期此循環(huán)應關閉 谷氨酸菌存在CO2固定生成草酰乙酸的PEP羧化酶和蘋 果 酸酶，與谷氨酸得率正相關 第五節(jié)第五節(jié) 谷氨酸生物合成的調節(jié)機制谷氨酸生物合成的調節(jié)機制 一、谷氨酸生物合成的調節(jié) 谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶 -酮戊二酸脫氫酶酮戊二酸脫氫酶 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶 優(yōu)先合成優(yōu)先合成 在微生物的代謝中，Glu比Asp優(yōu)先合成； 合成過量時則抑制谷氨酸脫氫酶，使代謝轉向合成Asp； Asp過量時反饋抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。 谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶(GDH)的調節(jié)的調節(jié) 谷aa脫氫酶 谷aa對其反饋抑制和反

29、饋阻遏 檸檬酸合成酶的調節(jié)檸檬酸合成酶的調節(jié) 檸檬酸合成酶 TCA的關鍵酶，受能荷調節(jié)，谷aa反饋阻遏，烏頭酸反饋抑制 所以，正常代謝不積累Glu 異檸檬酸脫氫酶的調節(jié)異檸檬酸脫氫酶的調節(jié) 細胞內-酮戊二酸的量與異 檸檬酸的量需維持平衡。當-酮戊二酸過量時,將對異 檸檬酸脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用，停止合成-酮戊二酸。 異檸檬酸脫氫酶-酮戊二酸反饋抑制 -酮戊二酸脫氫酶酮戊二酸脫氫酶:谷氨酸產生菌中先天性的喪失或微弱。 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 PEP受天冬aa反饋抑制，受谷aa和天冬 aa反饋阻遏 w 喪失或有微弱的-酮戊二酸脫氫酶活力，使-酮戊二酸不能繼續(xù)氧化； w CO2

30、固定能力強，使四碳二羧酸全部由CO2固定反應提供，而不走乙醛酸循 環(huán)； w 谷氨酸脫氫酶的活力很強，并喪失谷氨酸對谷氨酸脫氫酶的反饋抑制和反饋 阻遏，同時，NADPH2再氧化能力弱，這會使-酮戊二酸到琥珀酸的過程受 阻； w 有過量的NH4+ 存在，-酮戊二酸經氧化還原共軛氨基化反應而生成谷氨酸 卻不形成蛋白質，從而分泌泄漏于菌體外； w 同時，谷氨酸生產菌應不利用體外的谷氨酸，使谷氨酸成為最終產物。 w 生產菌株還應該具有生物素合成缺陷、油酸合成缺陷和甘油合 成缺陷等特點。 二二. 谷氨酸高產菌模型特征谷氨酸高產菌模型特征 三、谷氨酸生產的代謝調控 1.切斷或減弱支路代謝 2.解除自身的反饋

31、抑制 3.增加前體物的合成 4.提高細胞膜的滲透性 5.強化能量代謝 6.利用基因工程技術構建谷氨酸工程菌株 （一）、谷氨酸生產菌的具體育種思路（一）、谷氨酸生產菌的具體育種思路 （谷氨酸代謝控制發(fā)酵的基本方法和實現的途徑）（谷氨酸代謝控制發(fā)酵的基本方法和實現的途徑） 1.切斷或減弱支路代謝切斷或減弱支路代謝 選育減弱選育減弱-酮戊二酸進一步氧化能力的突變株酮戊二酸進一步氧化能力的突變株 減弱減弱 -酮戊二酸脫氫酶復合體的活性，可以使代謝流向谷氨酸，酮戊二酸脫氫酶復合體的活性，可以使代謝流向谷氨酸， 從而使谷氨酸得到積累。從而使谷氨酸得到積累。 選育減弱選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株途徑

32、后段酶活性的突變株 從葡萄糖到丙酮酸的反應由從葡萄糖到丙酮酸的反應由EMP途徑和途徑和HMP途徑組成。途徑組成。 但通過但通過HMP也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基 酸、輔酶酸、輔酶Q、維生素、維生素K、葉酸等物質。消耗了葡萄糖，使、葉酸等物質。消耗了葡萄糖，使 谷氨酸的產率降低。如削弱或切斷這些物質的合成途徑，谷氨酸的產率降低。如削弱或切斷這些物質的合成途徑， 就會使谷氨酸的產率增加?？赏ㄟ^選育莽草酸缺陷型或添就會使谷氨酸的產率增加?？赏ㄟ^選育莽草酸缺陷型或添 加芳香族氨基酸能促進生長的突變株以及抗嘌呤、嘧啶類加芳香族氨基酸能促進生長的突變株以

33、及抗嘌呤、嘧啶類 似物或核苷酸類抗生素，如德夸菌素、狹霉素似物或核苷酸類抗生素，如德夸菌素、狹霉素C抗性突變抗性突變 株來實現。株來實現。 選育不分解利用谷氨酸的突變株選育不分解利用谷氨酸的突變株（不分解）（不分解） 積累谷氨酸，必須使菌種不能分解利用谷氨酸，可通過 選育以谷氨酸為唯一碳源，菌體不長或生長微弱的突變株 來實現。 選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株 四碳二羧酸是由CO2固定反應和乙醛酸循環(huán)所提供的。 減弱乙醛酸循環(huán)，CO2固定反應所占的比例就會增大，谷 氨酸的產率就高?？赏ㄟ^選育琥珀酸敏感型突變株、不分 解利用乙酸突變株、異檸檬酸裂解酶活力降低菌株實現。 阻止谷

34、氨酸進一步代謝阻止谷氨酸進一步代謝（不代謝）（不代謝） 細胞還可以谷氨酸為前體繼續(xù)向下合成谷氨酰胺等，必 然導致谷氨酸的積累量減少。要避免谷氨酸被菌體利用， 還需要切斷谷氨酸向下的代謝途徑。 2.解除菌體自身的反饋調節(jié)解除菌體自身的反饋調節(jié) 選育耐高滲透壓突變株選育耐高滲透壓突變株 菌種高產谷氨酸,應具備在高 糖、高谷氨酸的培養(yǎng)基中能正常生長、代謝的能力，即在 高滲培養(yǎng)基中菌體的生長和谷氨酸的合成不受影響或影響 很小?？赏ㄟ^選育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖+高谷氨 酸突變株來實現。 選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調節(jié)的突變株選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調節(jié)的突變株 谷氨酸合成達到一定量時，

35、谷氨酸會反饋抑制和阻遏谷氨 酸脫氫酶，使谷氨酸的合成停止，使代謝轉向天冬氨酸的 合成。若解除了谷氨酸對谷氨酸脫氫酶的反饋調節(jié)，菌體 就會不斷的合成谷氨酸?？赏ㄟ^選育酮基丙二酸抗性、谷 氨酸結構類似物抗性（如谷氨酸氧肟酸鹽）、谷氨酰胺抗 性突變株來實現。 3.增加前體物的合成增加前體物的合成 選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到-酮戊二酸酮戊二酸 代謝的突變株代謝的突變株 這可通過選育檸檬酸合成酶活力強突 變株及抗氟乙酸、氟化鈉、重氮絲氨酸、檸檬酸抗 性等突變株來實現。 選育強化選育強化CO2固定反應的突變株固定反應的突變株 這可通過選育 以琥珀酸或蘋果酸為唯一碳源生長良

36、好的突變株、 氟丙酮酸敏感突變株以及丙酮酸或天冬氨酸缺陷突 變株來實現。 4.提高細胞膜的滲透性提高細胞膜的滲透性 選育抗選育抗Vp類衍生物突變株類衍生物突變株 選育抗Vp類衍生物，如香豆素、盧丁等突變株，都能遺傳 性的改變細胞膜的滲透性。 生物素缺陷株（生物素亞適量） 選育溶菌酶敏感突變株選育溶菌酶敏感突變株。 選育二氨基庚二酸缺陷突變株選育二氨基庚二酸缺陷突變株。 選育溫度敏感突變株選育溫度敏感突變株 谷氨酸溫度敏感突變株的突變位置是 在決定與谷氨酸分泌有密切關系的細胞膜結構基因上，發(fā)生堿 基的轉換或顛換，一個堿基為另一個堿基所置換，這樣為該基 因所指導的酶，在高溫下失活，導致細胞膜某些結

37、構的改變。 當控制培養(yǎng)溫度為最適生長溫度時，菌體正常生長；當溫度提 高到一定程度時，菌體便停止生長而大量產酸。 （5）油酸缺陷型（油酸亞適量） （6）甘油缺陷型（甘油亞適量） 5. 強化能量代謝強化能量代謝 谷氨酸高產菌的兩個顯著特點是:-酮戊二酸繼續(xù)向 下氧化的能力微弱和乙醛酸循環(huán)微弱，使能量代謝受 阻，TCA循環(huán)前一階段的代謝減慢。強化能量代謝可 彌補上述兩點不足，使TCA循環(huán)前一段代謝加強，谷 氨酸合成的速度加快。 選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株 如可選育丙二酸、 氧化丙二酸、氰化鉀、氰化鈉抗性突變株來實現。 選育選育ADP磷酸化抑制劑抗性突變株磷酸化抑制劑抗性突變

38、株 如可選育 2,4-二硝基酚、羥胺、砷、胍等抗性突變株來實現。 （3）選育抑制能量代謝的抗生素的抗性突變株選育抑制能量代謝的抗生素的抗性突變株 如 可選育纈氨霉素、寡霉素等抗性突變株來實現。 第六節(jié)、谷氨酸的生產工藝 w 我國與國外谷氨酸生產的現狀及存在問題 菌種的性能：我國產酸8.610，轉化率55； 日本1012，轉化率55。 工藝和過程控制：我國低糖和中糖發(fā)酵，日本 高糖發(fā)酵并流加、提高罐壓，保證溶氧。 對溫度、壓力、空氣流量、蛋白質、溶氧采用 計算機控制。 一、一、 谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng) （一）、谷氨酸生產菌的主要特征與菌學性質（一）、

39、谷氨酸生產菌的主要特征與菌學性質 現有谷氨酸生產菌主要是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小 桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細菌。 1.棒狀桿菌屬(Corynebacterium)：谷氨酸棒桿核菌 Cornebateium gho-tamlkns） 2.短桿菌屬(Brevibacterium)：黃色短桿菌（Bteuibaterun flavum） 、乳糖發(fā)酵短桿菌（Bra.lactofementum） 3.小桿菌屬(Microbacterium)：嗜氨小桿菌（Micrbaterium ammoniaphilmn） 4.節(jié)桿菌屬(Arthrobacterium) 菌種形態(tài)G屬性呼吸類型碳源基質 棒狀桿菌屬直或微彎，一

40、端膨大。 折斷分裂呈八字排列 或枷狀排列，不運動 G好氧或厭 氧 葡萄糖發(fā)酵 產酸，少數 利用乳糖產 酸 短桿菌屬短的不分支直桿菌， 多數不運動，少數運 動有鞭毛。 G好氧葡萄糖發(fā)酵 產酸 小桿菌屬桿狀，形態(tài)與排列與 棒狀桿菌相似 G好氧發(fā)酵糖產酸 弱，主要產 乳酸，不產 氣 節(jié)桿菌屬培養(yǎng)過程細胞形態(tài)易 變化，先由球菌變桿 菌，隨后由桿菌變球 菌，不運動 G變G ，后 由G變 G 好氧發(fā)酵糖產酸 極少或不產 酸。 表1 谷氨酸發(fā)酵微生物特征及菌學比較 （二）、谷氨酸生產菌形態(tài)與生理的共同特征 w 細胞形態(tài)為球形、棒形以至短桿形。 w 革蘭氏染色陽性，無芽孢、無鞭毛、不運動 w 都是需氧形微生物

41、，在通氣條件下才能產生谷氨酸。 w 都是生物素缺陷型，需要生物素作為生長因子 w 脲酶強陽性 w 不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白及明膠 w 發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯形態(tài)變化和細胞滲透性的變化 w CO2固定反應酶系活力強，異檸檬酸裂解酶活力欠缺或 微弱、乙醛酸循環(huán)弱， -酮戊二酸氧化能力缺失或 微弱；檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶以 及谷氨酸脫氫酶活力強，還原性輔酶進入呼吸鏈 w 具有向環(huán)境中泄漏谷氨酸的能力 w 不分解利用谷氨酸，能耐受高濃度的谷氨酸，產量在 5以上。 （三）、（三）、 國內谷氨酸生產菌及其比較國內谷氨酸生產菌及其比較 1、北京棒桿菌、北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生

42、理特征的形態(tài)和生理特征 2、鈍齒棒桿菌、鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征的形態(tài)和生理特征 3、天津短桿菌、天津短桿菌(T6-13)的形態(tài)和生理特征的形態(tài)和生理特征 4、北京棒桿菌、北京棒桿菌(7338)與鈍齒棒桿菌與鈍齒棒桿菌(B9)的比較的比較 5、天津短桿菌、天津短桿菌(T6-13)與鈍齒桿菌與鈍齒桿菌(B9)的比較的比較 6、目前味精行業(yè)采用的主要菌株、目前味精行業(yè)采用的主要菌株 S9114 華南理工大學 FD415 上海復旦大學 TG961 天津科技大學 二、二、 谷氨酸生產菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化谷氨酸生產菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化 1、種子的菌體形態(tài)、種子的菌體形態(tài) 斜面和

43、一、二級種子培養(yǎng)在不同培養(yǎng)條件下斜面和一、二級種子培養(yǎng)在不同培養(yǎng)條件下，細胞形態(tài)基本相似。斜面細胞形態(tài)基本相似。斜面 培養(yǎng)的菌體較細小培養(yǎng)的菌體較細小，一、二級種子比斜面菌體大而粗壯一、二級種子比斜面菌體大而粗壯，革蘭氏染色深。多革蘭氏染色深。多 為短桿至棒桿狀為短桿至棒桿狀，有的微呈彎曲狀有的微呈彎曲狀，兩端鈍圓兩端鈍圓，無分枝無分枝；細胞排列呈單個、細胞排列呈單個、 成對及成對及“V”字形字形，有柵狀或不規(guī)則聚塊有柵狀或不規(guī)則聚塊；分裂的細胞大小為分裂的細胞大小為0.70.9*1.0 3.4um。由于生物素充足。由于生物素充足，繁殖的菌體細胞均為谷氨酸非積累型細胞。繁殖的菌體細胞均為谷氨酸

44、非積累型細胞。 2、谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)、谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài) 從谷氨酸發(fā)酵中菌體形態(tài)的變化來看從谷氨酸發(fā)酵中菌體形態(tài)的變化來看，大致可以分為大致可以分為長菌型細胞長菌型細胞、轉移轉移 期細胞期細胞和產酸型細胞和產酸型細胞3種不同時期的細胞形態(tài)種不同時期的細胞形態(tài). 3、谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài)、谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài) 發(fā)酵前期感染噬菌體后發(fā)酵前期感染噬菌體后，菌體細胞明顯減少菌體細胞明顯減少，細胞不規(guī)則細胞不規(guī)則，發(fā)圓、發(fā)胖發(fā)圓、發(fā)胖, 缺乏缺乏“”字形排列字形排列，有明顯的細胞碎片有明顯的細胞碎片，嚴重時出現拉絲、拉網嚴重時出現拉絲、拉網，互相堆互相堆 在

45、一起在一起，幾乎找不到完整的菌體細胞幾乎找不到完整的菌體細胞，類似蛛網或魚翅狀。類似蛛網或魚翅狀。 在發(fā)酵中、后期感染噬菌體后在發(fā)酵中、后期感染噬菌體后，菌體細胞形態(tài)不規(guī)則菌體細胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊邊緣不整齊，有有 的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西，有細胞碎片有細胞碎片 。 谷氨酸發(fā)酵過程中菌體形態(tài)變化及代謝特征 發(fā)酵時 間/h 細胞類型細胞形態(tài)特征代謝特點 08長菌形細 胞 菌體形態(tài)與種子相似，短桿、 棒形、橢圓形，單個、成對， 八字形，絕大多數為V形分裂 耗糖加快，代謝旺 盛，溫度上升，產 生CO2，菌體不產 酸 816轉移期細 胞 細胞開始伸長、膨大，細胞邊

46、緣不完整、邊緣褶皺，細胞形 態(tài)急劇變化，由長菌形細胞轉 化成產酸形細胞 生物素含量由“豐 富轉向貧乏”通風 量達到最大值，OD 達到最大值并穩(wěn)定， 放熱也達到最大值， 菌體開始產酸 1630產酸期細 胞 細胞形態(tài)幾乎都伸長、膨大， 伸長拉大24倍，不規(guī)則，缺 乏八字形排列 大量積累谷氨酸， 耗糖、好氨與產酸 相適應，風量逐漸 下降 三、三、 菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質量要求菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質量要求 斜面菌種斜面菌種一級種子培養(yǎng)一級種子培養(yǎng) 二級種子培養(yǎng)二級種子培養(yǎng) 發(fā)酵罐發(fā)酵罐 1. 種子培養(yǎng)過程種子培養(yǎng)過程 菌種：菌種鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘變株。 生長特點：糖質原料，需氧，以生物

47、素為生長因子。 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0- 7.2瓊脂培養(yǎng)基，32培養(yǎng)18-24h。 一級種子培養(yǎng)：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二 鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH6.5-6.8。 1000ml三角瓶裝量200250ml，震蕩，32，培養(yǎng)12h。 二級種子培養(yǎng)：用種子罐培養(yǎng)，料液量為發(fā)酵灌投料 體積的1，用水解糖代替葡萄糖，于32進行通氣攪 拌710h。 2、種子質量要求、種子質量要求 w 一級種子質量標準：一級種子為搖瓶種子。 質量要求： 顯微鏡檢查，無雜菌，菌體粗壯、均勻、排列整齊 涂平板檢查無雜菌、無噬菌斑 OD值凈增0.6左右。 種子營養(yǎng)液pH在6.7左

48、右 種子營養(yǎng)液殘?zhí)窃?.5%以下。 w 二級種子質量標準：二級種子為生產車間的種子罐中培養(yǎng)二級種子質量標準：二級種子為生產車間的種子罐中培養(yǎng) 的。對其質量要求的。對其質量要求 平板檢查無雜菌、無噬菌體污染，菌體大小均一，呈單個或八字 排列。 活菌數108109/ml。 pH在7.2左右， 殘?zhí)呛吭?.5左右。 其它各項指標與一級種子相同。 w 種齡和種量的控制 一級種子控制在11-12h，二級控制在7-8h。 種量為1。過多，菌體嬌嫩，不強壯，提前衰老自溶，后期產酸 量不高。 四、谷氨酸的生產工藝 磷酸鹽、玉米漿、鎂鹽等 分過濾器 發(fā)酵灌 調和 配料 預處理 （水解） 發(fā)酵培養(yǎng)基 調pH 連

49、消 菌種罐 粗谷氨酸 中和 搖瓶菌種 原料 種子培養(yǎng)基 空氣斜面 尿素貯罐 空氣凈化系統(tǒng) 脫色 結晶 濃縮 成品味精 （一）、（一）、 谷氨酸發(fā)酵工藝流程谷氨酸發(fā)酵工藝流程 淀粉 葡萄糖 糖蜜 稀釋蜜 配 料 種子罐 玉米漿 糖 蜜 磷酸二氫鉀 硫酸鎂 無菌空氣 Fe2+ 、 Mn2+ NH3 菌種 發(fā)酵罐 等電提取 中 和 除 鐵 脫 色濃縮、結晶離 心干 燥 味味 精精 發(fā)酵罐 Na2CO3 （二）、原料的預處理 1.淀粉水解糖的制備：酸水解或酶水解淀粉水解糖的制備：酸水解或酶水解 酸水解法 調漿：干淀粉用水調成10-110Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8至 pH1.5。 糖化：蒸汽加熱

50、，加壓糖化25min。冷卻至80下中和。 中和：燒堿中和，至pH4.0-5.0 脫色：活性炭脫色和脫色樹脂?；钚蕴坑昧繛?.6-0.8，在70及 酸性條件下攪拌后過濾。 酶法：以大米或碎米為原料時采用 調漿配料：大米進行浸泡磨漿，將淀粉乳調成1520B，用 Na2CO3調pH6.4-6.5，用CaCl2調節(jié)漿中的Ca2+至50mg/L。加細菌 a-淀粉酶（1012u/g，干淀粉計算)。 噴射液化：一次噴射溫度100105，層流罐維持95100，液 化時間1h。典色反應棕紅色。液化液經二次噴射，維持溫度130 140，滅酶510min，再經板式換熱器冷卻至70以下，進入糖 化罐。 糖化：糖化溫度

51、60 1，pH4.0-4.4；糖化酶（100120u/g，干 淀粉計算)糖化 過濾：糖液先用Na2CO3水溶液調pH4.8-5.0，過濾。 糖化液的質量要求 色澤 淡黃色透明液 糊精反應 無 還原糖含量 2528 DE值 9598 透光率 60 pH 4.6-5.0 淀粉轉化率 9598 糖蜜原料：不宜直接用來作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因 含豐富的生物素。 預處理方法：活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附 或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐 溫60或添加青霉素。 (三三)、谷氨酸發(fā)酵控制、谷氨酸發(fā)酵控制 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基 1、碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、

52、麥芽糖 作用：作用：菌體生長繁殖；新陳代謝的能源；產生菌體生長繁殖；新陳代謝的能源；產生a-硐硐 戊二酸轉化為谷氨酸戊二酸轉化為谷氨酸 低中糖發(fā)酵：初始糖濃度低中糖發(fā)酵：初始糖濃度12.5-13%. 中高糖發(fā)酵：中高糖發(fā)酵：初始糖濃度初始糖濃度14-16%。 補糖發(fā)酵：初始糖濃度補糖發(fā)酵：初始糖濃度12-13%，中后期補糖，中后期補糖2-4。 目前，較多采用低糖濃度流加發(fā)酵控制。碳源濃 度過高時，對菌體生長不利，氨基酸的轉化率降低。 2、氮源： 無機氮源: (1)尿素 (2)液氨 (3)碳酸氫銨； 有機氮源:玉米漿、麩皮水 解液、豆餅水解液和糖蜜等。 作用：是合成菌體、蛋白質、核酸等含氮物質和

53、合成氨基酸來 源氮源；調節(jié)pH 尿素滅菌時形成磷酸銨鎂鹽，須單獨滅菌，分批流加。 氨水用pH自動控制連續(xù)流加 C:N，谷氨酸發(fā)酵所需比為100：1521 3、無機鹽：、無機鹽： 磷酸鹽、 硫酸鎂 、 鉀鹽、 微量元素 作用：構成細胞成分，酶的組成成分；激活或抑制酶活性； 調節(jié)培養(yǎng)基滲透壓；調節(jié)培養(yǎng)基的pH；調節(jié)培養(yǎng)基的氧化 還原電位。 磷酸鹽：對發(fā)酵有顯著影響，不足時糖代謝受抑制?？刂圃?0.005-0.01mol/L 硫酸鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑， 促進葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。G要求鎂離子濃度最低 25ug/L；G-要求4-6 ug/L。 鉀鹽：鉀鹽多，有利于產酸

54、；鉀鹽少，有利于菌體生長 微量元素：主要是錳（許多酶的激活劑）、鐵（細胞色素、 細胞色素氧化酶和過氧化氫酶活性基團組分，可促進谷氨酸 產生菌的生長），10-610-4mol/L。嚴格控制銅、汞含量， 以免對發(fā)酵產生毒害作用。 4、生長因子：主要參與細胞膜的代謝，進而、生長因子：主要參與細胞膜的代謝，進而 影響膜的透性。影響膜的透性。 (1) 生物素（25ug/ml ）(2) 維生素B1 生物素：乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物 合成，影響磷酯的合成。 當磷酯含量減少到正常時的一半左右時，細胞 發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內滲出，積累于發(fā) 酵液中。 生物素過量，則發(fā)酵過程菌體大量繁殖，不產 或少產

55、谷氨酸，你謝產物中乳酸和琥珀酸明顯 增多。當生物素缺乏時，菌種生長緩慢。因此， 一般將生物素控制在亞適量條件下，才能得到一般將生物素控制在亞適量條件下，才能得到 高產量的谷氨酸。高產量的谷氨酸。 成 分 菌種 AS-1.299AS-1.542B9D110 糖12.512.51015 玉米漿 0.50.70.50.70.3 磷酸氫二鈉0.170.170.160.35 硫酸鎂 0.060.070.070.06 Fe2 、Mn2 初 尿1.82.01.01.03.4 流加尿 11.21.82.21.82.2 pH7.07.06.86.7 表41 不同生產菌谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方 （四）（四） 谷氨酸發(fā)

56、酵工藝控制谷氨酸發(fā)酵工藝控制 1、 溫度對谷氨酸發(fā)酵的影響溫度對谷氨酸發(fā)酵的影響 微生物在一定條件下，都有一個最適的生長溫度范圍。谷 氨酸產生菌的最適生長溫度為3032，產生谷氨酸的最適為 3437。菌體生長期溫度過高,易造成菌體衰老。生產上表 現為OD值增長慢，pH值高，耗糖慢，發(fā)酵周期長，谷氨酸生 成少。在發(fā)酵中、后期，菌體生長基本停止，適當提高溫度可 促進產生谷氨酸。因此根據菌種特點，溫度采用二級或三級管 理。即發(fā)酵前期控制在30-32；中、后期34-37。 菌種AS-1.299617AS-1.542T6-13 生長溫度3032303432343236 發(fā)酵溫度 343436343636

57、38 表42 菌谷氨酸產生菌的培養(yǎng)溫度 發(fā)酵階段發(fā)酵前期發(fā)酵中、后期 pH控制7.57.27.4 2、 pH對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 w 作用機理：主要影響酶的活性和菌的代謝。 w 控制pH方法：流加尿素和氨水 w 流加方式：根據菌體生長、pH變化、糖耗情況和 發(fā)酵階段等因素決定 w 控制： （1）菌體生長或耗糖慢時，少量多次流加尿素，避 免pH過高 （2）菌體生長或耗糖過快時，流加尿素可多些，以 抑制菌體生長。 （3）發(fā)酵后期，殘?zhí)巧?，接近放罐時，少加或不加 尿素，以免造成氨基酸提取困難。 （4）氨水對pH影響大，應采取連續(xù)流加。 3、 供氧對谷氨酸發(fā)酵的影響供氧對谷氨酸發(fā)酵的影響 溶解氧

58、的控制：溶解氧的控制：大小是由大小是由通風通風與與攪拌攪拌兩方面決定的，與攪兩方面決定的，與攪 拌器的型式、直徑大小、攪拌轉速、攪拌器在發(fā)酵罐內的相對拌器的型式、直徑大小、攪拌轉速、攪拌器在發(fā)酵罐內的相對 位置因素等有關。一般攪拌器直徑大，轉速快，溶氧系數大。位置因素等有關。一般攪拌器直徑大，轉速快，溶氧系數大。 所以，增大攪拌轉速比增加通風量對溶氧系數提高更為顯著。所以，增大攪拌轉速比增加通風量對溶氧系數提高更為顯著。 具體操作：具體操作： 發(fā)酵前期，以低通風量為宜；發(fā)酵前期，以低通風量為宜； 發(fā)酵中、后期，以高通風量為好。發(fā)酵中、后期，以高通風量為好。 當培養(yǎng)基濃度高、營養(yǎng)豐富、生物素用量

59、大時，應采用高當培養(yǎng)基濃度高、營養(yǎng)豐富、生物素用量大時，應采用高 通風量。當菌體生長緩慢、通風量。當菌體生長緩慢、pHpH偏高時，應減少通風量，或停止偏高時，應減少通風量，或停止 攪拌，以利于長菌。當菌體生長快、耗糖快時，應提高通風量，攪拌，以利于長菌。當菌體生長快、耗糖快時，應提高通風量， 以抑制生長和滿足合成谷氨酸所必須的足夠能量。以抑制生長和滿足合成谷氨酸所必須的足夠能量。 項目 發(fā)酵罐容積 10 m320 m350 m3 攪拌轉速（r/min）160140110 通風比（m3/ m3min） 1:0.160.171:0.151:0 .12 具體風量：前期1:0.12（V/V)；中期1:

60、0.22-0.26；后期1:0.15-0.18 發(fā)酵通風量的控制 4、 泡沫的消除泡沫的消除 （1）泡沫的形成和性質 攪拌與通風 發(fā)酵液中含有蛋白胨、玉米漿、黃豆粉是主要的發(fā)泡劑。 發(fā)酵液感染雜菌和噬菌體 （2）泡沫對發(fā)酵的影響 發(fā)酵灌的裝料系數減少 氧傳遞系數減少 發(fā)酵液逃液，增加染菌機會 （3）泡沫的消除（控制） w 調整培養(yǎng)基的成分（少加或緩加宜起泡的原材 料）；改變某些物理化學參數（pH、溫度、通氣 和攪拌；改變發(fā)酵工藝 w 采用機械消泡或消泡劑消泡 機械消泡：利用機械振動或壓力變化使泡沫破 裂 消泡劑：屬表面活性劑，天然油脂（豆油、玉 米油）；脂肪酸和酯類；聚醚類（氧化丙烯和 氧化乙