HPV病毒的常用通用引物檢測(cè)

1、hpv病毒的常用通用引物檢測(cè)摘要研究表明，hpv病毒感染與人體多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)。對(duì)感染個(gè)體的病毒檢測(cè)具有重要的疾病診斷、治療、預(yù)防意義。但目前缺乏可以兼顧敏感性、特異性、操作簡(jiǎn)單，可以大規(guī)模推廣使用的可靠檢測(cè)方法。對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行pcr檢測(cè)仍是目前實(shí)驗(yàn)室最多采用的檢測(cè)方法。pcr具有高敏感、易操作的優(yōu)點(diǎn)，但其反應(yīng)的靈活性和極高的敏感性，也帶來了假陽性和假陰性的問題。針對(duì)hpv病毒l1序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)的通用引物檢測(cè)，最常被應(yīng)用于大樣本檢測(cè)。通用引物可以在一次pcr反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種型別的hpv病毒感染，與序列特異pcr檢測(cè)相比，可以大大減少檢測(cè)的工作量。但其缺點(diǎn)在于，通用引物僅與某個(gè)或少數(shù)hpv

2、型序列匹配，而對(duì)于多數(shù)型別hpv，引物結(jié)合區(qū)都存在或多或少的堿基錯(cuò)配。這使得通用引物對(duì)不同型別的hpv擴(kuò)增效率不同。因此，使用通用引物檢測(cè)hpv感染時(shí)，對(duì)于某些與引物匹配較差的hpv型別，其感染情況往往可能被低估。目前常用的通用引物根據(jù)設(shè)計(jì)原則不同分為三類：1）單一引物如：gp5+/6+。2）簡(jiǎn)并引物如：、my09/11。3）混合引物如：spf1/2。個(gè)型通用引物都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)特定試驗(yàn)的目的、條件選用合適的通用引物進(jìn)行檢測(cè)?！娟P(guān)鍵詞】 hpv病毒；通用引物；單一引物；簡(jiǎn)并引物；混合引物hpv病毒是一種親上皮細(xì)胞的雙鏈dna病毒，其基因組長(zhǎng)約7900bp。目前約共發(fā)現(xiàn)約200多型h

3、pv病毒。該病毒主要感染皮膚和粘膜的上皮細(xì)胞，造成上皮增生甚至惡性轉(zhuǎn)化1 2 3。人們已經(jīng)在生殖道檢測(cè)到超過40型的hpv，其中許多與宮頸內(nèi)皮增生及宮頸癌密切相關(guān)，如：16、18、31、33、35等，這部分hpv病毒被稱為高危型45。而hpv6、11等型別主要存在于良性病變中，多造成生殖道疣等疾病，被稱為低危型67。但人為區(qū)分的高危型和低危型并不是絕對(duì)的，因?yàn)樵谝恍┌┳冎写_實(shí)也存在所謂的低危型hpv8 。多數(shù)hpv病毒對(duì)人體的感染都是一過性的，病毒很快會(huì)被人體免疫系統(tǒng)清除。但少數(shù)情況下，病毒整合入宿主基因組dna，轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)感染9。這種感染方式被認(rèn)為與感染部位的惡性病變相關(guān)10。接近100的宮

4、頸癌樣本中都可以檢測(cè)到hpv病毒的存在11 12。據(jù)估計(jì)，每年約290,000人死于宮頸癌。同時(shí)每年有490,000例新發(fā)宮頸癌病例13。因此，對(duì)hpv病毒有效的檢測(cè)方法，將具有重要的臨床和社會(huì)意義。目前，hpv病毒尚不能人工體外培養(yǎng)，而hpv的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)也不成熟。因此，對(duì)hpv感染的檢測(cè)方法仍然局限于使用分子生物學(xué)的方法在待測(cè)樣本中直接檢測(cè)，如：原位雜交、液相雜交（雜交捕獲技術(shù)）等14 15 16 17 18。但是這些方法不但操作復(fù)雜，而且敏感性有限。hpv病毒的pcr檢測(cè)雖然具備操作簡(jiǎn)單、高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但污染嚴(yán)重、容易產(chǎn)生假陽性，因此無法推廣到臨床應(yīng)用。目前尚缺乏一種能克服上述所有缺

5、點(diǎn)，同時(shí)保持各自優(yōu)點(diǎn)的成熟檢測(cè)方式。對(duì)于具有嚴(yán)格的污染控制，同時(shí)需要高敏感、大樣本的檢測(cè)hpv病毒的實(shí)驗(yàn)室，使用pcr檢測(cè)仍是首選方案。但是鑒于hpv存在如此多的類型，對(duì)每一型都使用其特異引物進(jìn)行pcr檢測(cè)將是十分巨大量的工作。同時(shí)，序列特異pcr只能擴(kuò)增序列已知的hpv。對(duì)于未知hpv型或存在變異的hpv則不能有效擴(kuò)增檢測(cè)。因此，人們選取hpv基因組序列中較為保守的l1和e1基因區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，以實(shí)現(xiàn)在單一pcr反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種型別hpv的目的19 20 21。本文對(duì)目前常用的hpv通用引物進(jìn)行了綜述，在各自引物的序列分析基礎(chǔ)上，對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了闡述。一、hpv病毒的pcr通用引物檢測(cè)通

6、常，通用引物的設(shè)計(jì)遵循三條原則：1）上下有引物均為惟一序列，通用引物只與某一型或少數(shù)幾型hpv擴(kuò)增序列完全匹配。在多數(shù)hpv型的引物結(jié)合區(qū)域，通用引物均存在或多或少的堿基錯(cuò)配。使用該種類型的通用引物，應(yīng)當(dāng)使用較低的煺火溫度，以保證引物可以與存在堿基錯(cuò)配的hpv型結(jié)合。這種通用引物的代表為gp5+/6+22 23。2）通用引物由一系列簡(jiǎn)并引物混合而成，這些引物的某些特定位點(diǎn)隨機(jī)出現(xiàn)兩到三種不同的堿基，通過這種方法來彌補(bǔ)不同型別hpv在這些位點(diǎn)的序列差異。簡(jiǎn)并引物的代表為my09/1124。3）通用引物的上下游均由一系列不同的引物混合構(gòu)成，這些引物充分考慮了各型hpv在特定位點(diǎn)的序列差異，在混合引

7、物中，盡量存在與各型hpv均達(dá)到堿基完全配對(duì)的引物。對(duì)于某些多數(shù)hpv都在此處存在較大的序列差異的位點(diǎn)，這種通用引物在此位點(diǎn)引入肌苷來替代常規(guī)的堿基。這一位點(diǎn)的肌苷雖然不能與模板序列形成共價(jià)配對(duì)，但也不致形成空泡。這種通用引物與各型hpv堿基配對(duì)都較好，因此可以采用較嚴(yán)格的pcr條件。其檢測(cè)效率和敏感性也較高。代表引物為spf1/225。各種類型的通用引物都存在其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，本文將分別代表性的介紹這三種通用引物。1gp5/6、gp11/12及gp5+/6+通用引物圖1：gp5/6、gp11/12引物序列及其與9型hpv病毒的匹配情況小點(diǎn)表示各型hpv序列與引物序列相同，各型hpv序列與引物序

8、列的差異用相應(yīng)堿基字母標(biāo)出gp5/6和gp11/12通用引物由peter j. f. snijders等于1990年發(fā)表，其目的是開發(fā)一種可以方便、敏感的hpv廣譜檢測(cè)方法26。這兩對(duì)通用引物都擴(kuò)增hpv l1基因的一段保守序列。其中，gp5/6針對(duì)感染生殖道的hpv類型如：hpv6b、16、18、33型，gp11/12針對(duì)感染皮膚的hpv類型如：1a、5、8型等。與以往的序列特異引物相比，gp5/6和gp11/12通用引物在大規(guī)模檢測(cè)hpv病毒時(shí)具有較顯著的優(yōu)勢(shì)。它實(shí)現(xiàn)了高通量檢測(cè)，只需通過一次pcr反應(yīng)，就可以擴(kuò)增樣本中的多種不同類型hpv病毒。雖然該引物只與少數(shù)幾型hpv病毒序列完全匹配

9、，多數(shù)型別的hpv病毒在引物結(jié)合區(qū)都存在堿基錯(cuò)配，但作者的研究證實(shí)，當(dāng)錯(cuò)配在三個(gè)以下時(shí)，并不會(huì)顯著影響pcr的擴(kuò)增效率。不可否認(rèn)，使用該通用引物擴(kuò)增hpv病毒序列存在許多局限性。首先，由于錯(cuò)配序列的存在，引物與模板的結(jié)合勢(shì)必受到影響，這將大大降低pcr擴(kuò)增的效率。因此，使用這兩對(duì)通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，常常需要使用與平常不同的pcr反應(yīng)條件。作者推薦了40度的退火溫度及3.5 到10 mm的mg離子濃度。在這種情況下，尤其是擴(kuò)增模板的拷貝數(shù)較低時(shí)，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物往往會(huì)產(chǎn)生許多非特異條帶，影響研究人員對(duì)結(jié)果的判斷。對(duì)于包含較多非特異條帶的pcr產(chǎn)物分析，作者推薦使用south blot雜交的方

10、式進(jìn)行。其次，在作者發(fā)表這兩對(duì)引物時(shí)，僅有9種類型的hpv病毒序列得到測(cè)定，現(xiàn)在已知的多數(shù)hpv病毒類型的序列仍然處于未知狀態(tài)。因此，作者設(shè)計(jì)gp5/6和gp11/12時(shí)可用的hpv病毒序列信息是有限的，不可避免存在較大的改進(jìn)空間。雖然具有局限性，但這兩對(duì)通用引物尤其是gp5/6及其衍生物仍然是十分成功的，因?yàn)樗^早的實(shí)現(xiàn)了高通量hpv病毒檢測(cè)27。圖2：gp5+/6+引物序列及其與23型hpv病毒的匹配情況小點(diǎn)表示各型hpv序列與引物序列相同，各型hpv序列與引物序列的差異用相應(yīng)堿基字母標(biāo)出對(duì)通用引物gp5/6的序列分析，發(fā)現(xiàn)hpv病毒序列的引物結(jié)合區(qū)域向3端延伸仍然存在數(shù)個(gè)堿基的保守序列。

11、據(jù)此，ana-maria de roda husman等通過對(duì)gp5/6通用引物的改進(jìn)發(fā)展了新的通用引物，稱為gp5+/6+28。由于引物結(jié)合區(qū)域配對(duì)堿基序列比gp5/6多，gp5+/6+具有相對(duì)較高的特異度和敏感度。在對(duì)22例克隆的hpv病毒序列擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，gp5+/6+的敏感度比gp5/6高10到100倍。并且在對(duì)pcr產(chǎn)物的電泳分析發(fā)現(xiàn)，gp5+/6+產(chǎn)物的特異度好，雜帶少。gp5+/6+通用引物的檢測(cè)敏感性仍然與引物結(jié)合區(qū)域的堿基匹配程度相關(guān)。當(dāng)gp5+/6+引物與模板匹配較好時(shí)，可以檢測(cè)到飛克（femtogram）水平的病毒序列，而當(dāng)其中一個(gè)引物或引物對(duì)與模板存在4個(gè)或更多堿基錯(cuò)配時(shí)

12、，只可以檢測(cè)到皮克（picogram）水平。將gp5引物向3端延伸三個(gè)堿基，有tac或cac兩種選擇（如圖2所示）。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇cac序列時(shí)，引物內(nèi)部容易形成六個(gè)堿基的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)會(huì)促使引物二聚體的形成，反而使檢測(cè)敏感性下降。選擇tac序列則不會(huì)出現(xiàn)此情況。與此相同，gp6引物向3端延申有兩種選擇（5tactc 3或5tattc 3 ），根據(jù)同樣原因而選擇了5 tactc 3序列。雖然gp6+引物的3端仍然存在3個(gè)堿基的保守序列，但研究者并沒有繼續(xù)向外延伸，因?yàn)槟菢訉?huì)使兩條引物的tm值相差過大。并且，引物過長(zhǎng)，必然需要提高pcr反應(yīng)的煺火溫度，這也不利于與引物存在較多剪輯錯(cuò)配的h

13、pv型的檢測(cè)。雖然比起gp5/6來說，gp5+/6+引物在多數(shù) hpv型中都引入了一個(gè)或更多的堿基錯(cuò)配，但是這對(duì)引物總體上提高了引物與模板的結(jié)合能力，使用這對(duì)引物進(jìn)行pcr反應(yīng)可以獲得更好的特異性和敏感性。研究人員對(duì)gp引物的改進(jìn)，并沒有局限在序列的優(yōu)化方面。mark f evans等發(fā)展了遞減pcr （touchdown pcr）的方法來獲得更敏感及更特異的pcr擴(kuò)增29。遞減pcr通過在pcr 的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)緊的退火條件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的tm 高大約5的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1到2，直到退火溫度低于tm 5。因此，在反應(yīng)的前幾個(gè)循環(huán)，特異性最高的目的片段會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增

14、，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。這樣就允許后續(xù)循環(huán)中使用較低的煺火溫度而不至于影響反應(yīng)的特異性。遞減pcr可以很好的擴(kuò)增模板很少的樣本以及與通用引物序列結(jié)合區(qū)域存在較多錯(cuò)配的hpv類型。在作者發(fā)表的論文中，使用touchdown pcr檢測(cè)宮頸癌樣本比經(jīng)典的gp5+/6+ pcr條件發(fā)現(xiàn)了更高的陽性率和更多的感染型別。另外，經(jīng)典的gp5+/6+ pcr條件檢測(cè)26例乳腺癌樣本的陽性率為19，而使用touchdown pcr檢測(cè)的陽性率為58。通過對(duì)宮頸脫落細(xì)胞樣本檢測(cè)研究表明，使用gp5+/6+ 進(jìn)行pcr后，產(chǎn)物凝膠電泳分析時(shí)的敏感性比gp5/6提高11。如果使用混合探針對(duì)pcr產(chǎn)

15、物進(jìn)行雜交分析，敏感性提高4。但是，在gp5+/6+陽性而gp5/6陰性的樣本中，不包括六種在宮頸中常見的hpv類型。這是因?yàn)檫@些hpv型的引物區(qū)序列本生就與引物匹配性很好，引物的修改沒有顯著的增加其擴(kuò)增效率。gp5+/6+雖然具有較高的擴(kuò)增效率，也仍然存在一些缺陷，如對(duì)hpv52一種常見的宮頸高危hpv擴(kuò)增效率不高30。但作為一種成功的通用引物，gp5+/6+對(duì)于大規(guī)模人群篩查，及多種類型hpv感染，hpv多重感染樣本的檢測(cè)具有意義31。圖3：gp5+/6+的普通pcr條件和touchdown pcr反應(yīng)條件比較2、my09/11/hmb01及pgmy09/11通用引物圖4：my09/11/

16、hmb01引物序列及其與18型hpv病毒的匹配情況 小點(diǎn)表示各型hpv序列與引物序列相同，各型hpv序列與引物序列的差異用相應(yīng)堿基字母標(biāo)出簡(jiǎn)并堿基表示如下：m a 或 c, w a或t, yc 或 t, r a或 gmy09/my11由manos等于1990年最早發(fā)表24。當(dāng)時(shí)，僅有hpv6、11、16、18、33五種病毒序列被研究人員完全掌握。所以基于這五種hpv病毒序列，人們選擇了l1基因的一段保守序列設(shè)計(jì)通用引物，并希望該引物可以通過一次pcr過程同時(shí)擴(kuò)增出這五型hpv病毒。為了推廣應(yīng)用該引物，研究人員假定其他序列沒有完全知道的hpv病毒基因序列在這一段也是保守的，同樣適用于該引物擴(kuò)增。

17、事實(shí)上，my09/my11引物只與hpv6型的引物結(jié)合區(qū)域序列完全匹配，其它幾型都存在在一些堿基位點(diǎn)的序列差異。為了使引物能夠更好的與存在序列差異的結(jié)合區(qū)煺火，該引物的設(shè)計(jì)者采用了簡(jiǎn)并堿基的方式。因此，my09/my11是由24條序列存在差異的不同引物混合而成的。事實(shí)證明，my09/my11是十分成功的通用引物32 33。它可以有效擴(kuò)增超過30型的生殖道hpv病毒。my09/my11擴(kuò)增約450bp長(zhǎng)的片段，可以為研究人員提供較多的病毒序列信息34 35 36。但是作為簡(jiǎn)并引物，my09/my11的缺點(diǎn)也很明顯的。簡(jiǎn)并引物的合成需要在引物序列的特定位點(diǎn)隨機(jī)插入兩到三種不同的堿基，這一過程是不可

18、控制的，導(dǎo)致人們無法保證在混合引物中每一種特定的引物序列都能夠以相同的幾率出現(xiàn)。因此，不同批次合成的my09/my11實(shí)際存在差異，而這種差異往往導(dǎo)致不同批次合成的引物對(duì)相同樣本中病毒的擴(kuò)增也會(huì)出現(xiàn)效率不同的問題。這種缺點(diǎn)對(duì)于需要擴(kuò)增條件穩(wěn)定、試驗(yàn)結(jié)果均一、的大樣本病毒感染率檢測(cè)是十分不利的。圖5：pgmy09/11引物組成pgmy09i和pgmy09p 5端刪除兩個(gè)堿基，避免引物出現(xiàn)內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)，影響pcr擴(kuò)增。hmb01 設(shè)計(jì)針對(duì)hpv51型，此型病毒為高危型，并且pgmy引物不能有效擴(kuò)增。p. e. gravitt等針對(duì)my09/11的缺點(diǎn)進(jìn)行了改進(jìn)，于2000年發(fā)表了pgmy09/11

19、通用引物37。pgmy通用引物的引物結(jié)合區(qū)域與my09/11相同。但該引物不使用簡(jiǎn)并引物，而使用了與spf1/2相似的混合引物。研究人員通過序列分析，將已知的hpv病毒序列根據(jù)my09/11引物結(jié)合區(qū)域相似性分組，再根據(jù)每組的序列匹配性，設(shè)計(jì)了由5條序列組成的pgmy11，及由13條序列組成的pgmy09。pgmy09/11避免了使用簡(jiǎn)并引物，混合引物中每條引物都是單獨(dú)合成并以相同的比例摻入到混合引物池中。pgmy09/11通用引物保證了每條引物都能以固定比例存在，從而確保了不同批次合成引物的均一性。在一項(xiàng)研究中，科研人員使用my09/11和pgmy09/11分別檢測(cè)了262例宮頸脫落細(xì)胞樣本

20、。38結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pgmy09/11的陽性樣本比my09/11多20例（62.8%：55.1%）。同時(shí)，pgmy09/11的多重感染檢測(cè)率也比my09/11高（40.0%： 33.8%）。hpv 26, 35, 42, 45, 52, 54, 55, 59, 66, 73,和mm7 型使用pgmy09/11的檢測(cè)率比my09/11高25%。所以，pgmy09/11引物提供了一種比my09/11更加敏感、特異的檢測(cè)方法39 40 41 423、spf1/2通用引物圖6：spf1/2引物及探針組成 i代表次黃嘌呤核苷（inosine）圖7：spf1/2引物結(jié)合區(qū)域38型hpv病毒的堿基位點(diǎn)差異以hp

21、v16型為代表，小點(diǎn)表示各型hpv序列與其序列相同，各型hpv序列與hpv16型序列的差異用相應(yīng)堿基字母標(biāo)出由于現(xiàn)存的通用引敏感性較低、包括的hpv類型局限等問題，bernhard kleter等于1998年發(fā)表了spf1/2通用引物25。希望開發(fā)一種敏感性高、檢測(cè)類型廣譜的通用引物。spf1/2同樣擴(kuò)增l1基因的一段保守序列。其上游引物位于gp5+引物的結(jié)合區(qū)域內(nèi)，下游引物位于my09引物的結(jié)合區(qū)域內(nèi)。該引物對(duì)僅擴(kuò)增一段65bp長(zhǎng)的核酸片段，產(chǎn)物需要使用混合探針雜交系統(tǒng)來分辨 43。spf1/2通用引物采用了混合引物池的方法，其中，spf1由四條引物構(gòu)成，spf2由兩條混合引物構(gòu)成（見圖6）

22、。同一引物池中的引物序列僅有個(gè)別堿基的差別。而這些差別正好對(duì)應(yīng)了不同類型hpv在該位點(diǎn)的差異（見圖7）。spf通用引物可以高效的擴(kuò)增多達(dá)43型的hpv病毒。并且，與gp5+/6+及my11/09相比，具有如下優(yōu)勢(shì)：1）spf1/2的擴(kuò)增片段只有65bp，而gp5+/6+及my11/09的擴(kuò)增片段分別為150 bp和450 bp。而pcr的特性導(dǎo)致較短的片段往往具有較高的擴(kuò)增效率44 45。2）pcr的效果與實(shí)驗(yàn)樣品dna的質(zhì)量息息相關(guān)，一些樣本如石蠟提取樣本的dna質(zhì)量往往較差。此時(shí)，擴(kuò)增短片段的spf1/2就具有比擴(kuò)增較長(zhǎng)片段的gp5+/6+及my11/09具有更大優(yōu)勢(shì)46。3）spf1/2

23、是混合引物，比gp5+/6+及my11/09與擴(kuò)增模板的匹配性更好，錯(cuò)配更少。并且，spf1/2引物的3端與大多數(shù)型別hpv都高度匹配，因此具有更高的擴(kuò)增效率。47 48。4）spf1/2不但可以高效擴(kuò)增感染生殖道的hpv型，還可以擴(kuò)增皮膚型的hpv病毒如：3、4、5、8、27、32、37、65、71等。圖8：my09/11, gp5/6, 和spf1/2在l1基因的位置及擴(kuò)增片段二、結(jié)語：由于my09/my11/hmb01, gp5/gp6, 和spf1/spf2三種針對(duì)hpv病毒l1基因序列的通用引物可以有效的擴(kuò)增現(xiàn)在已知的大部分hpv病毒，尤其是感染生殖道的hpv病毒類型。同時(shí)，這些通用

24、引物還可以發(fā)現(xiàn)新的病毒型、亞型、及病毒變異體。因此，這三對(duì)通用引物被廣泛應(yīng)用于大樣本流行病調(diào)查中。圖8表示了本文敘述的三種通用引物在l1基因的位置及擴(kuò)增片段長(zhǎng)短49。由圖可知：spf1與my11序列重疊、gp5+與spf2序列重疊。不同類型通用引物擴(kuò)增效率、優(yōu)勢(shì)型別不同50。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的通用引物就顯得非常重要。spf1/2擴(kuò)增短片段，效率最高，適用于各種不同的檢測(cè)模板。尤其是dna模板片段較短時(shí)，spf1/2仍能很好的檢測(cè)。但其產(chǎn)物只能通過探針雜交檢測(cè)，同時(shí)它提供的病毒序列信息也十分有限。my11/09擴(kuò)增450bp長(zhǎng)短的序列，可以提供較多的病毒序列信息，但該引物對(duì)模板質(zhì)量

25、要求較高，如石蠟提取樣本就不適合使用該引物檢測(cè)。gp5+/6+擴(kuò)增片段長(zhǎng)度中等，是目前最為常用的通用引物。不同的通用引物，pcr擴(kuò)增效率不同51。而且，當(dāng)同一個(gè)樣本中同時(shí)存在多種hpv類型感染時(shí)，通用引物擴(kuò)增往往存在競(jìng)爭(zhēng)抑制。這時(shí)，多重感染就很難正確檢測(cè)52。特別是存在較多堿基錯(cuò)配的hpv，及感染量很低的樣本，就很難被檢測(cè)到。針對(duì)通用引物的這些缺點(diǎn)，研究人員嘗試了許多解決方案，如：將spf1和gp6配合使用，改造gp5+/6+單一引物，使其成為類似spf1/2的混合引物，結(jié)合pcr、限制性酶切長(zhǎng)度多態(tài)分析、探針雜交53等。合理選用通用引物，靈活掌握使用方式，勇敢嘗試變通，嚴(yán)格的質(zhì)量控制，這些都

26、是通用引物檢測(cè)hpv病毒感染的成功關(guān)鍵54 55！綜述參考文獻(xiàn)1 zur hausen h. papillomaviruses in the causation of human cancers - a brief historical account. virology. 2009 feb 20;384(2):260-5. epub 2009 jan 8.2 brentjens mh, yeung-yue ka, lee pc, tyring sk. human papillomavirus: a review. dermatol clin. 2002 apr;20(2):315-31.3

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