液相色譜法測定大隆的方法學研究

1、液相色譜法測定大隆的方法學研究大?。〝呈舐。┦悄壳皣H上認為毒力最強的抗凝血殺鼠劑，具有靶譜廣、毒力高、使用濃度低、對第一代抗凝血殺鼠藥產(chǎn)生抗性的鼠類有效的特點1，大面積滅鼠省工、省餌。大隆生產(chǎn)中如某個環(huán)節(jié)控制不嚴格，產(chǎn)品中就會出現(xiàn)中間體和雜質(zhì)，影響其滅鼠效能。對殺鼠藥進行質(zhì)量檢測，是滅鼠及鼠藥生產(chǎn)中一個極其重要的環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)、國際無大隆標準檢驗方法2-3。文獻4報道，高效液相色譜法測定大隆，樣品前處理需經(jīng)過萃取過濾減壓蒸餾萃取過濾蒸干溶解等8個步驟。其缺點是操作繁瑣，難掌握，費水、費電、費時、費試劑，大批樣品測定需要技術(shù)人員也較多。筆者研究的以快速提取法處理樣品，用HPLC定量的實驗方法，

2、大大減少了財力、人力的消耗，提高了方法的準確度、靈敏度，加快了檢驗速度，每個樣品可節(jié)約儀器設(shè)備、試劑、水、電等開支數(shù)百元，具有很好的經(jīng)濟效益和社會效益。此方法不僅可對大隆生產(chǎn)原料、原粉、母粉、母液、毒餌進行分析，還可監(jiān)測其它香豆素類殺鼠藥，故可應(yīng)用于誤食鼠藥中毒樣品的分析鑒定。 1實驗部分1.1儀器與試劑1.1.1儀器Beckman 344M型高效液相色譜儀(165紫外檢測器，427積分儀)、液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)、粉碎機(江蘇金壇金城鎮(zhèn)華儀器廠)。1.1.2試劑優(yōu)級純丙酮、色譜純甲醇(江蘇淮陰塑料制品廠精細化工研究所)、優(yōu)級純醋酸、高純水(經(jīng)MILLI-Q處理，電導率 1.0s/c

3、m2)。1.1.3大隆標準儲備溶液精確稱取提純后含量99%的大隆標準品0.1000g，于100ml容量瓶中，用少量丙酮完全溶解后，再用甲醇稀釋至刻度，置冰箱4保存。該溶液濃度為1.0mg/ml。1.1.4大隆標準使用溶液取大隆標準儲備溶液0.5ml，于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。該溶液濃度為50g/ml。1.2實驗原理大隆殺鼠藥中的有效成分經(jīng)丙酮浸取、甲醇稀釋后，用色譜柱分離，再以紫外檢測器在最大吸收峰處測量吸收強度。其吸收強度與濃度關(guān)系符合朗伯比爾定律。1.3色譜條件色譜柱：AGEX ODS C18柱(5 4.6mm25cm)；流動相：甲醇10%醋酸(V/V)90+10；流速1.0m

4、l/min；檢測器波長265nm；進樣體積20l。1.4大隆樣品前處理樣品稱重全部精確至0.0001g。1.4.1原粉稱取大隆原粉樣品0.020.03g，于25ml具塞比色管中，用丙酮完全溶解后稀釋至刻度。取該溶液1.0ml于10ml比色管，用甲醇稀釋至刻度。1.4.2母粉稱取母粉樣品0.10.3g，于50.0ml具塞比色管中，用移液管加入25ml丙酮，在液體快速混勻器上振蕩510min，放置片刻，待液體稍清亮后，以0.5m FH濾膜過濾。1.4.3母液稱大隆母液0.10.3g，于25.0ml具塞比色管中，加甲醇至刻度，混勻后以0.5m FH濾膜過濾。1.4.4毒餌樣品經(jīng)粉碎機粉碎后過4060

5、目分樣篩。取過篩后樣品25g，于25ml具塞比色管中，用移液管加入10ml丙酮，浸泡20min，將比色管置液體快速混合器上萃取10min，放置片刻，待液體稍清亮后以0.5m FH濾膜過濾。經(jīng)上述處理后的樣品，用HPLC以外標法定量分析。1.5結(jié)果計算用標準溶液的峰面積與樣品的峰面積進行外標法定量。計算公式：式中 Cs為大隆標準溶液濃度(g/ml)；As為大隆標準溶液的峰面積；Aw為樣品溶液的峰面積；W為樣品的重量(g)；K為樣品稀釋倍數(shù)。2結(jié)果與討論2.1樣品中共存物的分離實驗選擇良好的色譜分離條件，將大隆與樣品中的雜質(zhì)完全分離，是大隆有效成分準確定量的關(guān)鍵。我們用甲醇與水、甲醇與不同濃度醋酸

6、、甲醇與1%(w/v)正磷酸的不同比例為流動相，分別以BECKMAN和AGEX色譜柱做分離條件實驗。結(jié)果如下：2.1.1AGEX ODS C18柱(5，4.6mm25cm)在甲醇10%醋酸90+10時，大隆原粉、母粉、母液及干擾成分較多的毒餌樣品中，有效成分及與其共存的雜質(zhì)均可完全分離，不影響大隆的準確定量(14)。1大隆原粉色譜分離2大隆母粉色譜分離3大隆母液色譜分離4大隆毒餌色譜分離2.1.2BECKMAN ODS C18柱(5，4.6mm25cm C18柱)在甲醇10%醋酸75+25為流動相時，可得到大隆標準溶液異構(gòu)體的兩個峰(5)，且測定樣品時異構(gòu)體與樣品中其它雜質(zhì)也能完全分離。異構(gòu)體

7、的比例與滅鼠效能、生物活性、代謝速度等有關(guān)5-6。但由于醋酸在流動相中所占的比例較大，為避免對色譜柱的損傷，實驗前后柱子的沖洗比較麻煩，不是特殊需要不采用該條件。 5大隆異構(gòu)體色譜分離2.24羥基香豆素類殺鼠藥的同時分離在實驗條件下，4羥基香豆素色譜峰的保留時間(RT)為1.64，殺鼠靈為2.66，殺鼠迷為3.46，溴敵隆為4.31，大隆為6.26，故該方法亦可應(yīng)用于誤食鼠藥中毒樣品的定性、定量分析。2.3樣品前處理條件的選擇實驗2.3.1溶劑的選擇大隆易溶于三氯甲烷、苯，中度溶解于丙酮，微溶于甲醇。前兩種溶劑毒性較大，污染嚴重；我們以丙酮做為樣品前處理溶劑，既可實現(xiàn)在色譜分離時所產(chǎn)生的溶劑峰

8、不干擾大隆的準確定量，又做到其溶解度能夠滿足實際樣品分析的需要。2.3.2大隆母粉、毒餌浸取時間的選擇液體快速混合器震動力量大，頻率高，速度均勻，大隆含量為0.5%的母粉，稱取0.4g加丙酮25ml；0.5/萬的毒餌，稱7.0g加丙酮10ml，在混合器上震動浸取510min，被測組份可完全浸出(表1)。表1母粉、毒餌浸取時間實驗樣品浸取時間(min)樣品浸取時間(min)5101551015母粉0.490.490.50毒餌0.480.480.48(%)0.500.500.50(/萬)0.510.500.510.500.490.502.4紫外檢測器吸收波長的選擇實驗在上述色譜條件下，在對大隆標準

9、溶液分析的同時，用165型紫外檢測器在200350nm范圍內(nèi)進行掃描，大隆紫外最大吸收波長為265nm。2.5線性范圍和檢測下限實驗準確吸取一定量的大隆標準儲備液于容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為5.0、30.0、60.0、120.0、240.0、300.0g/ml的標準溶液系列，在上述色譜條件下以20l定量杯進樣，做峰面積與濃度的標準曲線，線性回歸方程Y=3.7194+10.1374x，相關(guān)系數(shù)：r=0.9999，方法的最小檢測濃度0.3g/ml(按3倍信噪比計)，檢測下限6.0ng。2.6精密度實驗大隆原粉、母粉、母液、毒餌樣品各1份，按上述樣品前處理方法及測定條件做8次重復(fù)測定，相

10、對標準偏差(RSD)分別為0.59、3.45、1.02、4.11(表2)。 表2精密度實驗(n8)樣品精密度平均值SRSD(%)原粉81.60%4.8710-10.59母粉0.50%1.7310-23.45母液0.52%5.3410-31.02毒餌0.51/萬2.1010-24.112.7方法的準確度實驗取精密度實驗后已知有效成分含量的原粉、母粉、母液、毒餌樣品各15份于比色管中，分成3組，每組分別加入樣品本底濃度0.5倍、1倍、2倍的大隆標準溶液，搖動比色管，使樣品與標準溶液充分接觸。除母液外，其它樣品管置水浴中將溶劑完全揮發(fā)掉。將以上比色管按樣品處理方法的步驟制成待測溶液，再按上述色譜條件

11、測定其回收率，每種樣品各濃度組的平均回收率、標準差、相對標準偏差見表3。表3大隆樣品回收率實驗(n5)樣品種類本底量(g/ml)加標量(g/ml)平均回收率(%)標準差(s)相對標準差(RDS%)原粉 50.025.099.341.61651.627250.050.099.721.56031.564750.0100.0100.070.80090.8003母粉 20.010.097.681.78241.824720.020.098.831.00321.015120.040.098.910.38980.3941母液 20.010.098.201.70731.738620.020.099.520.8

12、7150.875720.040.099.150.33180.3347毒餌 10.05.097.022.31292.384010.010.097.301.61011.654810.020.098.850.87140.8816綜合上述，大隆殺鼠藥用快速提取法處理樣品、HPLC定量分析，具有簡便、快速、準確度好、靈敏度高、節(jié)省經(jīng)費的特點，適宜大批量樣品測定。該方法不僅適用于各級衛(wèi)生防病等部門的鼠藥質(zhì)量監(jiān)測工作，還可為鼠藥生產(chǎn)及用戶提供保證鼠藥質(zhì)量的可靠數(shù)據(jù)。 作者單位：天津市衛(wèi)生防病中心(郵編 300011)參考文獻1張一賓,張懌.農(nóng)藥.北京:中國物資出版社,1998，534.2國家技術(shù)監(jiān)督局標準化司編.中華人民共和國標準目錄及信息總匯