甲醛溶液對雞大腸桿菌滅活效果的影響

1、甲醛溶液對雞大腸桿菌滅活效果的影響摘要：為了優(yōu)化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的 滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進(jìn)行了 比較，同時選用不同生產(chǎn)廠家的甲醛溶液進(jìn)行了滅活 比較試驗。結(jié)果表明，對于濃度較高的雞大腸桿菌菌 液，采用37 C攪拌滅活，甲醛溶液的終濃度越高， 滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著 甲醛溶液的終濃度越高，用滅活徹底的菌液所制備疫 苗的副反應(yīng)就越大。不同生產(chǎn)廠家的甲醛溶液滅活效 果無明顯差異。關(guān)鍵詞：甲醛溶液；雞大腸桿菌；滅活工藝 中圖分類號： S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1007-273X（2014）02-0010-03甲醛溶液是目前滅活疫苗

2、生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的滅 活劑，成熟的滅活工藝能夠保證研制工作的順利開展 和細(xì)菌滅活疫苗的生物安全。為了優(yōu)化雞大腸桿菌疫 苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、 滅活時間進(jìn)行了比較，同時也對不同廠家生產(chǎn)的甲醛 溶液進(jìn)行了滅活比較試驗。1 材料1.1 大腸桿菌菌種01株、02株、078株均由青島易邦生物工程有 限公司提供。1.2 培養(yǎng)基LB 液體培養(yǎng)基。1.3 菌液分別制備 01株、02株、078株菌液各 2批（201101 批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2X 1 0 1 0CFU/mL）。1.4 試驗雞2128日齡SPF雞均購自北京某SPF雞場。1.5 滅活劑 上海國藥集團(tuán)化

3、學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的甲醛，批 號為 2011304。濟(jì)南魯康化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn)的甲 醛，批號為 110713。2 試驗設(shè)計2.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇分別量取 201101 批 01 株、 02 株、 078 株菌液 3 份，分別按終濃度為 0.1%、 0.2%、 0.3%、 0.4%分別 加入上海國藥生產(chǎn)的化學(xué)純甲醛溶液，分別置于37 C滅活 & 12、16、20、24、36 h。各株菌液滅活 后，均用LB肉湯培養(yǎng)基2支，各接種0.2ml, 37 C 培養(yǎng)7 d,觀察有無細(xì)菌生長，以確定菌液滅活是否徹 底。2.2 疫苗的安全檢驗取“ 2.1”經(jīng) 0.1%、0.2%、0.3%、0

4、.4%甲醛溶液 滅活徹底的201101批O1株、O2株、O78株菌液， 按 4%加入吐溫并混勻后作為水相，再與油相按 1 ： 2（V/V ）乳化制成疫苗，分別用2128日齡SPF雞 10只，每只頸部皮下注射疫苗1 mL,觀察14 d有無 因注射疫苗引起的不良反應(yīng)。2.3 滅活劑的比較在 201101 批菌液經(jīng)滅活和安全試驗的基礎(chǔ)上， 使 用不同廠家 （上海國藥、 濟(jì)南魯康） 生產(chǎn)的甲醛溶液， 按照“2.1”項選定的滅活條件，分別對 201102批 O1 株、 O2 株、 O78 株菌液進(jìn)行滅活試驗， 觀察不同廠家 生產(chǎn)的甲醛溶液的滅活效果有無差異。3 結(jié)果與分析3.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時

5、間的選擇試驗結(jié)果（表1）表明，各株菌液在37 C條件下， 甲醛溶液最終濃度為 0.1%攪拌滅活 36 h 滅活徹底， 甲醛溶液最終濃度為 0.2%攪拌滅活 24 h 滅活徹底， 甲醛最終濃度為 0.3%攪拌滅活 16 h 均能滅活徹底， 甲醛溶液最終濃度為 0.4%攪拌滅活 12 h 滅活徹底。3.2 滅活的安全檢驗試驗結(jié)果 （表 2）表明，用終濃度為 0.1%、0.2%、 0.3%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗進(jìn)行安全檢驗，試 驗雞均未出現(xiàn)注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良 反應(yīng)；用終濃度為 0.4%甲醛溶液滅活的菌液制備疫 苗，安檢雞 3/10 均出現(xiàn)精神一過性不振， 2/10 飲食略 有下降

6、， 3/10 注射部位發(fā)紅。3.3 滅活劑的比較試驗結(jié)果（表 3）表明，上海國藥、濟(jì)南魯康生 產(chǎn)的甲醛溶液按 0.3%終濃度分別加入到 201102 批各 株菌液，37 C攪拌滅活16 h,均滅活徹底。兩廠家生 產(chǎn)的同級另甲醛溶液對雞大腸桿菌的滅活效果無明顯 差異。4 小結(jié)與討論本研究用甲醛終濃度為 0. 1 %、0.2%、0.3%滅活的 菌液制備疫苗進(jìn)行安全檢驗，安檢雞均未出現(xiàn)注射部 位紅腫，采食飲水量下降等不良反應(yīng)；用甲醛終濃度 為 0.4%滅活徹底的菌液制備疫苗，安檢雞 3/10 精神 一過性不振，安檢雞 2/1 0飲食略有下降， 3/10注射部 位均發(fā)紅。對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，

7、甲醛溶 液的終濃度越高， 滅活時間越短， 滅活效果就越明顯； 但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，滅活徹底的 菌液所制備疫苗的副反應(yīng)就越大。將雞大腸桿菌菌液，按終濃度 0.3%加入甲醛溶 液，37 C攪拌滅活16 h,滅活徹底，且疫苗安檢后未 見不良反應(yīng)?？紤]實(shí)際生產(chǎn)中影響因素較多，為了保 證滅活徹底，同時為減少高濃度甲醛副反應(yīng)，建議采 用甲醛溶液，按0.3%的終濃度在37 C條件下攪拌滅 活24 h作為實(shí)際生產(chǎn)中雞大腸桿菌（O1株、02株、 O78 株）菌液的滅活條件。不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液質(zhì)量基本一致，無明顯 差異。由于實(shí)際生產(chǎn)中，菌液量較大，為防止由于濃 度過高引起局部的蛋白凝聚和變性，因此建議將甲醛 溶液進(jìn)行稀釋后使用。本試驗結(jié)果是在實(shí)驗室小量操作等條件下得出的 試驗結(jié)果，在具體研究或生產(chǎn)其他菌株大腸桿菌或其 他種類細(xì)菌時，其滅活工藝還需要另外進(jìn)行具體地摸 索和驗證。盡管如此，依然希望本試驗所得出的數(shù)據(jù) 和結(jié)論能對相關(guān)研究提供一定意義的參考。參考文獻(xiàn)：1 白文彬，于康震 .動物傳染病診斷學(xué) CM3. 北 京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 2002.857-862.2 才學(xué)鵬，景志忠，邱昌慶動物疫苗