畢業(yè)設(shè)計（論文）樟樹籽蛋白質(zhì)的提取與分析

1、武夷學(xué)院武夷學(xué)院 畢業(yè)設(shè)計畢業(yè)設(shè)計( (論文論文) ) 樟樹籽蛋白質(zhì)的提取與分析 院院 系系 ：武夷學(xué)院 專專業(yè)業(yè)（班班級級）：生物技術(shù)及應(yīng)用 姓姓名名 ： 學(xué)學(xué)號號 : : 指指導(dǎo)導(dǎo)教教師師： 職職稱稱： 講師 完完成成日日期期：2011 年 6 月 3 日 武夷學(xué)院教務(wù)處制武夷學(xué)院教務(wù)處制 樟樹籽蛋白質(zhì)的提取與分析樟樹籽蛋白質(zhì)的提取與分析 摘要：摘要：植物蛋白的提取方法有等電點法 、離子交換法 及超濾法、乙醇沉淀蛋 白法等 本實驗采用了乙醇沉淀蛋白,其優(yōu)點是避免蛋白質(zhì)變性 ,盡可能 減少雜質(zhì)。本實驗采用磷酸鹽緩沖液溶解蛋白質(zhì)再用乙醇為脫水劑破壞 蛋白質(zhì)膠體質(zhì)點的水化層，使其沉淀析出進而對樟

2、樹籽蛋白進行提取,并 用紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)的濃度,sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白 質(zhì)的相對分子質(zhì)量，對樟樹籽蛋白進行分析 關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：樟樹籽，蛋白質(zhì)，提取，分析 目錄目錄 1 前言1 1.1 樟樹籽簡介1 1.2 油類作物蛋白提取方法 1 1.2.1 水相萃取法2 1.2.2 有機相萃取法2 1.2.3 水相酶解法2 1.3 蛋白質(zhì)分析檢測方法3 1.3.1 folin-酚試劑法(lowry 法)3 1.3.2 紫外吸收法3 2 材料和方法3 2.1 材料 3 2.1.1 實驗材料3 2.1.2 試劑3 2.2 器材4 2.3 實驗方法4 2.3.1 提取方法4 2.3.2 蛋白

3、質(zhì)分離方法5 2.3.3 蛋白質(zhì)的定性5 2.3.4 蛋白質(zhì)的等電點6 2.3.5 紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度6 2.3.6 sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)的分子量測定7 3 結(jié)果與討論9 3.1 前處理9 3.2 蛋白質(zhì)的提取9 3.3 sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳法10 4 結(jié)論11 參考文獻11 致謝13 1 1 前言前言 1.11.1 樟樹籽簡介樟樹籽簡介 樟樹屬樟科( lauraceae)植物 ,是一種生長在亞熱帶地區(qū)四季常青的樹種 ,在 我國長江以南地區(qū)及臺灣省有大量種植。樟樹籽 ,又名樟犁、香樟子、大木姜 子、樟子等，其氨基酸含量豐富 ,品質(zhì)優(yōu)良 ,但是、目前 ,樟樹籽除極少量

4、被 采摘入藥外 ,大部分均自生自滅 ,沒有被很好地利用.由于食物資源供需矛盾的 日益突出 ,開發(fā)利用新的蛋白質(zhì)資源已成當(dāng)務(wù)之急 ,尤其是植物性蛋白質(zhì)源的 開發(fā)利用已成為世界各國解決食物資源匱乏的重要突破口.大豆蛋白、 花生蛋 白的應(yīng)用已日趨普遍 ,但對樟樹籽蛋白的利用還沒有引起足夠的重視， 樟樹( cinnamomum camphora)是樟科屬的常綠喬木植物 ,高 2030 m。主 要生長在熱帶和亞熱帶地區(qū) ,全世界有 45 個屬約 2 500 余種 ,在我國有約 20 個屬近 430 種 ,其中我國特有的有 355 余種 ,樟樹是我國特產(chǎn)珍貴木材和經(jīng) 濟林樹種 ,被譽為江南寶樹。樟樹 34

5、 月開花 ,花小呈綠色或淡黃色 ,長大 約 2 mm ,花被 6 裂 ,橢圓形?；ㄆ谀苌l(fā)出淡淡的清香 ,這段時期大約一周 至半月左右。每年 1012 月樟樹籽基本成熟 ,但這時的樟樹籽很少自行脫落 ,其 果皮依然是與葉面相同的綠色。再往后果皮的顏色逐漸加深 ,到第二年 12 月樟樹籽果皮已由綠色逐漸變成棕黑色或黑色。樟樹是樟科屬的常綠喬木植物 中經(jīng)濟價值最大的樹種之一 ,是天然樟腦、芳香油、油脂、優(yōu)質(zhì)木材、醫(yī)藥等 類的重要資源 ,其木材、根、葉、果實皆含精油 ,以往主要是對根、莖、葉進 行利用與加工 ,近年來對樟樹籽的利用研究增多 ,發(fā)現(xiàn)其核仁含脂肪油 ,含油 率高達 40 %以上。油脂中脂

6、肪酸組成以 c10、 c12 脂肪酸為主 ,占 90 %左右。 樟樹籽 ,又名樟梨、香樟大木姜子、樟子等。成熟的樟樹籽呈扁球形 ,直 徑大約 59mm ,每千粒重大約是 200 g,果皮肉質(zhì)薄 ,能散發(fā)出芬芳的清香。 我國很早就將樟樹籽作為藥物用于治病 ,并認(rèn)為樟樹籽有驅(qū)風(fēng)散寒、行氣止痛 之功效。癸酸(c10)已應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)合成魚腥草素等消炎藥 ,主要含有癸酸 (c10)的樟樹籽脂肪油已被試制成碳酸甘油脂 ,用于治療脂肪代謝紊亂病癥 ,并 能降血脂及膽固醇。 1.21.2 油類作物蛋白提取方法油類作物蛋白提取方法 油類作物蛋白營養(yǎng)價值和功能特性已被廣泛接受，但國內(nèi)外仍沒有工業(yè)化 產(chǎn)品。由于油

7、類中抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在，過去很長一段時間內(nèi)，油脂工業(yè)只注重 油類作物榨油，忽略了油類作物蛋白的利用，造成植物蛋白資源的浪費。當(dāng)今 世界蛋白資源供求日趨緊張，所以，各國學(xué)者們開始轉(zhuǎn)向油類作物蛋白的研究。 目前，從油類作物中提取蛋白質(zhì)的方法主要有以下幾種。 1.2.11.2.1 水相萃取法水相萃取法 水相萃取法是采用不同水相將菜籽蛋白提取，再分離(常用等電點法)，得 到菜籽分離蛋白或者是通過水相將菜籽餅粕中硫苷、植酸、可溶性糖等非蛋白 組分溶出，獲得菜籽濃縮蛋白的方法。常用的水相有：水、稀酸、稀堿、nacl 溶液、六偏磷酸鈉溶液等。劉大川等人(2005 年)以脫皮脫脂雙低菜籽粕為原料， 在 ph 值

8、 11，同液比 1：12，浸提溫度 50下，用 naoh 溶液浸提 4 次，每次 35 min，得到產(chǎn)品的蛋白含量 8612，蛋白得率 2435。金晶等人(2009 年) 選用雙低菜籽粕為原料，采用超聲微波輔助水相法，在超聲頻率 40 khz，功率 50 w，微波功率 73 w，料液比 1：28，時間 8 min 下，提取 3 次，獲得蛋白含 量為 8365的產(chǎn)品，蛋白得率 3876。水相萃取法工藝簡單、成本低，但 蛋白得率不高，易污染環(huán)境。蛋白得率偏低的主要原岡是菜籽蛋白組成復(fù)雜， 相對分子量差異大，使得菜籽蛋白溶解曲線不能形成“u”型，而出現(xiàn) 2 個或多 個等電點區(qū)域。 1.2.21.2.

9、2 有機相萃取法有機相萃取法 采用醇、酮等有機溶劑提取菜籽餅粕中植酸、多酚、殘油、色素等組分， 制取菜籽濃縮蛋白的方法。曾曉波等人(2001 年)以雙低脫殼菜籽餅粕為原料， 采用丙酮浸提法，在丙酮體積分?jǐn)?shù)為 78。85，naci 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 7，ph 值 為 4.0 下提取，所得濃縮蛋白的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 70，產(chǎn)品色淺味淡，功能 性質(zhì)較好，可用作食品添加劑。金青哲等人(2006 年)i 以雙低菜籽為材料， 采用超聲波輔助乙醇浸提法，在超聲頻率 20 khz，功率 100 kw，乙醇體積分?jǐn)?shù) 為 70，液同比 35：1 的條件下，提取 3 次，每次 20 min，所得濃縮蛋白蛋 白質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于

10、 60，氨基酸平衡，硫苷、植酸、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低。 有機相萃取法具有產(chǎn)品色澤好，脫毒率高等優(yōu)點，但工藝復(fù)雜，成本高，易引 起蛋白變性，影響蛋白營養(yǎng)效價。 1.2.31.2.3 水相酶解法水相酶解法 水相酶解法是在水相萃取法基礎(chǔ)上，增加了酶水解過程，以提高菜籽蛋白 收率和品質(zhì)的方法。常用的酶有：堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和木 瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等。劉志強等人(2004 年)舊以雙低油菜籽為原料，采用水相酶解法，并用纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶 (質(zhì)量比為 3：1)作為酶制劑，在固液比 l：5，酶用量 30 u/g 下，酶解 100 min，再經(jīng)超濾分離菜籽

11、蛋白，經(jīng)干燥所得產(chǎn)品蛋白得率達 823。產(chǎn)品安全 性能良好，異硫氰酸酯和嘿唑硫烷酮均未檢出。張霜玉等人(2009 年)以“中雙 7 號”脫皮油菜籽為材料，采用水相酶解法，在料液比為 l：5，加酶量為 2，ph 值 38，50下酶解 4 h，所得水解蛋白產(chǎn)品的得率為 8250。水 相酶解法有利于蛋白溶出，提高了蛋白得率，改善了蛋白功能特性，減輕餅粕 中抗?fàn)I養(yǎng)岡子對人體及動物的毒害作用，同時具有降低殘油率，增加蛋白產(chǎn)品 保藏性能等優(yōu)點，但該法存在蛋白水解后產(chǎn)生苦味的問題。 1.31.3 蛋白質(zhì)分析檢測方法蛋白質(zhì)分析檢測方法 1.3.11.3.1 folin-folin-酚試劑法酚試劑法(lowry

12、(lowry 法法) ) 蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與 folin-酚試劑起氧化還原反應(yīng)。 反應(yīng)過程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試 劑中的 cu2+作用生成蛋白質(zhì)-cu2+復(fù)合物；第二步：蛋白質(zhì)-cu2+復(fù)合物中所含的 酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。該 呈色反應(yīng)在 30 分鐘內(nèi)即接近極限，并且在一定濃度范圍內(nèi)，藍色的深淺度與蛋 白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進行測定時要根 據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測定波長：若蛋白質(zhì)含量高時（25-100g） 在 500nm 波長處進行測定，含量低時(5-25g

13、)在 755nm 波長處進行測定。最后 根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。 folin-酚試劑法操作簡便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于 5g 即可測 得，是測定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。 1.3.21.3.2 紫外吸收法紫外吸收法 大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使 蛋白質(zhì)在 280nm 的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收，并且這一波長范圍內(nèi)的吸收值與蛋 白質(zhì)濃度的成正比，利用這一特性可定量測定蛋白質(zhì)的含量。 紫外吸收法可測定 0.1-0.5mg/ml 的蛋白質(zhì)溶液，此操作簡便，測定迅速， 不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中

14、廣泛應(yīng)用。 2 2 材料和方法材料和方法 2.12.1 材料材料 2.1.12.1.1 實驗材料實驗材料 樟樹籽干燥 70 攝氏度 24 小時，備用。 2.1.22.1.2 試劑試劑 石油醚（c.p.，沸程 3060） ，磷酸氫二鈉（分析純 ar） ，磷酸二氫鈉 （分析純 ar） ， 氯化鈉（分析純 ar） ，95%乙醇（分析純 ar） ，tris （分析純 ar） ，濃鹽酸（分析純 ar） ，sds（分析純 ar） ，甘油（分析純 ar） ，溴酚藍 （分析純 ar） ，-丙烯酰胺（分析純 ar） ，巰基乙醇（分析純 ar） ，甲醇（分析 純 ar） ，考馬斯亮藍 r-250（分析純 ar）

15、，冰醋酸（分析純 ar） 2.22.2 器材器材 fz102 型植物粉碎機，索氏提取器，離心機，紫外分光光度計，垂直電泳槽， 電泳儀，微型凝膠電泳裝置（寧波宏耀電泳科技有限公司）；水浴鍋； eppendorf 管；微量注射器（50l 或 100l）。 2.32.3 實驗方法實驗方法 2.3.12.3.1 提取方法提取方法 1) 將樣品在 80100電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘去水分，一般烘 4h，烘干時 要避免過熱。樣品顆粒不宜太大，一般要在研缽中研碎樣品。 2) 準(zhǔn)備工作：將恒溫水浴鍋的水溫事先加熱（80） 。務(wù)必保證提取管和 燒瓶內(nèi)干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi) 120烘干。 3) 折濾紙

16、斗：取一張 11cm 的濾紙，折成筒狀，再將其一端折起來封死， 便做成了濾紙斗。 4) 稱樣：先將數(shù)粒樟樹籽在碾缽中用碾錘徹底搗碎作為實驗樣品。參照實 驗設(shè)備和器材，將濾紙斗在電子天平上稱重，然后用藥勺取 10g 樣品 裝入濾紙斗中，把濾紙斗的開口處折起來封死；防止樣品泄出濾紙斗。 調(diào)整濾紙斗的高度，使其放在抽提管中時略低于虹吸管的上彎頭處。將 裝好樣品的濾紙斗放在電子天平上稱重，兩質(zhì)量之差即為樣品的質(zhì)量。 5) 提?。菏紫劝惭b好燒瓶，并調(diào)整其高度，使其剛好能浸入水浴鍋中的水 中。將裝置 6) 從水浴鍋的水中取出，繼續(xù)安裝提取管，把裝有樣品的濾紙斗放入提取 管內(nèi)，向提取管中緩緩倒入石油醚直至液

17、面達到虹吸管上彎頭部，正好 虹吸一次；再向提取管中倒入石油醚，使其液面達到第一次液面的一半。 用乳膠管將冷凝管與自來水管相連，將冷凝管安裝到提取管上，檢查一 下，確保所有接口均對接完好（不漏氣，不打滑） 。輕輕打開自來水 （冷凝用） ，將索氏提取儀整個裝置放入恒溫水浴鍋中加熱提?。ㄋ疁?80左右） ，請觀看軟件中的視頻索氏提取儀的安裝 。提取時間 22h，約虹吸 10 次以上，記錄每次虹吸所需的時間和虹吸次數(shù)。附注： 若要將樣品的粗脂提取完全，提取時間至少為 12h 以上。由于實驗時間 的限制，我們的提取率只能達到 80左右。 7) 回收石油醚：提取 2h 后，當(dāng)石油醚在提取管中的液面即將達到

18、虹吸管 的上彎頭處時，從水浴鍋中取出索氏提取儀裝置，室溫冷卻 510min； 取下平底燒瓶，將提取管的下端口插入回收瓶中，傾斜裝置，提取管中 的石油醚會虹吸而流入回收瓶中，達到回收的目的。再裝上平底燒瓶， 繼續(xù)放入恒溫水浴鍋中加熱直至冷凝管下端無石油醚滴下，表明平底燒 瓶中的石油醚已經(jīng)蒸干。注意：必須蒸干后才能放入干燥箱烘干，否則 會引起火災(zāi)。取下平底燒瓶，回收提取管中的石油醚 8) 稱量粗脂質(zhì)量：將平底燒瓶放入 120的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘 15min， 取出冷卻后稱重（須戴手套，以免燙傷） 。再將平底燒瓶用洗滌劑洗凈， 于 120的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干（約 15min） ，取出冷卻后稱重，兩

19、者 的質(zhì)量之差就是粗脂的質(zhì)量。 9) 計算 樣品粗脂的含量（%）=（粗脂的質(zhì)量/樣品的質(zhì)量）*100% 10) 將上述去脂烘干的樣品置于燒杯中，加入 ph 為 7.2 的磷酸鹽緩沖夜 100ml 浸提 2h 2.3.22.3.2 蛋白質(zhì)分離方法蛋白質(zhì)分離方法 將浸提液均勻倒入兩個離心管使兩管質(zhì)量相同，對稱放入離心機中，調(diào)整 離心機 4000 轉(zhuǎn) 5 分鐘，將上清液傾入燒杯，加晶體 nacl 少許（加速沉淀并使 沉淀完全） ，待溶解后再加入 95%的乙醇 100ml 混勻。觀察有無沉淀析出 將所得溶液離心，獲得沉淀，用 1% nacl 溶液溶解定容于 250ml 容量瓶中， 備用。 2.3.32

20、.3.3 蛋白質(zhì)的定性蛋白質(zhì)的定性 蛋白質(zhì)分子中的某些基團與顯色劑作用，可產(chǎn)生特定的顏色反應(yīng)，不同蛋 白質(zhì)的所含氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)也不同。顏色反應(yīng)時一些常用的蛋白 質(zhì)定量測定的依據(jù) 2.3.3.1 黃色反應(yīng) 蛋白質(zhì)分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸（酪氨酸、色氨酸） 。遇到硝酸可硝化 成黃色物質(zhì)，此物質(zhì)在堿性環(huán)境中變?yōu)殚冱S色的硝基衍生物。取一試管，置所 提取的蛋白質(zhì)溶液 10 滴及濃硝酸 34 滴，加熱，冷卻后再 10%naoh 溶液 5 滴， 觀察顏色變化, 2.3.3.2 茚三酮反應(yīng) 茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成 co2、nh3 和醛，水合茚 三酮被還原成還原型茚三酮；第二

21、步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚 三酮分于和氨縮合生成有色物質(zhì)。此反應(yīng)的適宜 ph 為 57，同一濃度的蛋白 質(zhì)或氨基酸在不同 ph 條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。操作方 法： (1)取 1 支試管加入蛋白質(zhì)溶液 1 毫升，再加 0.5 毫升 0.1茚三酮水溶液， 混勻，在沸水浴中加熱 12 分鐘，觀察顏色 (2)在一小塊濾紙上滴一滴 0.5的甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴上一 滴 0.1的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干顯色，觀察 2.3.42.3.4 蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點 在等電點時，其溶解度最小。可調(diào)節(jié)蛋白溶液的 ph 值使其達到蛋白質(zhì)的等 電點，獲得蛋白沉淀。 實

22、驗步驟： 取同樣規(guī)格的試營 4 支,向以上試管中各加樣品蛋白的醋酸鈉 溶液 1 毫升,加一管,搖句一管.此時 1,2,3,4 管的 ph 值依次為 1,3,5,7 觀察其 混濁度.靜置 10 分鐘后,再觀察其混濁度.最混濁的一管的 ph 即為樣品蛋白的等 電點. 2.3.52.3.5 紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度 蛋白質(zhì)組成中長含有酪蛋白和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光 280nm 波 長處有最大吸收峰，一定濃度范圍內(nèi)其濃度與吸光度成正比，故可用紫外分光 光度計通過比色來測定蛋白質(zhì)的含量。 由于核酸在 280nm 波長處也有光吸收，對蛋白質(zhì)測定有一定的干擾作用， 但核酸

23、的最大吸收峰在 260nm 處。如同時測定 260nm 的光吸收，通過計算可以 消除其對蛋白質(zhì)測定的影響。因此如溶中存在核酸時必須同時測定 280nm 及 260nm 的吸光度，方可通過計算測得溶液中的蛋白質(zhì)濃度。 操作步驟 在紫外分光光度計上，將未知的蛋白質(zhì)溶液小心盛于石英比色皿中，以生 理鹽水為對照，測得 280nm 和 260nm 兩種波長的吸光度（a280nm 及 a260nm）。 將 a280nm 及 a260nm 波長處測得的吸光度按下列公式計算蛋白質(zhì)濃度。 c = 1.45a280nm 0.74a260nm 式中c：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/ml）； a280nm：蛋白質(zhì)溶液在 28

24、0nm 處測得的吸光度； a260nm：蛋白質(zhì)溶液在 260nm 處測得的吸光 本法對微量蛋白質(zhì)的測定既快又方便，它還適用于硫酸銨或其他鹽類混雜 的情況，這時用其他方法測定往往較困難。 為方便起見對于混合蛋白質(zhì)溶液，可用a280nm 乘以 0.75 來代表其中蛋白 質(zhì)的大致含量（mg/ml）。 2.3.62.3.6 sdssds 聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量測定 2.3.6.1.實驗試劑配制 2mol/l tris-hcl (ph8.8):取 24.2g tris, 加 50ml 蒸餾水，緩慢的加 濃鹽酸至 ph8.8（約加 4ml） ；讓溶液冷卻至

25、室溫，ph 將會升高，加蒸餾水至 100ml。 1mol/l tris-hcl (ph8.8):取 12.1g tris, 加 50ml 蒸餾水，緩慢的加 濃鹽酸至 ph6.8（約加 8ml） ；讓溶液冷卻至室溫，ph 將會升高，加蒸餾水至 100ml。 10% (w/v) sds: 取 10g 的 sds，加蒸餾水至 100ml。 50% (v/v) 甘油: 取 50ml 100%甘油，加入 50ml 蒸餾水。 1% (w/v) 溴酚藍:取 100mg 溴酚藍，加蒸餾水至 10ml，攪拌,直到完全 溶解，過濾除去聚合的染料。 a 液-丙烯酰胺儲備液（配制含 30% (w/v) 丙烯酰胺和 0

26、.8% (w/v) 甲 叉雙丙烯酰胺的溶液 100ml）在通風(fēng)柜中操作，取 29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉 雙丙烯酰胺，加蒸餾水至 100ml，緩慢攪拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石 蠟?zāi)し饪冢稍?4存放數(shù)月。 b 液-4分離膠緩沖液：取 75ml 2mol/l tris-hcl (ph8.8)，加入 4ml 10% sds, 加 21ml 蒸餾水，混勻，可在 4存放數(shù)月。 c 液-4濃縮膠緩沖液:取 50ml 1mol/l tris-hcl (ph6.8)，加入 4ml 10% sds, 加 46ml 蒸餾水，混勻，可在 4存放數(shù)月。 10%過硫酸銨：取 0.5g 過硫酸銨，加入 5

27、ml 蒸餾水，可保存在密封的管 內(nèi)，于 4存放數(shù)月。 電泳緩沖液：取 3g tris，14.4g 甘氨酸，1g sds，加蒸餾水至 1l, ph 約為 8.3, 也可配制成 10的儲備液，在室溫下長期保存。 5樣品緩沖液：取 0.6ml 1mol/l tris-hcl (ph6.8)，加入 2ml 10% sds, 5ml 50%的甘油，0.5ml 2-巰基乙醇，1ml 1%溴酚藍，0.9ml 的蒸餾水混 勻，可在 4保存數(shù)周，或在-20保存數(shù)月。 考馬斯亮藍染液：1.0g 考馬斯亮藍 r-250，加入 450ml 甲醇，450ml 蒸 餾水及 100ml 冰醋酸即成。 考馬斯亮藍脫色液：將

28、100ml 甲醇，100ml 冰醋酸，800ml 蒸餾水混勻 備用。 2.3.6.2.灌制分離膠 組裝凝膠模具: 可按照使用說明書裝配好灌膠用的模具。對于 bio-rad 的微型凝膠電泳系統(tǒng)，在上緊螺絲之前，必須確保凝膠玻璃板和隔片的底部與 一個平滑的表面緊密接觸，有細微的不匹配就會導(dǎo)致凝膠的滲漏。 將 a 液、b 液及蒸餾水在一個小燒瓶或試管中混合，丙烯酰胺(a 液中) 是神經(jīng)毒素，操作時必須戴手套。加入過硫酸銨和 temed 后，輕輕攪拌使其混 勻(過量氣泡的產(chǎn)生會干擾聚合)。凝膠很快會聚合，操作要迅速。小心將凝膠 溶液用吸管沿隔片緩慢加入模具內(nèi)，這樣可以避免在凝膠內(nèi)產(chǎn)生氣泡。 當(dāng)加入適量

29、的分離膠溶液時(對于小凝膠，凝膠液加至約距前玻璃板頂 端 1.5cm 或距梳子齒約 0.5cm)，輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層 1mm5mm 的水 層，這使凝膠表面變得平整。當(dāng)凝膠聚合后，在分離膠和水層之間將會出現(xiàn)一 個清晰的界面。 2.3.6.3.灌制濃縮膠 吸盡覆蓋在分離膠上的水后將 a 液、c 液和蒸餾水在三角燒瓶或小試管 中混合。加入過硫酸銨和 temed，并輕輕攪拌使其混勻。 將濃縮膠溶液用吸管加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的 頂端。將梳子插入凝膠內(nèi)，直至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊。必須確 保梳子齒的末端沒有氣泡。將梳子稍微傾斜插入可以減少氣泡的產(chǎn)生。 凝膠聚合后，小

30、心拔出梳子，不要將加樣孔撕裂。將電泳緩沖液加入內(nèi) 外電泳槽中，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。 2.3.6.4.制備樣品和上樣 將蛋白質(zhì)樣品與 5x 樣品緩沖液(20l+5l)在一個 eppendorf 管中混 合。100加熱 2 min10min。離心 1s，如果有大量蛋白質(zhì)碎片則應(yīng)延長離心 時間。 用微量注射器將樣品加入樣品孔中。將蛋白質(zhì)樣品加至樣品孔的底部， 并隨著染料水平的升高而升高注射器針頭。避免帶入氣泡，氣泡易使樣品混入 到相鄰的加樣孔中。 2.3.6.5.電泳 將電極插頭與適當(dāng)?shù)碾姌O相接。電流流向陽極。將電壓調(diào)至 200v（保持 恒壓；對于兩塊 0.75mm 的膠來說，電流開始

31、時為 100ma，在電泳結(jié)束時應(yīng)為 60ma；對于兩塊 1.5mm 的膠來說，開始時應(yīng)為 110ma，結(jié)束時應(yīng)為 80ma。 ） 。 對于兩塊 0.75mm 的凝膠，染料的前沿遷移至凝膠的底部約需 3040 分 鐘(1.5mm 的凝膠則需 40 min50min)。關(guān)閉電源,從電極上拔掉電極插頭,取出 凝膠玻璃板,小心移動兩玻璃板之間的隔片，將其插入兩塊玻璃板的一角。輕輕 撬開玻璃板，凝膠便會貼在其中的一塊板上。 2.3.6.6.考馬斯亮藍染色 這種染色方法在單條電泳帶中蛋白質(zhì)最小檢出量為 0.1g 的蛋白。通常可 以根據(jù)所需要的敏感度來選擇是使用考馬斯亮藍染色或銀染色。 戴上手套避免將手指印

32、留在電泳凝膠上，將凝膠移入一個小的盛有少量 考馬斯亮藍(20ml 已經(jīng)足夠)的容器內(nèi)(小心不要將膠撕破)?；?qū)⒉ＡО暹B同凝 膠浸在染料中輕輕振蕩直至凝膠脫落。 對于 0.75mm 的凝膠，可在搖床上緩慢震蕩 5 分鐘l0 分鐘，對于 1.5mm 的凝膠，則需 10 分鐘20 分鐘，在染色和脫色過程中要用蓋子或封口膜密閉 容器口。棄去染液，將凝膠在水中漂洗數(shù)次。戴手套以避免將雙手染色。 加入考馬斯亮藍脫色液(約 50ml)，清晰的條帶很快會顯現(xiàn)出來，大部分 凝膠脫色需要 1h，使用過的脫色液則可用水沖洗掉。為了脫色完全，需數(shù)次更 換脫色液并震蕩過夜。 根據(jù)凝膠中標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的相對遷移率判斷待

33、測樣品的大致分子量。 3 3 結(jié)果與討論結(jié)果與討論 3.13.1 前處理前處理 粉碎后用烘箱對樟樹籽進行干燥時，粉末熱時濕度較大冷時結(jié)凍成固態(tài)， 可以體現(xiàn)樟樹籽中油脂含量較高，稱量樟樹籽 10.002g 索氏抽提得到蛋白和 淀粉的混合物重 7.623g，計算油脂的含量粗脂的含量（%） =2.377/10.002*100%=23.765% 3.23.2 蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的提取 植物蛋白的提取方法有等電點法 、離子交換法 及超濾法、乙醇沉淀蛋白法 等 本實驗采用了乙醇沉淀蛋白,其優(yōu)點是避免蛋白質(zhì)變性 ,盡可能減少雜質(zhì)。 本實驗采用磷酸鹽緩沖液溶解蛋白質(zhì)再用乙醇為脫水劑破壞蛋白質(zhì)膠體質(zhì)點的 水化層

34、，使其沉淀析出進而對樟樹籽蛋白進行提取，提取效果好，提取率 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)是檢驗蛋白質(zhì)方法簡單方便，提取的物質(zhì)在黃色反應(yīng)中呈黃， 茚三酮反應(yīng)呈紫紅色，充分證明所提取的物質(zhì)為蛋白質(zhì)。 根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的測定最終測定蛋白質(zhì)的在 ph 為 1 時沉淀最為明顯,所 以提取的該蛋白質(zhì)的等電點為 1 蛋白質(zhì)濃度測定方法有雙縮尿法、福林酚試劑測定法、考馬斯亮藍結(jié)合 法、紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度本法采用紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度方法 簡單方便測得蛋白質(zhì)的濃度： 計算結(jié)果: c = 1.45a280nm 0.74a260nm=3.177mgml 3.33.3 sdssds 聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠

35、電泳法 經(jīng)過電泳操作得到出產(chǎn)品的圖譜，分離膠的濃度為 7.5%，濃縮膠的濃度為 5%。 圖 1 電泳圖譜（7.5%分離膠，5%濃縮膠） 從圖中可以看出，當(dāng)分離膠的濃度采用 7.5%時，分離效果比較差，而且泳 道中蛋白樣品有拖尾現(xiàn)象，因此調(diào)整分離膠的濃度。 樣品 2樣品 1 圖 2 電泳圖譜（10%分離膠，5%濃縮膠） 從圖 2 可看出，樣品 1 和樣品 2 中蛋白質(zhì)組分得到較好的分離，出現(xiàn)比較 明顯的條帶，中間所加標(biāo)準(zhǔn)品的量太少，沒有顯示出條帶。從這次的實驗結(jié)果 可知，樟樹籽中蛋白質(zhì)的分子量大約在 30200 kdal 之間。 4 4 結(jié)論結(jié)論 通過實驗可以得到以下結(jié)論： 1) 通過對樟樹籽脫

36、脂，然后采用稀鹽溶液所得產(chǎn)品通過茚三酮反應(yīng)證明是 蛋白質(zhì)，采用醇溶法提取的產(chǎn)品也用該方法證明是蛋白質(zhì)。提取的蛋白 質(zhì)濃度分別為：1 3 5 7 9 11 13 ，等電點為 1。 2) 經(jīng)過初步的 sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗，結(jié)果表明提取所得蛋白質(zhì)的 相對分子質(zhì)量大約在 30200kdal 范圍內(nèi)。 參考文獻參考文獻 1 李建武.生物化學(xué)試驗原理和方法m .北京:北京大學(xué)出版社,1994. 2 李剛.生物化學(xué)，北京： 科學(xué)技術(shù)文獻出版社，2010. 3 陳鈞輝. 生物化學(xué)實驗（第三版）.科學(xué)出版社，2002. 4 李娜，楊濤我國油菜籽產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢展望j農(nóng)業(yè)展攀，2009(2)：19-

37、21 5 韓喜秋我國油菜生產(chǎn)現(xiàn)狀、問題及對策j現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2003(12)：34-35 6 章紹兵，王璋水酶法從菜籽中提取油及水解蛋白的研究jl農(nóng)業(yè)工程學(xué)報， 2007，23(9)：213-218 7 陳剛，彭建菜籽餅粕抗?fàn)I養(yǎng)因子研究進展j畜禽 lz 業(yè)，2001(1)：14-16 8 楊國燕，陳棟梁菜籽分離蛋白及菜籽蛋白肽的功能特性研究j食品科學(xué)， 2007，28(1)：76-78 9 何忠效.電泳m.143-155,科學(xué)出版社,1990 年 10 galati em, monforte mt, kirjavainen s, forestieri am, trovato a, tripodo

38、mm (november 1994). biological effects of hesperidin, a citrus flavonoid. (note i): antiinflammatory and analgesic activity. farmaco 40 (11): 70912. 11 loscalzo lm, wasowski c, paladini ac, marder m (february 2008). opioid receptors are involved in the sedative and antinociceptive effects of hesperi

39、din as 樣品 2樣品 1樣品 2樣品 1 well as in its potentiation with benzodiazepines. eur. j. pharmacol. 580 (3): 30613. 12 王車禮，史美仁. 菜籽粕脫毒提取菜籽蛋白研究進展j . 中國油脂， 1997，22（2）：36- 40. 13 秦剛，周錦蘭. 菜籽餅雙液相萃取脫毒j . 飼料工業(yè)，2005，26（23）：23- 28. 14 gillberg， tonell. removal of phytic acid protein phyticacid internations in rapese

40、ed j . agric. food - chem，1984，32：38- 40. 15 何國菊，李學(xué)剛，趙海伶. 菜籽餅粕中植酸新提取方法研究 j . 中國糧油 學(xué)報，2004，19 （1）：58- 60. 16 王車禮，史美仁. 菜籽粕脫毒與菜籽濃縮蛋白制取 j .中國油脂，1997，12（ 2 ） ：56- 58. 17 elzbieta dtuzewska， stanistaw gwiazda， krzysztofleszczynski. influence of membrane processing on functionalproperties of rapeseed prote

41、in preparations j . polish 18 journal of food and nutrition sciences，2000，50（2）：35- 39. 致謝致謝 本課題在選題及研究過程中得到李衛(wèi)林老師的悉心指導(dǎo)，并幫助我開拓研 究思路，讓我學(xué)到了對于科學(xué)實驗嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度。大學(xué)時光雖然僅歷時三載，卻使 我終生受益。感謝馬森老師、李碧嬋老師、賈曉麗老師、張劍老師、劉金仙老 師等對我的教育培養(yǎng)和精心教導(dǎo)。同時也感謝學(xué)院為我提供良好的做畢業(yè)論文 的環(huán)境。 最后再一次感謝在畢業(yè)論文中曾經(jīng)幫助過我的所有老師和同學(xué)，以及在設(shè) 計中被我引用或參考的論著的作者。 武夷學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文）任務(wù)

42、書武夷學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文）任務(wù)書 2008 屆屆 茶茶學(xué)學(xué)與與生生物物 系系 生生物物技技術(shù)術(shù)及及應(yīng)應(yīng)用用 專專業(yè)業(yè)（班班級級） 學(xué)生姓名學(xué)生姓名林開鵬學(xué)學(xué) 號號20082501015 課題名稱課題名稱 樟樹籽蛋白質(zhì)的提取與分析 一、畢業(yè)設(shè)計（論文）的主要任務(wù)一、畢業(yè)設(shè)計（論文）的主要任務(wù) 1.搜集資料（不得少于 10 篇） ，準(zhǔn)備資料 2.試探性實驗 3.資料整理分析、論文撰寫.撰寫論文，論文要求 5000 字以上，要求內(nèi)容正確，論證嚴(yán)密合理， 層次清楚。 二、畢業(yè)設(shè)計（論文）的要求（含成果反映形式）二、畢業(yè)設(shè)計（論文）的要求（含成果反映形式） 1. 查閱資料不得少于 10 篇 2. 論文要

43、求 5000 字以上，要求內(nèi)容正確，論證嚴(yán)密合理，層次清楚 三、進度計劃及指導(dǎo)安排三、進度計劃及指導(dǎo)安排 2011 年 5 月 05 日2011 年 5 月 12 日 搜集資料 2011 年 5 月 12 日2011 年 5 月 31 日 資料刪選，實驗 2011 年 6 月 1 日2011 年 6 月 5 日 整理資料、論文撰寫 任務(wù)書審定日期：任務(wù)書審定日期： 2011 年年 6 月月 5 日日 指指導(dǎo)導(dǎo)教教師師 （簽字）（簽字）李衛(wèi)林 任務(wù)書批準(zhǔn)日期：任務(wù)書批準(zhǔn)日期： 2011 年年 5 月月 5 日日 教研室主任（簽字）教研室主任（簽字） 任務(wù)書下達日期：任務(wù)書下達日期： 2011 年

44、年 5 月月 5 日日 學(xué)學(xué) 生生 （簽字）（簽字） 注：本表在所報課題審查批準(zhǔn)后由指導(dǎo)教師填寫（a4 紙雙面打印一式兩份） ，經(jīng)教研室主任審閱簽字， 一份下達給學(xué)生，一份交院系備查。 武夷學(xué)院本科畢業(yè)設(shè)計（論文）開題報告武夷學(xué)院本科畢業(yè)設(shè)計（論文）開題報告 學(xué)生姓名學(xué)生姓名林開鵬專業(yè)（班級專業(yè)（班級）08 生物技術(shù)及應(yīng)用 課題名稱課題名稱 樟樹籽蛋白質(zhì)的提取與分析 一、本課題的研究背景、意義，在國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢，尚待研究的問題一、本課題的研究背景、意義，在國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢，尚待研究的問題 二、完成任務(wù)的研究思路和方案二、完成任務(wù)的研究思路和方案 三、需要的主要儀器和設(shè)備等

45、三、需要的主要儀器和設(shè)備等 四、四、課題工作的總體安排及進度課題工作的總體安排及進度 2011 年 5 月 05 日2011 年 5 月 12 日 搜集資料 2011 年 5 月 12 日2011 年 5 月 31 日 資料刪選，實驗 2011 年 6 月 1 日2011 年 6 月 5 日 整理資料、論文撰寫 五、指導(dǎo)教師評語五、指導(dǎo)教師評語 指導(dǎo)教師簽名： 20112011 年 月 日 六、院系意見：六、院系意見： 院系（蓋章） 年 月 日 說明：開題報告應(yīng)在教師指導(dǎo)下由學(xué)生獨立撰寫。在畢業(yè)論文（畢業(yè)設(shè)計）開始二周內(nèi)完成，交指導(dǎo)教師 審閱，并接受學(xué)校和院系檢查。 武夷學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文）中期檢查表武夷學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文）中期檢查表 武夷學(xué)院畢業(yè)設(shè)計武夷學(xué)院畢業(yè)設(shè)計 ( (論文論文) )指導(dǎo)教師評分表指導(dǎo)教師評分表 茶學(xué)與生物 系系 2008 屆屆 生物技術(shù)及應(yīng)用 專專業(yè)業(yè)、班班 級級 學(xué)生姓名學(xué)生姓名林開鵬學(xué)學(xué) 號號 20082501015 課題名稱課題名稱 樟樹籽蛋白質(zhì)的提取與分析 指導(dǎo)教師評語：指導(dǎo)教師評語： 指導(dǎo)教師（簽名）：指導(dǎo)教師（簽名）： 2011 年年 6 月月 8 日日 可否提交