長春堿的提純及其衍生物合成研究進展

1、上海應用技術學院研究生課程（論文類）試卷2 015 /2 016 學年第 一 學期課程名稱： 高等天然產物化學 課程代碼： NX0702013 論文題目： 長春堿的提純及其衍生物合成研究進展 學生姓名： 孫貴救 專業(yè)學號： 制藥工程 156061423 學院： 化學與環(huán)境工程學院 課程（論文）成績：課程（論文）評分依據（必填）：1. 論文結構規(guī)范，檢索的文獻資料經認真的綜合分析整理，選材精簡得當，條理清晰，語言流暢，版面整潔美觀。得分為90-100分。2. 論文結構較規(guī)范，檢索的文獻資料經分析整理，材料組織得當，條理清晰，語言流暢。得分為80-89分。3. 論文結構基本規(guī)范，內容有小問題，檢索

2、的文獻資料經一般性分類整理，條理較清晰，得分為70-79分。4. 論文結構基本規(guī)范，內容未經認真整理，一般性羅列所檢索的文獻資料。得分為60-69分。5. 達不到上述第4點要求的論文，得分為0-59分。任課教師簽字： 日期： 年 月 日長春堿的提純及其衍生物合成研究進展學生：孫貴救 （教師：肖繁花）（上海應用技術大學化學與環(huán)境工程學院）摘 要：利用溶劑法提取長春堿,并通過柱色譜法進一步純化長春堿,采用正交試驗法優(yōu)化其工藝,通過紫外分光光度法檢測其相對含量,結果顯示利用溶劑法提取的長春花生物堿含量高,效果好。關鍵詞：長春堿；提??；純化；柱色譜法Studies on the extraction

3、purification and derivatives synthesis of VinblastineStudent: Sun GuiJiu（Faculty Adviser: Xiao FanHua）（Department of Chemistry and Chemical Engineering ,Shanghai institude of Technology University）Abstract : Clethodim is a kind of new dry postemergence herbicides, Vinblastine was extracted from atha

4、ranthus roseus and further purified by olumnhrom atography.Orthogonal test was employed to optimize the extraction process.The content of vinblastine in the extraction was determined with ultraviolet spectrophotometry,The results show that solvent method is efficient,the content of extracting vinbla

5、stine from atharanthus roseus is high and the effect is good.Keywords : vinblastine;extraction;purification;olumnhromatography1前言長春花又名雁來紅、日日新、四時春、三萬花，是夾竹桃科植物長春花的全草，長春堿(vinblastine)是從長春花中提取的一種二聚吲哚類生物堿。長春堿,可用于抗癌、降壓,尤其是其抗癌作用受到人們的重視并應用于臨床。長春堿與醛基長春堿等,能夠降低脫氧核糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)及蛋白質的合成,抑制癌細胞的有絲分裂,使細胞分裂停止在中期

6、,因而腫瘤細胞不能增值。長春堿在長春花中的含量約為萬分之四,可用于治療白血病、何杰金氏病、淋巴肉瘤,對乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、單核細胞白血病均有一定療效。對網狀細胞肉瘤、腎母細胞瘤、惡性黑色素瘤也有效,并被若干國家藥典所收載。長春堿類抗腫瘤藥物屬于雙吲哚類生物堿,即由吲哚(上半部分的長春質堿環(huán))和雙氫吲哚(下半部分的文多靈環(huán))通過C15-C18連接構成。均含有3個叔胺基、1個仲胺基,呈弱堿性。它們都易溶于氯仿、乙醇等有機溶劑,不溶于水;藥用為水溶性硫酸鹽。本文利用溶劑法提取長春堿,并通過柱色譜法進一步純化長春堿。除此之外，自證實此類化合物具有抗腫瘤活性1以來，現(xiàn)已正式用于臨床的有長春堿（vin

7、blastine）、長春新堿（vincristine）、長春地辛（vindesine）及長春瑞賓（vinorelbine）。處于臨床研究的還有長春氟寧（vinflunine）、長春甘酯（vinglycinate）及脫水長春堿（anhy-drovinblastine）。2 抗腫瘤機制長春堿具有抗腫瘤作用,主要用于何杰金氏病、絨毛膜癌(對氨甲蝶呤已產生抗藥者,則需用較大劑量);此外,對淋巴肉瘤、蕈樣霉菌病(Mycosis fungoides)、白血病、橫紋肌軟骨瘤、黑色素瘤、精母細胞瘤、畸胎瘤、星形細胞瘤、肉織細胞肉瘤、癌(胸、肺、口腔、胃、結腸、直腸、卵巢、頸部、子宮、膀胱、腎等部位)等的抗腫瘤

8、作用還需進一步肯定。療效出現(xiàn)較快,用藥后3d內腫瘤明顯縮小或發(fā)熱消退,但緩解期較短,有的在用維持量或停藥后23周又趨復發(fā)。對實驗性腫瘤的作用如下:對DBA/2小鼠的移植性淋巴細胞白血病P-1534有顯著治療效果,可以延長小鼠的生存時間,但很少獲“治愈”。對DBA/1小鼠乳房腫瘤有明顯抑制作用。在臨床上對乳腺癌有一定的治療效果。長春堿對小鼠白血病L1210、小鼠移植性淋巴細胞白血病P-1534、AKP-白血病、大鼠W258、IRC741/1398白血病、小鼠肉瘤S180、艾氏腹水癌和移植性及自發(fā)性乳腺癌都有實驗治療作用,并可防止AKP小鼠的自發(fā)性白血病,能使患IRC741白血病的Fisher大鼠

9、血流中存在的瘤細胞迅速消失。長春堿的作用機制與秋水仙堿相似,能抑制腫瘤細胞如艾氏腹水癌、腹水癌L1210和人的單核細胞性白血病以及正常動物骨髓細胞的有絲分裂,使停止于中期。長春堿能干擾微管蛋白的合成,從而阻止微管蛋白裝配成有功能的紡錘絲。與秋水仙堿不同之處為該抑制作用較強,且可被谷氨酸和色氨酸所對抗。早期的體外實驗未能證明長春堿于治療濃度下對DNA和RNA的合成有明顯影響,但后來的體內實驗發(fā)現(xiàn)艾氏腹水癌小鼠給長春堿(2mg/kg)一劑,即能減少3H-尿嘧啶核苷摻入癌細胞的RNA。體外實驗如果藥物與艾氏腹水癌細胞一起較長時間(1h)溫育后,3H-尿嘧啶核苷摻入RNA亦顯著被抑制,于210-4M

10、即產生明顯抑制,且被大劑量谷氨酸所對抗。對大鼠瓦克肉瘤,長春堿能明顯抑制3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入DNA,對瘤細胞核仁的DNA合成的抑制作用比非核仁的DNA要強。近有報道長春堿能抑制艾氏腹水癌細胞的DNA依賴性RNA聚合酶，總的來說，研究表明長春堿類藥物可干擾細胞周期的有絲分裂階段（M期），從而抑制細胞的分裂和增殖。其細胞毒性是通過與微管蛋白的結合實現(xiàn)的，它們在微管蛋白二聚體上有共同的結合位點，可抑制微管聚合，妨礙紡錘體微管的形成，從而使分裂于中期停止，阻止癌細胞分裂增殖23 長春堿的提取及純化3.1 長春堿的提取法長春堿的提取方法主要有生物技術提取法，超臨界流體萃取法，溶劑提取法這三種，提取

11、方式的優(yōu)劣各有不同。3.1.1生物技術提取法目前主要從天然植物中提取長春堿，但它們在植物中的含量極低，而化學合成法和半合成法的制備效果也不太理想。為了更有效地生產長春花生物堿，科學工作者正致力于將生物技術應用于長春花的研究與開發(fā)。組織培養(yǎng)：張秀省等3以長春花葉和子房誘導的愈傷組織為材料，進一步通過化學誘變得到2種變異細胞株，并對4種不同愈傷組織的生長以及吲哚生物總堿、阿瑪堿、長春質堿的生物含量進行了分析比較，期望為今后長春花細胞工業(yè)化生產藥物的開發(fā)提供比較理想的細胞株。細胞工程：用不同質量濃度的乙烯利、乙酰水楊酸、色氨酸溶液分別處理溫室盆栽長春花植株，于2d后測定葉片中的總吲哚生物堿含量，并采

12、用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定長春質堿的含量，結果發(fā)現(xiàn)經處理后植株中成分的含量有明顯提高，并確定了最合適的處理質量濃度4。發(fā)酵工程：通過對長春花葉內生真菌進行分離，篩選出1株無孢菌群菌株，并對其發(fā)酵提取物進行薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜（HPLC）法分析，結果表明此菌株能夠產生VCR5真菌易于培養(yǎng)，可以通過育種手段和控制培養(yǎng)條件等措施來大幅度提高其有效成分的含量，便于組織工業(yè)化生產。遺傳轉化工程：遺傳轉化系指利用重組DNA、組織培養(yǎng)或種質系統(tǒng)轉化等技術將外源基因導入植物細胞或組織中獲得轉基因植物的技術。孫敏等6用發(fā)根農桿菌感染長春花，誘導出毛狀根，通過離體培養(yǎng)、株系篩選，提取

13、出了長春堿，為長春花生物堿的工業(yè)化生產和產業(yè)化開發(fā)奠定了基礎，同時也為應用轉化毛狀根技術獲得藥用植物次生代謝產物開辟了一條新的有效途徑。隨著培養(yǎng)技術的改進和合理反應器的設計，以及控制 長春堿、文多靈合成的關鍵酶基因克隆出來并轉化成功，尋求高產的長春花植株或細胞株一定會成為現(xiàn)實?；瘜W誘變：用不同質量濃度的甲基磺酸乙酯（EMS）處理長春花愈傷組織， 挑選成活愈傷組織塊繼代擴大培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn)，用EMS處理的長春花愈傷組織發(fā)生了突變，與對照組相比，不僅生長快，而且總吲哚生物堿含量高7化學誘變是人工獲取突變體常用的手段之一，EMS又是較常用的化學誘變劑，可篩選高產吲哚生物堿的穩(wěn)定細胞系， 并利用細胞工程

14、技術獲取藥用成分。 它有可能成為一種理想的方法。3.1.2 超臨界流體萃取法這方面的研究較少。Stahl等8初步研究了長春堿的超臨界流體萃取，結果表明在壓力為80-200bar（8-20Mpa）、提取溫度40下的萃取效果不佳，N2O萃取效果比CO2稍好。Choi等9研究表明，CO2-甲醇-三乙胺（80:18:2）超臨界萃取能有效地提取長春花草中的長春堿。在80、34Mpa下的萃取率是甲醇萃取的76.4%，而不加夾帶劑或改變其它夾帶劑的條件下萃取率不及甲醇萃取的25%。超臨界萃取無毒、無污染，萃取時間短、能耗低，但需要高壓設備，成本較高，進行大規(guī)模原料萃取的生產條件還不成熟。3.1.3 溶劑提取

15、法醇類溶劑提取法：Kalman10等和Javanovics11將全草用氨水浸潤后再用甲苯提取，但此法會使生藥中的一些中、強生物堿以游離形式被提取出來，導致純化難度加大。隨后改為含水甲醇浸提，再用硫酸酸化，所得生物堿含量比堿水浸取高30-40倍。利用甲醇使得成本降低，也減少了提取步驟，但甲醇極性較大，因此其選擇性不夠理想。醇提取液中含有生物堿及其鹽，尚含大量脂溶性雜質，且稀醇提取液含水溶性雜質，尚需進一步處理。親脂性有機溶劑提取法：由于大多數游離生物堿極性低，可用氯仿、二氯甲烷苯等提取。為了只提取藥材中的弱堿性生物堿，可采用水甚至稀有機酸水代替堿水潤濕藥材，再用有機溶劑提取。長春堿在總生物堿中含

16、量極微，若提出總生物堿后再行分離，不僅操作煩瑣，而且得率極低，故生產上采用藥粉用水濕潤后用苯提取，使大部分堿性較強的生物堿未被提出，這樣有利于進一步純化12。酸水提取法：常用0.5%-1%的乙酸、硫酸、酒石酸等為溶劑。此法提取所得溶液體積較大，濃縮困難，故可配合離子交換樹脂法或有機溶劑萃取法進行處理。Gedeon13等用含少量硫酸的90%的甲醇提取全草，因其等成分可轉化為鹽，更易被甲醇提出，提取率也有所增加。Gunasekera14等將甲醇改為乙酸水溶液提取，再用氨水堿化，最后用二氯甲烷萃取。該法提取率高、步驟簡單、有機溶劑用量少，增加了操作安全性，利于環(huán)保，但提取物中雜質較多，需有成熟的柱色

17、譜方法配合，方可得到高純度產品。酸提液中含有樹脂、 葉綠素等雜質，若堿化后直接用氯仿、二氯甲烷等萃取，易形成乳化層，使VLB(不易被萃取完全；若先用石油醚脫脂，然后堿化再萃取，則乳化現(xiàn)象將大為改觀。長春生物堿對光和熱不穩(wěn)定， 在提取和儲存過程中注意避光與避熱。3.2 長春堿的純化長春堿的主要純化方法為柱色譜法。3.2.1柱色譜法純化法一次過柱：長春堿的柱色譜純化一般是過一次堿性氧化柱，除去極性較低的碳氫化合物及部分中性、酸性物質。氧化鋁用前要經過100-150活化處理，降低含水量，提高活性；但活性也不宜太高，否則產品不易洗脫。所以一般選擇的氧化鋁活性為IV級，含水量為6%-10%。由于長春堿是

18、中極性物質，流動相的極性不宜太高，一般用苯-石油醚15苯-氯仿16、苯-二氯甲烷、二氯甲烷-氯仿、乙酸乙酯-石油醚等以不同的比例梯度洗脫。洗脫液中依序主要含有長春堿，長春次堿和2的混合物，2。利用堿性氧化鋁柱一般可以從碳氫化合物中除去含氧化合物，能完全將僅相差一個基團的長春堿和2分開，但是長春堿難以和異常春堿等一些雜質分離17，此方法目前大規(guī)模生產，缺點是產品的純度不夠。兩次過柱：一次氧化鋁柱色譜往往不能得到較高純度的長春堿，如作為注射劑或者用以制備近年來開發(fā)成功的抗癌作用更強的藥品-長春瑞濱的原料，則均需純度95%的長春堿硫酸鹽。Gunasekera14等采用兩次過柱的方法，將粗提的總生物堿

19、粗品4.6g先經過羥丙基交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex LH20柱，二氯甲烷-甲醇或氯仿-甲醇作流動相，分段收集餾分，含長春堿部分合并濃縮，然后過二次硅膠柱進一步純化，硅膠需經去活處理，用1%-10%甲醇-氯仿梯度洗脫，含長春堿部分蒸除溶劑，在無水乙醇中結晶，得到含量較高的長春堿硫酸鹽。這種方法第一次過柱時所用的固定相價格較貴，且多次使用會造成不可逆吸附，分離效果變差。所以盡量減少污染凝膠。如果能處理好凝膠的再生和保護問題，經濟上也可以，將是一個很好的獲得高純度的長春堿的活化方法。多次過柱：Atta-ur-rahman18等經過3次過柱純化得到高純度長春堿，粗提取的總生物堿先過氧化鋁柱，再過硅

20、膠柱，用制備型HPLC分離，軍用乙酸乙酯-石油醚梯度洗脫，得到最終產物。4 長春堿衍生物的合成研究自1958年加拿大人Noble和Beer19，20等首次分離得到了長春堿至今，由于長春堿類化合物具有的光譜抗癌活性，使得世界各國都熱衷于研究該類化合物的合成和其各種衍生物的合成，以從中篩選到療效更好、毒副作用更低的新型藥物。到目前為止，據已公開的資料統(tǒng)計，人們合成的長春堿類衍生物有數百個之多。而在這其中，已經成為臨床抗癌藥物的有：長春地辛（vindesine）、長春瑞濱（vinorelbine）和長春氟寧（vinflunine）4.1 長春地辛的合成1978年，美國Eli Lilly and Co

21、mpany的Gerzon等人對長春堿的C-3位處的甲酯基進行了修飾，通過氨解或肼解、還原的方法，得到了長春地辛，并對其藥理活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其對急性淋巴細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病有顯著療效。對小細胞及非小細胞肺癌、乳腺癌也有較好療效。長春地辛合成步驟如下圖所示：NH.3.MeOH Vinblastine VindesineN2H4 MeOH Raney Ni Vindesine124.2 長春瑞濱的合成1979年，法國的Potier等人在其已有的研究基礎上，又進一步合成了7-nor-anhydrovinblastine，至1989年，法國Pierre Fabre公司研制成了它的酒石酸鹽

22、，取名長春瑞濱。目前主要用于治療非小細胞肺癌（Non-Small-cell Lung Cancer,NSCLC）。長春瑞濱合成步驟如下圖所示：m-CPBA (CF3CO)2O ,CHCl2THF,H2O Vinorelbine 13 4.3長春氟寧的合成研究繼1989年法國的Pierre Fabre公司將長春瑞濱上市以后，至1997年，法國的Fahy等人又合成了anhydrovinblastine和長春瑞濱的C20位的亞甲基雙氟帶衍生物，其中后者的衍生物就是長春氟寧。目前還在進行后期的臨床實驗，主要用于治療乳腺癌和除罕見的間皮瘤外的非小細胞癌。5 結論 總之利用長春堿制成的藥物已經廣泛用于癌癥

23、的治療，但由于神經系統(tǒng)的毒性和局部刺激性較大的限制了其使用，科學工作者應該加快對長春堿進行更深層次的研究、開發(fā)和利用，以便制成高效低毒的新劑型，并結合臨床實際開發(fā)出更好的藥劑，更好的服務于皇者。參考文獻 Uffelie, O. F. Alkaloids with tumor inhibiting action from catharanthus roscusJ. Pharm weekbl, 1969, 104(16): 321-3302 Zhou, X. J.; Ranmani, R. Prcclinecal pharmacology of vinca alkaloidsJ. Drugs, 1

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