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文檔簡(jiǎn)介
1、天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)天然藥物化學(xué)試驗(yàn)的特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),所用溶劑和試劑品種多,而且用量較大。許多有機(jī)溶劑具有易燃、有毒、腐蝕性,刺激性和爆炸性等特點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中又經(jīng)常需要加熱或減壓等操作,學(xué)生將接觸各種熱源和電器。如果操作不慎,易引起中毒、觸電、燒傷、燙傷、火災(zāi)、爆炸等事故。所以要求每個(gè)實(shí)驗(yàn)操作者,必須加強(qiáng)愛(ài)護(hù)國(guó)家財(cái)產(chǎn)和保障人民生命安全的責(zé)任心,嚴(yán)格遵守操作規(guī)程,樹(shù)立嚴(yán)密的科學(xué)實(shí)驗(yàn)態(tài)度,提高警惕,消除隱患,預(yù)防事故的發(fā)生。為了確保實(shí)驗(yàn)的安全進(jìn)行,特作如下要求:一、實(shí)驗(yàn)前要必須充分預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,明確實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟及注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前應(yīng)檢查儀器是否完整無(wú)損,裝置
2、是否正確,經(jīng)檢查合格后方可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)時(shí)要保持室內(nèi)整齊、清潔、安靜。不準(zhǔn)做與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的事情,不得擅自離開(kāi)崗位。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)密切觀察實(shí)驗(yàn)進(jìn)程是否正常,儀器又無(wú)漏氣,破裂等現(xiàn)象。三、倒取和存放易燃性有機(jī)溶劑時(shí),要遠(yuǎn)離火源。不得隨意將易燃性、易爆性的有機(jī)溶劑及藥品倒入水槽或污水缸內(nèi)。不得在烤箱內(nèi)烘烤留有易燃性有機(jī)溶劑的儀器或物品。四、使用精密儀器及電氣設(shè)備時(shí),應(yīng)先了解其原理及操作規(guī)程,檢查好電路,按操作規(guī)程進(jìn)行。遇到不明了的問(wèn)題應(yīng)及時(shí)向老師請(qǐng)教,切忌自作主張,亂倒以?xún)x器。電線及儀器不應(yīng)放在潮濕處,不要用濕手接觸電器。電器用完后,應(yīng)立即清理,關(guān)好電源。五、回流或蒸餾易燃性有機(jī)溶劑時(shí),應(yīng)檢查冷凝
3、水是否暢通,儀器裝置是否漏氣。不得用明火直接加熱,應(yīng)根據(jù)其沸點(diǎn)選用水浴、油浴或砂浴。蒸餾溶劑時(shí)要加入沸石,否則將發(fā)生爆沸。添加溶劑時(shí)要移開(kāi)水浴,待溶劑冷卻后再加,并應(yīng)重新加沸石。六、實(shí)驗(yàn)室中常用的苯、鹵代苯、苯酚、苯胺、甲醇、二硫化碳、氰化物、汞和鉛鹽等化合物均為有毒或劇毒藥品。人體中毒的途徑一般為消化道、呼吸道或皮膚吸收。所以取用毒劇藥時(shí)要注意切勿灑在容器外,不要接觸皮膚或口腔。室內(nèi)要通風(fēng)良好,產(chǎn)生毒氣的操作應(yīng)在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。毒物及廢液不得隨意亂倒。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁進(jìn)食。七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),應(yīng)將水、電、門(mén)窗關(guān)妥后,方能離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。八、實(shí)驗(yàn)時(shí)一旦不慎起火,應(yīng)沉著冷靜,積極滅火。首先立即切斷實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有
4、電源及火源,搬走易燃易爆物品,同時(shí)針對(duì)起火點(diǎn)情況,選用適當(dāng)滅火器材進(jìn)行滅火。九、急救常識(shí)。(一)外傷:及時(shí)取出傷口中的碎玻璃屑或固體物質(zhì),用蒸餾水沖洗后涂上紅藥水,用消毒紗布包扎。大傷口則先按緊主血管,急送醫(yī)院治療。(二)火傷:輕傷可在傷面涂以硼酸凡士林。重傷則須請(qǐng)醫(yī)生診治。(三)試劑灼傷:1.酸灼傷:立即用大量水沖洗,然后用3%碳酸氫鈉溶液蘸洗。2.堿灼傷:立即用大量水沖洗,然后用1%醋酸溶液蘸洗。實(shí)驗(yàn)一 薄層板的制備、活度測(cè)定及薄層層析、紙層析的應(yīng)用一、 實(shí)驗(yàn)的目的要求:1. 掌握TLC、PC的原理。2. 掌握薄層層析板的制備及薄層層析、紙層析操作的基本方法。了解展開(kāi)劑、吸附劑的選擇以及與
5、被分離物質(zhì)的關(guān)系。3. 應(yīng)用薄層層析法、紙層析法檢識(shí)中藥草中的化學(xué)成分。二、 層析分類(lèi)與應(yīng)用概述中草藥的研究、鑒定工作中,對(duì)探討中草藥中含有哪些化學(xué)成分,如何將中草藥中的有效成分提取、分離、精制,并鑒定結(jié)晶純度等等。除常用的經(jīng)典方法外,仍因中草藥中化學(xué)成分復(fù)雜,許多成分結(jié)構(gòu)類(lèi)似,有效成分含量極少,僅僅采用經(jīng)典方法往往難以達(dá)到分離的目的,所以必須配合各種近代的分離方法,其中常用分離效率高、操作較簡(jiǎn)便的層析分離法(Chromatography)。由于有效成分的類(lèi)型不同、性質(zhì)不同,因此選擇層析法的種類(lèi)也不同??蓞㈤喗炭茣?shū)第二章第二節(jié)層析法的內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)著重介紹薄層層析法(Thin-Layer Chr
6、omatograp-hy,TLC)以及紙層析法(Paper Chromatograp、PC)的應(yīng)用。這些方法主要用于選擇粗提取物的分離條件;化合物純度的鑒定;制備一定量的某些化合物;或在薄層選用不同配比的混合溶劑。吸附層析主要考慮的是展開(kāi)劑的極性;但被分離物質(zhì)在展開(kāi)劑中的溶解度也要影響到它的層析行為。在一種吸附上用多種展開(kāi)劑試驗(yàn)后如果分離不成功,可改用另一種吸附劑來(lái)試驗(yàn)。分離的化合物在板上的比移值(Rf)在0.2-0.8之間為好。二組分之間Rf差值0.05,以免斑點(diǎn)重疊。(展開(kāi)劑選用舉例見(jiàn)教科書(shū)第19頁(yè)表2-8)。在吸附層析中,吸附劑的活度,展開(kāi)劑的極性,被分離物質(zhì)的極性,是層析條件三要素,這
7、三者的關(guān)系是相互聯(lián)系的,見(jiàn)圖。當(dāng)A指向中極性物質(zhì)時(shí),則B就指向選用中等活度的吸附劑,C就指向選用中等極性的展開(kāi)劑。如分別轉(zhuǎn)到ABC的位置,則又是另一種情況。分配薄層層析有些強(qiáng)極性化合物,能被吸附劑強(qiáng)烈吸附,用洗脫能力很強(qiáng)的溶劑仍很難推動(dòng)。這時(shí)就必須選用分配層析。它是利用被分離物質(zhì)在兩相中(如水和非極性有機(jī)溶劑中)分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的目的。分配薄層層析常用的擔(dān)體有硅膠、硅藻土、纖維素等。選擇展開(kāi)劑的根據(jù)是被分離的物質(zhì)在展開(kāi)劑(固定相、流動(dòng)相)中的溶解度相差最大的溶劑組成不同的比例,為首用試劑?;衔镌诹鲃?dòng)相中的溶解度愈大,則它在分配層上移動(dòng)得愈遠(yuǎn),比移值就愈大。流動(dòng)相應(yīng)先用固定相飽和,固定
8、相種類(lèi)有水、不同PH的緩沖溶液、親水有機(jī)相(甲酰胺、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇等)。流動(dòng)相為含固定相(常用如水)的有機(jī)溶劑,有時(shí)為了防止弱酸、弱堿的解離,加入少量的酸和堿。薄層層析展開(kāi)后的斑點(diǎn)檢出,通常先在可見(jiàn)光下觀察,劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置,然后在紫外光分析燈下觀察有無(wú)吸收或熒光斑點(diǎn),并記錄其顏色、位置及強(qiáng)弱,最后利用各化合物的特性反應(yīng),用噴霧器均勻地噴灑適當(dāng)?shù)娘@色劑,使層析譜顯色。各類(lèi)化合物所用的顯色劑見(jiàn)附錄4。絡(luò)合薄層層析在絡(luò)合劑處理的吸附劑上進(jìn)行吸附薄層層析行為時(shí),不飽和化合物(絡(luò)合物的供體)與絡(luò)合劑(金屬離子既絡(luò)合物的受體)形成絡(luò)合物。在層析時(shí)可按照被分離的化合物不飽和度的位置、幾何異
9、構(gòu)等情況,所形成絡(luò)合物的絡(luò)合強(qiáng)度不一,導(dǎo)致比值不同達(dá)到相互分離的目的。飽和脂肪酸不與受體絡(luò)合,推向薄層的最前沿;含雙鍵的比含三鍵的吸附牢;末端雙鍵 或環(huán)外雙鍵比不是這種類(lèi)型的吸附牢。 由于硝酸銀的存在影響一些顯色劑的靈敏度,如碘蒸氣很少用于該法的顯色。有關(guān)絡(luò)合層析各類(lèi)化合物的溶劑系統(tǒng)及顯色劑見(jiàn)附錄4。三、 一般操作技術(shù)(一)薄層層析薄層板的制備1. 不加粘合劑的薄層板涂布法(1) 氧化鋁薄層將吸附劑置于薄層涂布器中,調(diào)節(jié)涂布器的高度,向前推動(dòng),即得均勻薄層。本實(shí)驗(yàn)主要用下述簡(jiǎn)易操作涂布薄層,取表面光滑,直徑均一的玻璃棒一支,依據(jù)所制備薄層的寬度、厚度要求,在玻璃棒套上厚度為0.3-1mm的塑料
10、圈或金屬環(huán),以使玻璃棒向前推動(dòng)時(shí)能保持平行方向,操作時(shí),將氧化鋁粉均勻地鋪在玻璃板上,按下圖所示方式推動(dòng)。2413(2)纖維素薄層,一般取纖維素粉1份加水約5份,在研缸中混合均勻后,倒在玻璃板上,輕輕振動(dòng),使涂布均勻,水平放置,待水分蒸發(fā)至近干,于1002干燥30-60分鐘即得。(3)聚酰胺薄層,取錦綸絲(無(wú)色干凈廢絲即可)用乙醇加熱浸泡2-3次,除去蠟質(zhì)等。稱(chēng)取洗凈得錦綸絲1g,加85%甲酸5ml,在水浴上加熱使溶,再加70%乙醇6ml,繼續(xù)加熱使完全溶解成透明膠狀溶液。將此溶液適量倒在水平放置的、用清潔液洗凈的玻璃片上,并自然向周?chē)鷶倓?,厚度約為0.3mm,薄層太厚時(shí),干后會(huì)裂開(kāi)。將鋪好的
11、薄層水平放在盛溫水的盤(pán)上,使盤(pán)中的水蒸氣能熏濕薄層,盤(pán)子加玻璃板蓋嚴(yán)密。薄層放置1小時(shí)完全固化變不透明白色,再放數(shù)小時(shí)后,再泡在流水中洗去甲酸,先在空氣中晾干,后在烘箱中80恒溫加熱活化15分鐘,冷后置干燥器中貯存?zhèn)溆谩?. 加粘合劑薄層的涂布法(1)硅膠G薄層,取硅膠G或硅膠GF1份,置研缽中加水約5份,研磨均勻,放置片刻,隨即用藥匙取一定量,分別倒在一定大小的玻璃片上(或倒入涂布器中,推動(dòng)涂布)均勻涂布成0.25-0.5mm厚度,輕輕震動(dòng)下玻璃板,使薄層面平整均勻,在水平位置放置,待薄層發(fā)白近干,于烘箱中110烘干活化1-2小時(shí),冷后貯于干燥器中備用?;罨娓蓽囟葧r(shí)間可依據(jù)需要調(diào)整。一般鑒
12、識(shí)水溶性成分或一些極性大的成分時(shí),所用薄層板只在空氣中自然干燥,不經(jīng)活化即可貯存?zhèn)溆?。?)硅膠(H)羧甲基纖維素(CMCNa)薄層,取羧甲基纖維素0.2g,溶于25ml水中,在水浴上加熱攪拌,使完全溶解,倒入研缽中加硅膠細(xì)粉(一般硅膠細(xì)粉過(guò)300目篩的,約6-8g,過(guò)200目篩的,約需10-20g,)研磨成稀糊,照硅膠G薄層涂布法制備薄層?;蛉?塊2.5mm厚度的玻璃長(zhǎng)板,中間夾一至幾塊2.2mm厚的薄層用玻璃片,將適量硅膠糊倒在中間,用藥匙適當(dāng)涂勻,另取一塊邊緣較平整的玻璃片將硅膠糊刮平,推出薄層板,水平放置,自然晾干后再活化貯存。 氧化鋁G薄層、氧化鋁羧甲基纖維素鈉薄層的制備方法同上,一
13、般所需氧化鋁量比硅膠稍多。硅膠燒結(jié)薄層采用硅膠細(xì)粉混合一定量的玻璃細(xì)粉,涂布在玻璃板上,在高溫下將薄層燒結(jié)在玻璃板上,一般薄層厚度0.25mm,薄層用后經(jīng)過(guò)處理,可以多次重復(fù)使用。3.特制薄層的制備根據(jù)分離工作的特殊需要,可制成以下幾種特制薄層。(1)酸、堿薄層和PH緩沖薄層為了改變吸附劑的酸堿性,以改進(jìn)分離效果,可在吸附劑中加入稀酸溶液(如0.1N-0.2N草酸溶液)代替水制成酸性氧化鋁薄層使用。硅膠微呈酸性,可在鋪層時(shí)用稀堿溶液(如0.1N-0.5N氫氧化鈉溶液)代替水制成堿性的硅膠薄層。當(dāng)用乙酸鈉,磷酸鹽等不同PH的緩沖薄層。(2)絡(luò)合薄層硝酸銀薄層的制法,可在吸附劑中加入5-25%硝酸
14、銀水溶液代替水制成均勻糊狀,在按常法鋪成薄層。制成薄層避光陰干,于105活化半小時(shí)后避光貯存。制成的薄層以不變成灰色為好,可保存三天內(nèi)應(yīng)用。也可先把硝酸銀用少量水溶解,再用甲醇稀釋成10%溶液。把預(yù)先制好的硅膠G薄層浸入此溶液中約1分鐘,取出避光陰干按上法活化、貯存。(二)點(diǎn)樣 將樣品溶液滴到已制備好的薄層上,點(diǎn)的直徑不大于2-3mm,樣品滴加在距離薄層一端1-1.5cm的起始線上,點(diǎn)與點(diǎn)之間距離0.5-1cm,展開(kāi)劑用量以浸沒(méi)薄層起始線這邊約為0.5cm的高度的量。 一般定性時(shí)可用普通毛細(xì)管,定量可用微量注射器(1、10、50l)。 樣品溶液應(yīng)盡量選用易揮發(fā)的有機(jī)溶劑,以便點(diǎn)樣后溶劑迅速揮發(fā)
15、,以減少空氣中水分對(duì)吸附劑活度的影響。如果樣品為水溶液或不易揮發(fā)的溶劑,此時(shí)可用電吹風(fēng)或紅外燈加熱,要注意遇熱不要破壞化合物。 點(diǎn)樣量一般為幾到幾十微克。斑點(diǎn)要集中,所以點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)點(diǎn)在原點(diǎn)上,直徑要小。(三)展開(kāi)劑選擇的方法 前面已提到選擇展開(kāi)劑的原則。在實(shí)際工作中大都還要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)而確定合適的展開(kāi)劑。微量圓球技術(shù)(見(jiàn)柱層析)可對(duì)吸附薄層的展開(kāi)劑進(jìn)行初選。好的展開(kāi)劑應(yīng)要求是能把混合物的成分很好的分離。 展開(kāi)劑的質(zhì)量對(duì)于展開(kāi)結(jié)果的影響較大。溶劑要用三級(jí)(CP)或二級(jí)(AR)純規(guī)則的溶劑。或?qū)⒐I(yè)級(jí)的溶劑精制后應(yīng)用。 薄層的展開(kāi)必須在一個(gè)密閉的層析缸中進(jìn)行。層析缸內(nèi)預(yù)先用展開(kāi)劑蒸氣飽和,飽和后才能進(jìn)行
16、展開(kāi)。實(shí)際應(yīng)用小層析缸時(shí)由于空間較小很快達(dá)到了飽和,同時(shí)展開(kāi)時(shí)間短,對(duì)分離效果影響較小。邊緣效應(yīng)不明顯。 常用溶劑性質(zhì)表(附錄3)、共沸混合溶劑表(附錄5)。供選擇展開(kāi)劑時(shí)參考。 展開(kāi)方式最常用的是上行法,它比下行法分離效果好,因展開(kāi)劑移得較慢,除了單向展開(kāi)外,由于單向展開(kāi)第一次展開(kāi)后幾種成分分離得不太開(kāi),經(jīng)過(guò)第二次轉(zhuǎn)向展開(kāi)后,就有可能分得更開(kāi)些。對(duì)成分復(fù)雜和化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的混合物,常用這種雙向展開(kāi)法來(lái)分離。 展開(kāi)時(shí)一般在室溫進(jìn)行。當(dāng)被分離物質(zhì)見(jiàn)光易分解,則應(yīng)用黑布(紙)罩上避光展開(kāi)。 展開(kāi)完畢后,取出薄層板,用鉛筆或小針劃出展開(kāi)劑的前沿位置,待展開(kāi)劑揮散后進(jìn)行斑點(diǎn)檢出。羧甲基纖維素鈉的溶液一般
17、用0.5-1%濃度,宜預(yù)先配制后靜置,取其上層澄清溶液應(yīng)用,則所制備的薄層表面較為細(xì)膩平滑。 鑒定未知成分時(shí)是用已知的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照,書(shū)本上常見(jiàn)的Rf值 都是多次實(shí)驗(yàn)的平均值,只有在基本相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行層析,才能得到相近的Rf值。書(shū)本上的Rf值可以作為一系列化合物在薄層上的相應(yīng)位置以及它們之間分離的難易程度的參考。(四)氧化鋁、硅膠活度的測(cè)定1.氧化鋁活度的測(cè)定:一般可用4-5種偶氮染料以薄層層析法進(jìn)行測(cè)定。(1)染料試劑的配制 取偶氮苯(Azobenzene)60mg,對(duì)甲氧基偶氮苯(Pnethoxyazobenzene),蘇丹黃( Sutdan I Benene-azo-naphthol)
18、,蘇丹紅( Sudan Tetrazo-benzol-naphthel),對(duì)氨基偶氮苯(P-Aminc-azcbenzene)各40mg,分別溶于100ml重蒸的四氯化碳中。(2) 實(shí)驗(yàn)方法 常用制備氧化鋁薄層,以鉛筆尖或毛細(xì)管尖在薄層板一端2-3cm處間隔1cm左右點(diǎn)上5個(gè)可以看清的小點(diǎn),各吸取約0.02ml染料試劑分別點(diǎn)滴于原點(diǎn)上,以四氯化碳為展開(kāi)劑,展開(kāi)時(shí)薄層板與容器底部交角為10-40研究空間。展開(kāi)后測(cè)出各斑點(diǎn)的Rf值,從表確定氧化鋁活度(一般高活度氧化鋁使用本法時(shí),結(jié)果往往偏低)。 另取氧化鋁薄層板一塊,置于水蒸氣飽和的容器2、3小時(shí)后取出,按下述方法測(cè)定活度,觀察有無(wú)變化。表1 氧
19、化鋁活度與偶氮染料Rf值關(guān)系偶氮染料氧化鋁活度純Rf值級(jí)級(jí)級(jí)級(jí)偶氮苯0.590.740.850.95對(duì)甲氨基偶氮苯0.160.490.690.89蘇丹黃0.010.250.570.78蘇丹紅0.000.100.530.50對(duì)氨基偶氮苯0.000.030.080.192.硅膠活度的測(cè)定一般選用三種染料,用薄層層析法進(jìn)行測(cè)定。歐洲藥典1969年記載用0.01%二甲基黃(Methyl-yellow,P-Dimethylaminoazobenzene),蘇丹紅(Sudan),靛酚蘭(Indophenolblue,1,4-Naphoquinone-4-Naphthoq-unione-4-dimethyl
20、 amine aniline)的苯溶液各10l,點(diǎn)滴于硅膠G或硅膠H薄層上,以苯為展開(kāi)劑,展開(kāi)10cm(約20分鐘),三種染料應(yīng)明顯分離。靛酚蘭斑點(diǎn)接近于起始線,二甲基黃斑點(diǎn)在薄層的當(dāng)中,蘇丹紅斑點(diǎn)在靛酚蘭斑點(diǎn)與二甲基黃斑點(diǎn)之間,則認(rèn)為薄層板活性符合要求。3.毛細(xì)管測(cè)定氧化鋁、硅膠活度的測(cè)定法取1.075mm的毛細(xì)管,將毛細(xì)管的一端封閉,另一端開(kāi)口,另取一個(gè)滴帽在底部打個(gè)小洞,將毛細(xì)管開(kāi)口端穿入滴帽內(nèi)部,然后將滴帽內(nèi)充滿(mǎn)吸附劑,輕輕拍打滴帽,使毛細(xì)管很快充滿(mǎn)吸附劑(或似裝測(cè)熔點(diǎn)法加入吸附劑),滴一滴苯在毛細(xì)管開(kāi)口端(目的防止吸附劑從毛細(xì)管中掉出來(lái)),將毛細(xì)管倒轉(zhuǎn),并切掉封尾端,濕端以0.5%適
21、當(dāng)染料的苯溶液中沾一下,直至一滴染料溶液被吸附,然后將毛細(xì)管放入含有幾毫升的苯溶液中,展開(kāi)計(jì)算Rf值,從表中查出活性級(jí)別。染料 對(duì)氨基偶氮苯(P-Aminc-azcbenzene)用于氧化鋁 對(duì)二氨甲基偶氮苯(P-dimethyl-aminc-azcbenzene)用于硅酸。氧化鋁含水量(%)Rf值級(jí)別硅膠含水量(%)Rf值級(jí)別03681000.120.240.460.54036912150.150.220.330.440.550.66國(guó)內(nèi)青島海洋化工廠出售層析用的硅膠在吸附劑名稱(chēng)之后加幾個(gè)字標(biāo)明的意思是:硅膠G(G是Gypsu石膏的縮寫(xiě),表示加了石膏)、硅膠H(H表示不加石膏)、硅膠GF(G
22、F表示加石膏和波長(zhǎng)為254nm顯綠色熒光的硅膠鋅錳)、硅膠GF(GF表示加石膏和波長(zhǎng)為365nm顯黃色熒光的硫化鋅)。氧化鋁則類(lèi)推。四、 薄層層析應(yīng)用實(shí)例(一)定性點(diǎn)滴反應(yīng)1.樣品(1)氨基酸混合液 (2)薄荷油(3)苦參乙醇液 (4)蘆丁甲醇溶液 甘草次酸乙醇液 大黃乙醇液2.檢出試劑(1)三氯化鐵 (2)氨性硝酸鹽 (3)氫氧化鉀(4)茚三酮 (5)碘化鉍鉀 (7)香草醛硫酸(應(yīng)在薄層板或白磁板穴內(nèi)進(jìn)行)3.實(shí)驗(yàn)方法取硅膠CMC-Na薄層板1-2塊或?yàn)V紙片一方條,用軟鉛筆按下圖劃線,將各樣品滴加于相應(yīng)的格子中,再將各試劑分別自空白起逐格滴加試劑,觀察并記錄反應(yīng)變化。具腐蝕性試劑也可用帶穴白
23、磁板,有的檢出在試管中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。試劑樣品(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(1)(2)(3)(4)(二)鑒別中草藥中的化學(xué)成分1. 單向展層例一 (1)硅膠 CMC-Na薄層(載玻片板)(2)樣品 薄荷油 薄荷腦的乙醇溶液(3)展開(kāi)劑 石油醚 乙酸乙酯 石油醚乙酸乙酯(85:15)(4)顯色劑 香草醛硫酸(壓板法)點(diǎn)樣展開(kāi)后,稍干,反扣在一塊同樣大小并已涂布一層顯色劑的玻璃板上,稍稍轉(zhuǎn)一下,連玻璃片反轉(zhuǎn),使薄層面向上,觀察顏色變化。由結(jié)果判斷何種展開(kāi)劑最適合分離薄荷油。例二 (1)硅膠 CMC-Na薄層(載玻片板)(2)樣品龍膽提取物(3)展開(kāi)劑 石油醚 氯仿 甲醇 氯仿丙酮(8:2)
24、氯仿乙酸乙酯甲醇水(35:5:10:0.5)(4)顯色 UV254下觀察由展開(kāi)結(jié)果判斷選用何種展開(kāi)劑最為合適。香草醛硫酸為1g香草醛溶于100ml濃硫酸,或0.5g香草醛溶于100ml硫酸乙醇(4:1)中,噴灑時(shí)須加熱至120觀察顏色變化。2. 雙向展層 (1)硅膠CMC-Na薄層板(88cm),不活化,在薄層板距兩邊各1.5cm交點(diǎn)的地方點(diǎn)樣品。(2)樣品 混合氨基酸(精氨酸、脯氨酸、亮氨酸的1%水溶液)。(3)展開(kāi)劑 第向?yàn)檎〈即姿崴?:1:1)(V/V) 第向?yàn)楸椒铀?5:25) (W/W)第向展開(kāi)劑展層后,加熱風(fēng)使溶劑揮發(fā),再將樣品已展層的一向作起始線,在第向溶劑系統(tǒng)中展層。(4
25、)顯色劑 0.2%茚三酮乙醇液,噴灑后,以電吹風(fēng)加熱(60-100)顯色,觀察各斑點(diǎn)的顏色變化。最后噴灑2%硫酸鎳水溶液顯色。3.硝酸銀硅膠薄層(1)硝酸銀硅膠糊的制備:用20g硅膠G和55ml水中含5g硝酸銀(8%)的溶液調(diào)制成,按常法鋪成板(47cm、約30塊)。避光陰干后,于105活化半小時(shí)避光貯存?zhèn)溆?。?)樣品 轉(zhuǎn)化后的細(xì)辛醚粗品(3)展開(kāi)劑 環(huán)己烷醋酸乙酯(1:1或7:3)(4)顯色點(diǎn) 將薄層板展層后置紅外燈下加熱使其出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)檢出。(三)原位反應(yīng)薄層本法使直接在薄層上進(jìn)行有機(jī)反應(yīng)。先將樣品滴加在薄層板上,然后再滴上試劑進(jìn)行反應(yīng),再用適當(dāng)?shù)娜軇┱归_(kāi)反應(yīng)物。有時(shí)先在試管內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。
26、而后在薄層板上進(jìn)行層析檢識(shí)。根據(jù)原來(lái)化合物的Rf值、再聯(lián)系反應(yīng)產(chǎn)物的層析行為、Rf值,可供鑒別一個(gè)化合物或者提供鑒定一個(gè)化合物極有價(jià)值的線索。應(yīng)用這些特殊反應(yīng)只消耗未知物極微量的樣品卻提供了大量的有關(guān)結(jié)構(gòu)鑒別的情報(bào),操作簡(jiǎn)單。如氧化、還原、脫水、水解、鹵代、酶的催化作用、酯化、硝化、衍生物的制備、混合反應(yīng)等均可在薄層板上進(jìn)行。1.酯化反應(yīng)(1)取原兒茶酸乙醇溶液,在薄層上點(diǎn)加兩個(gè)相同樣點(diǎn),其中一份點(diǎn)在原點(diǎn)上,再點(diǎn)加試劑:醋酐吡啶(3:1),待溶劑揮散,再重復(fù)點(diǎn)加試劑幾次,干后,以氯仿丙酮(8:2)展層,(用碘蒸氣熏顯色,可見(jiàn)其中點(diǎn)加醋酐吡啶試劑的樣點(diǎn)已展開(kāi)在前,而未加試劑的樣點(diǎn)仍近起始線)。(
27、2)取原兒茶酸乙醇溶液,在同一薄層上點(diǎn)加兩個(gè)相同樣點(diǎn),其中一份樣點(diǎn)在原點(diǎn)上,再點(diǎn)加醋酐吡啶(3:1),待試劑揮發(fā)后,再重復(fù)點(diǎn)加試劑數(shù)次,用氯仿丙酮(8:2)展層。用2,4二硝基苯肼顯色。2.成鹽反應(yīng)取原兒茶酸乙醇溶液,在同一薄層板上的起始線上點(diǎn)加兩個(gè)相同樣點(diǎn),其中一份樣點(diǎn)在原點(diǎn)上,再點(diǎn)加10%碳酸氫鈉溶液(另一份不加),以氯仿丙酮甲醇(8:2:1)展層,并用三氯化鐵乙醇溶液噴霧顯色,可見(jiàn)其中點(diǎn)加碳酸氫鈉的樣點(diǎn)的Rf值已有明顯變化,未加堿的樣點(diǎn)照常展開(kāi)。3. 苯腙反應(yīng)取原兒茶酸乙醇溶液,在同一薄層上點(diǎn)加兩個(gè)相同樣點(diǎn),其中一份樣點(diǎn)在原點(diǎn)上,再點(diǎn)加2,4二硝基苯肼試劑,給以熱風(fēng)以促進(jìn)成腙反應(yīng),然后以
28、氯仿丙酮(8:2)展層,可見(jiàn)出現(xiàn)兩個(gè)棕紅色斑點(diǎn)。在紅棕色斑點(diǎn)下,再?lài)娨匀然F試劑,又出現(xiàn)紫藍(lán)色斑點(diǎn)。上面的紅色斑點(diǎn)是原兒茶醛與2,4二硝基苯肼所形成的,下面的紫藍(lán)色斑點(diǎn)是剩下的部分未成腙的原兒茶醛。 由原位反應(yīng)的結(jié)果判斷原來(lái)化合物的結(jié)構(gòu)上有何基團(tuán)特征?并繪出圖譜。五、 紙層析原理、一般操作及運(yùn)用紙層析是以濾紙為支持劑,樣品點(diǎn)樣后在固定相與流動(dòng)相通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展開(kāi)。被分離物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的層析方法。 展開(kāi)劑選擇與分配薄層層析類(lèi)似。被分離物質(zhì)在展開(kāi)劑系統(tǒng)中Rf值在0.05-0.85之間,兩個(gè)化合物之間Rf值之差最好大于0.05。單個(gè)化合物的Rf值最好在0.4-0.6之間。
29、一般操作按展開(kāi)劑展開(kāi)劑展開(kāi)方向可分為上行、下行、徑向。上行法又分為單向、雙向。點(diǎn)樣用的毛細(xì)管應(yīng)細(xì)些使點(diǎn)樣斑點(diǎn)呈小圓形,直徑在2-3mm。點(diǎn)樣濃度、數(shù)量不宜過(guò)大,防止斑點(diǎn)拉長(zhǎng)、Rf值偏低。可用標(biāo)本缸展開(kāi),必須使缸內(nèi)為展開(kāi)劑飽和后再將濾紙放入(展開(kāi)劑用量以浸沒(méi)濾紙起始線一邊約為1cm高度的量)展開(kāi)。展開(kāi)完畢,取出,溶劑前沿用鉛筆劃線作記號(hào),濾紙陰干后斑點(diǎn)檢測(cè),除了不可用腐蝕性顯色劑外其余同薄層層析。應(yīng)用在中草藥化學(xué)成分的定性點(diǎn)滴反應(yīng)同薄層層析(腐蝕性酸不可在濾紙上檢出) 苯胺鄰苯二甲酸試液為苯胺0.93g和鄰苯二甲酸1.66g溶于100ml正丁醇(用水飽和)中。鑒別中草藥中化學(xué)成分5%NaOH5%
30、NaCO3/5%NaOH PH9 PH8 PH5 1.5cm 2.0cm第一 混合單糖的PC(1) 層析濾紙按纖維長(zhǎng)絲方向(縱向)切成適當(dāng)大小的紙條,在一端2cm處用鉛筆劃一條線為起始線,在起始線上點(diǎn)樣,點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑小于0.3cm,點(diǎn)之間間距1-1.5cm。(2)樣品:2.5%葡萄糖,鼠李糖混合水溶液。(3)展開(kāi)劑:正丁醇醋酸水(4:1:1或4:1:5上層)。(4)顯色劑:鄰苯二甲酸苯胺試劑,噴霧后于105,加熱10分鐘。第二 多緩沖液和堿液紙層析(1)緩沖濾紙的制備:取新華濾紙(312cm)一張,距下端2cm處劃一起始線,向上每隔1.5cm劃一平行線按右圖在各條帶上涂布PH緩沖液和堿液,然后
31、將其夾在兩片濾紙中吸至半干使?jié)駶?rùn)指數(shù)為1.5(指濕濾紙為干濾紙重的1.5倍)備用。(2)樣品:大黃素,大黃素甲醚,蘆薈大黃素,大黃酸的氯仿溶液(3)展開(kāi)劑:氯仿(4)顯色劑:熒光檢出;氨熏(5)結(jié)果:記錄圖譜,并說(shuō)明這些化合物酸度的強(qiáng)弱。涂緩沖溶液時(shí),PH順序相反會(huì)怎樣?附PH緩沖溶液的配制:PH3:取0.2M磷酸氫二鈉溶液4.1ml加0.1M檸檬酸15.89ml配成。PH5:取0.2M磷酸氫二鈉溶液10.30 ml加0.1M檸檬酸9.70ml配成。PH8:取0.2M磷酸氫二鈉溶液19.45 ml加0.1M檸檬酸0.55ml配成。PH9.9:取0.1M碳酸鈉溶液5ml加0.1M碳酸氫鈉5ml配
32、成。0.2M磷酸氫二鈉溶液含35.61g/L0.1M檸檬酸溶液含21.01 g/L0.1M碳酸鈉溶液含28.62 g/L0.1M碳酸氫鈉溶液含8.40 g/L六、參考文獻(xiàn)1、上海藥物研究所 中草藥有效成分的提取和分離 上海人民出版社2、中國(guó)醫(yī)科學(xué)院藥物研究所 薄層層離及其在中草藥分析中的應(yīng)用科學(xué)出版社3、北京醫(yī)學(xué)院等 中草藥成分分析 人民衛(wèi)生出版社實(shí)驗(yàn)二 洋金花生物堿的提取分離洋金花又稱(chēng)山茄花、曼佗羅花、馬蘭花等。洋金花為茄科曼佗羅屬植物白曼佗羅(Datura metel L)及毛曼佗羅(Dinnoxia Miu)的花。所含成分主要有東莨菪堿、莨菪堿等。 本草綱目中記載:諸風(fēng)及寒濕腳氣,煎湯洗
33、之。又主驚厥及脫肛,并入麻藥?,F(xiàn)代民間用于止咳平喘、解痙止痛作用,還用于外科手術(shù)麻醉劑。一、 實(shí)驗(yàn)的目的要求1. 掌握莨菪堿、東莨菪堿的提取分離方法。2. 掌握生物堿的一般理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系。3. 掌握生物堿及其鹽類(lèi)溶解度規(guī)律及其應(yīng)用。4. 掌握反流分布法(CCD)的原理及基本操作。5. 掌握紙層析及沉淀反應(yīng)在生物堿檢識(shí)中的應(yīng)用。二、 洋金花中已知成分的理化性質(zhì)1. 東莨菪堿(Scopolamine、 Hyosine)為黏稠的液體,其一分子水合物為針狀結(jié)構(gòu),熔點(diǎn)59,溶于冷水(1:95),易溶于熱水、乙醇、乙醚、氯仿或酮中,難溶于苯、石油醚中。堿性較弱,Pka=7.50。被堿水解時(shí),
34、生成異東莨菪醇和(一)莨菪酸。2. 莨菪堿(Hyoscyamine)為四角針晶,熔點(diǎn)108.5,-210(乙醇)難溶于堿水(1:281),能溶于苯(1:150)、醚(1:69),易溶于氯仿(1:1)及醇和稀酸中。莨菪堿在光、熱和堿的作用下,易消旋化成阿托品。與酸水或堿水共熱時(shí),則極易水解,生成莨菪醇和(一)莨菪酸。三、 生物堿的提取分離1. 原理利用脂溶性生物堿在酸性條件下成鹽后,溶于水不溶于極性小的有機(jī)溶劑,在堿性條件下成游離生物堿,溶于極性小的有機(jī)溶劑,不溶于水,反復(fù)處理,籍以使脂溶性的莨菪堿和東莨菪堿與雜質(zhì)分開(kāi)。2. 工藝 洋金花(磋碎)10g 置100ml燒杯中,加水80ml,用濃鹽酸
35、調(diào) PH為2左右,浸泡24小時(shí),過(guò)濾。濾液留5-7ml(A)做生物堿沉淀反應(yīng) 用濃氨水堿化至PH8-9,分別用氯仿20、 15、15ml振搖提取三次。 氯仿液 水液留取15ml(B)供層析用 其余氯仿液 回收氯仿總堿(C)注:1 PH8-9足可以使莨菪堿和東莨菪堿游離,切不可使PH值過(guò)高,以盡量減少生物堿的水解速度。此步操作最好是先將溶液和氯仿加入分液漏斗中,然后再堿化,振搖,以減少生物堿在堿水中的停留時(shí)間。2 振搖時(shí)注意防止乳化,不宜做猛烈振搖,以適度旋轉(zhuǎn)式萃取為以宜,一旦乳化,可用加熱或用玻璃棒摩擦容器內(nèi)壁,以破壞乳化層,3 所得總堿(C)用5ml氯仿(預(yù)先已用PH6.5緩沖液飽和)分次沖
36、洗轉(zhuǎn)移到小錐形瓶中,供分離用。3.莨菪堿和東莨菪堿的分離(1)分離條件的考察取一條155cm層析濾紙,用鉛筆劃出起 始線(距底端2cm)、垂直于起始線再劃三條縱線,將濾紙分四等分(如圖2-1)。用棉球蘸取不同的PH緩沖液,依次(按PH5、6.5、7.5、9)的順序,涂布于濾紙條帶上,涂布操作要求均勻、快速、盡量減少緩沖液向鄰近區(qū)間擴(kuò)散。涂畢,將濕濾紙夾于兩張干濾紙之間,吸取多余的水分。然后用毛細(xì)管取總堿溶液圖2-1(B),點(diǎn)于各條的原點(diǎn)處以水飽和過(guò)的氯仿展開(kāi)5-10cm,取出,以改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色。記錄各種PH條件下的Rf值,并據(jù)此選擇分離這兩種生物堿的適宜PH值。(2)CCD法操作方法
37、 取三支小分液漏斗,分別編號(hào),每只內(nèi)盛PH6.5的緩沖溶液或PH6.5的水(它們要和流動(dòng)相相互飽和)5ml,然后將總堿(C)的氯仿溶液5ml轉(zhuǎn)入第一個(gè)分液漏斗中,振搖,分層,然后將氯仿層再轉(zhuǎn)移到第二部分分液漏斗中,此時(shí),第一個(gè)分液漏斗加入新的流動(dòng)相氯仿(用緩沖溶液飽和過(guò)的)。二個(gè)漏斗分別振搖,分層轉(zhuǎn)移。分別將第一、二漏斗中的流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到第二、三個(gè)漏斗中,那么第一個(gè)漏斗中再加新的流動(dòng)相氯仿5ml,再振搖,如此完成了CDD基本操作。以后的操作繼續(xù)同上轉(zhuǎn)移,但在第一個(gè)漏斗中不再加入新的流動(dòng)相。從第三個(gè)分液漏斗轉(zhuǎn)移出的流動(dòng)相放入收集瓶中,如此進(jìn)行三次,即可得到三個(gè)氯仿相及三個(gè)水相。 流動(dòng)相(氯仿)(分
38、液漏斗)固定相(PH6.5緩沖液) 收集瓶圖2-2四.生物堿的檢識(shí)1. 生物堿的沉淀反應(yīng)取洋金花酸水液(A)每份1ml,置于試管中,分別滴加下列各試劑2-4滴,觀察并記錄有無(wú)沉淀產(chǎn)生及顏色變化。(1)碘化鉍鉀試劑(2)硅鎢酸試劑(3)苦味酸試劑(樣品液需調(diào)至中性)(4)鞣酸試劑2.薄層層析硅膠吸附劑硅膠G薄板展開(kāi)劑氯仿:甲醇(8:2)樣品:3個(gè)水相,3個(gè)氯仿相,總生物堿(B)對(duì)照品:東莨菪堿氯仿液 莨菪堿氯仿液顯色劑:改良碘化鉍鉀記錄:薄層層析圖譜,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明:總堿中含有何種生物堿,哪種含量高些?CCD法中東莨菪堿和莨菪堿各集中于哪些符號(hào)中?該分離結(jié)果與其紙層析值的大小有何相關(guān)性?五.
39、預(yù)習(xí)要求及思考題:1. 預(yù)習(xí)要求充分預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)提綱,領(lǐng)會(huì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的操作方法及其原理,并能初步判斷其可能出現(xiàn)的結(jié)果。結(jié)合教材有關(guān)內(nèi)容:(1)生物堿及其鹽類(lèi)溶解度的規(guī)律及其在提取分離工作中的應(yīng)用,(2)CCD法的原理及操作,它與PPC的關(guān)系。2. 思考題(1)莨菪堿與東莨菪堿的堿性何者較強(qiáng)?試在理論上進(jìn)行解釋?zhuān)⑻岢鰧?shí)驗(yàn)根據(jù)。(2)CCD法的基本原理是什么?怎樣加入樣品?怎樣轉(zhuǎn)移?怎樣鑒定分離結(jié)果?怎樣選擇適當(dāng)?shù)腃CD條件(包括固定相和流動(dòng)相)?(3)本實(shí)驗(yàn)中用水提總堿時(shí),為什么調(diào)PH2-3?用氯仿提總堿時(shí)為什么調(diào)PH8-9,分離總堿時(shí)為什么又調(diào)PH6.5?(4)生物堿沉淀反應(yīng)時(shí),應(yīng)注意哪些事項(xiàng)
40、?在下結(jié)論時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題?六、記錄及實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 記錄總堿的提取工藝(流程式),總堿的沉淀反應(yīng)現(xiàn)象及總堿的層析結(jié)果。2. 記錄分離條件考察結(jié)果(繪層析圖),說(shuō)明分離莨菪堿和東莨菪堿的最佳條件為何?3. 記錄分離結(jié)果4. 記錄在實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)的異?,F(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)三 大黃中蒽醌類(lèi)成分的提取、分離和鑒定大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum Palmatclml,唐古特大黃R.tangutium Maxim.etRegll及藥用大黃R.officinale Baill的干燥根及根莖。 大黃中含有多種游離的羥基蒽醌類(lèi)化合物及它們與糖結(jié)合成的甙。其中主要有大黃酸(Rhein)、大黃素(Emodin),蘆薈大黃素
41、(Aloe-emodin)、大黃素甲醚(Physcion)、大黃酚(Chry so-phanal)。大黃記載于神農(nóng)本草經(jīng)等許多文獻(xiàn)中,用于瀉下、健胃、清熱、解毒等。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?. 學(xué)習(xí)緩沖紙層析的基本操作技術(shù),并能根據(jù)紙層析結(jié)果,設(shè)計(jì)液液萃取法分離混合物的實(shí)驗(yàn)方案。2. 掌握PH梯度萃取法的原理及操作技術(shù)。3. 學(xué)習(xí)蒽醌類(lèi)化合物的鑒定方法。二、大黃中已知主要成分的理化性質(zhì) 名稱(chēng)晶形熔點(diǎn)-H-COOH大黃酸(Rhein)黃色針晶318-320-CH-OH大黃素(Emodin)橙色針晶256-257-H蘆薈大黃素(Aloe-emodin)橙色細(xì)針晶216-220-CH大黃素甲醚(Physci
42、on)磚紅色針晶207-H大黃酚(Chry so-phanal)金色片狀細(xì)晶196大黃中蒽醌甙元,其結(jié)構(gòu)不同,因而酸性強(qiáng)弱不同。大黃酸聯(lián)有,酸性最強(qiáng);大黃素聯(lián)有,酸性第二;蘆薈大黃素聯(lián)有,酸性第三;大黃素甲醚聯(lián)有,大黃酚聯(lián)有,該基團(tuán)不為酸性基團(tuán),但因母核中具有1,8二酚羥基,也具有一定的酸性,酸性第四。蒽醌類(lèi)化合物在植物體內(nèi)主要以甙的形式存在,有單糖甙,也有二糖甙。其中主要有大黃酸葡萄糖甙,大黃素-1-O-D葡萄糖甙、蘆薈大黃素-O-D葡萄糖甙、大黃酚雙葡萄糖甙,大黃素甲醚葡萄糖甙。此外,新鮮大黃中還有屬于雙蒽醌的番瀉甙A及番瀉甙B等。本實(shí)驗(yàn)先用酸水將蒽醌甙充分水解成總蒽醌甙元,再用不同PH緩
43、沖紙層析為先導(dǎo),選用適宜的不同的PH緩沖液分步萃取,以分離不同酸度的蒽醌甙元。三、大黃中蒽醌類(lèi)成分的提取分離1. 原理大黃中的蒽醌類(lèi)成分大部分和糖結(jié)合,以蒽醌甙的形式存在于植物組織中,所以要用酸水水解使其生成甙元,蒽醌甙元可溶于苯,故用苯提取。2. 工藝(1)大黃中總蒽醌甙元的提取 大黃粗粉(100g)加20%30ml,苯40ml,水浴回流2小時(shí),用棉花過(guò)濾殘?jiān)教崛∫海?)總蒽醌甙元分離方法的設(shè)計(jì)大黃總蒽醌甙元的紙層析為了了解總蒽醌甙元所含成分,進(jìn)行如下紙層析實(shí)驗(yàn)取新華濾紙,距離下端2cm處劃一起始線,點(diǎn)加總提取液,用甲苯為展開(kāi)劑上行展開(kāi),用0.5%醋酸鎂甲醇液噴霧,并在100下加熱5分鐘顯
44、色,結(jié)果如圖1。從圖1可以看出共有4個(gè)組分,經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照得知,Rf=0.96是大黃酚和大黃素甲醚的混合物;Rf=0.78是蘆薈大黃素;Rf=0.58是大黃素;Rf=0.18是大黃酸。蒽醌類(lèi)成分的緩沖紙層析實(shí)驗(yàn)為了分離以上四種化合物,進(jìn)行緩沖紙層析實(shí)驗(yàn),以確定最佳分離條件。緩沖濾紙制備:取新華濾紙,2214cm離下端2cm處劃一起始線,再每隔1cm劃縱向平行線稱(chēng)重,在每一條帶處順次涂布不同PH的緩沖液和堿液,涂完后,將濕濾紙夾在兩張濾紙中間,然后取出稱(chēng)重,使其濕潤(rùn)指數(shù)為1.5(即濕重為干重1.5倍)。在每一條帶原點(diǎn)處,點(diǎn)總蒽醌甙元提取液,用水飽和過(guò)的氯仿為展開(kāi)劑上行展開(kāi),當(dāng)展開(kāi)劑上升至5-7c
45、m時(shí),取出,烘干,其結(jié)果如圖-2所示。在圖-2中,可以看到有三條“S”形曲線,其中為大黃酸;為大黃素;為蘆薈大黃素;余下的是大黃素甲醚和大黃酚的混合物。 緩沖濾紙各條分別依次用下述緩沖液或堿液處理:1PH3.20, 2PH1.68,3PH5.80, 4PH6.01, 5PH6.55, 6PH7.12, 7PH7.88(以上為檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液),8PH9.18(硼酸緩沖液),95%,10PH9.90,11PH10.50(10、11為緩沖液),120.5%,132.5%,145%,15、16、17分別為5%:5%(9:1,1:1,1:9),185%水溶液。 注:配好的緩沖溶液,用PH酸度計(jì)測(cè)
46、定PH值。最佳萃取劑的確定根據(jù)圖-2紙層析結(jié)果可以確定a.萃取大黃酸時(shí)以PH7.12緩沖液最為合適,因?yàn)樵诖藯l件下,總蒽醌中的大黃酸留在原點(diǎn)不動(dòng),而其它成分幾乎被推至前沿,說(shuō)明大黃酸對(duì)PH7.12緩沖液親合力強(qiáng),在萃取時(shí)易轉(zhuǎn)溶于緩沖液中,其余成分對(duì)苯親合力大,萃取時(shí)仍留在苯液中,從而得到分離。b.萃取大黃素時(shí),以PH9.90緩沖液為宜,理由同上。c.萃取蘆薈大黃素時(shí),則以5%:5%(9:1)為宜。d.大黃酚和大黃素甲醚留在苯母液中,可被5%提出。各種萃取劑用量的計(jì)算確定a.分離組分(大黃酸),PH7.12緩沖液的用量計(jì)算如下:在PH7.12條帶處,號(hào)組分(大黃酸)=0.02,以上(其余甙元)=
47、0.90大黃酸的分配系數(shù):=0.01其余的甙元分配系數(shù):=4.5由此計(jì)算容積比:分離因子: =450R=1/0.21說(shuō)明在分離大黃酸時(shí),苯總提取液與萃取劑的容積比應(yīng)為1:0.21,又由于值很大(450),因此可做一次簡(jiǎn)單萃取。b.分離組分(大黃素),PH=9.90緩沖液的用量計(jì)算如下:在PH9.90條帶處,號(hào)組分(大黃素),號(hào)以上成分大黃素的分配系數(shù):=0.02其余的甙元分配系數(shù):=4.5由此計(jì)算容積比:分離因子: =225由此可知,用PH9.90緩沖液萃取大黃素時(shí),用量應(yīng)為苯萃取液的0.3倍,又由于值很大(225),因此可做一次簡(jiǎn)單萃取。c.分離組分(蘆薈大黃素),堿液用量計(jì)算如下:在5%:
48、5%(9:1)條帶處:號(hào)組分(蘆薈大黃素)=0.21號(hào)以上組分=0.96蘆薈大黃素的分配系數(shù):=0.131=12由此計(jì)算容積比:分離因子: =91.6由此可知,用5%:5%(9:1)的堿液萃取蘆薈大黃素時(shí),用量應(yīng)為苯總提取液的1.25倍,又50,仍做簡(jiǎn)單萃取,(3)蒽醌類(lèi)成分的分離和精制a) 工藝 苯總提取液(30ml)加PH=7.12緩沖液15ml,振搖萃取一次。緩沖液層(下層)苯層(上層)加鹽酸酸化至 加PH=9.90緩沖液20ml, PH=3沉淀過(guò)濾振搖萃取一次濾液沉淀()苯層緩沖液層干燥后用 用5%KOH15ml加鹽酸酸化至2ml冰乙酸 萃取2次PH=3沉淀過(guò)濾結(jié)晶大黃酸苯液堿水層濾液
49、沉淀()(黃色針晶)用少量用鹽酸酸化冰乙酸至PH=3沉淀結(jié)晶經(jīng)磷酸氫鈣層析過(guò)濾大黃素石油醚洗脫(橙色結(jié)晶)濾液沉淀()先流出部分后流出部分干燥后,用乙酸(大黃酚)(大黃素甲醚)乙酯結(jié)晶蘆薈大黃素(黃色針晶)注:由于溫度對(duì)分配系數(shù)影響很大,所以最佳萃取劑的確定要以實(shí)驗(yàn)溫度下紙層析結(jié)果為準(zhǔn),選擇和計(jì)算。一般萃取大黃酸時(shí)在PH7-8范圍,萃取大黃素則在PH9.5-11范圍內(nèi)均可。2、操作方法a、大黃酸的分離與精制將含有總游離蒽醌的苯提取液移置200ml的分液漏斗中,加7.12緩沖液15ml,充分振搖,靜置至徹底分層,放出苯液后,倒出緩沖液置燒瓶中,加HCL酸化至PH3,黃色沉淀析出完全后,過(guò)濾、沉淀
50、、干燥,干燥后的樣品加少量醋酸加熱使其溶解,趁熱過(guò)濾,濾液靜置,析出黃色針晶為大黃酸,過(guò)濾得到純品,可供鑒定。b.大黃素的分離與精制將提過(guò)大黃酸的苯液繼續(xù)移置分液漏斗中,用PH9.9緩沖液21ml振搖萃取,徹底分層后,分出緩沖液層,用HCL酸化至PH3,析出棕黃色沉淀,過(guò)濾,沉淀經(jīng)干燥后,用少量冰醋酸加熱使其溶解,趁熱過(guò)濾,濾液靜置,析出橙色大針晶,過(guò)濾后,即得到大黃素純品,可供鑒定用。大黃素的結(jié)晶溶劑最好是吡啶,但因吡啶臭味難聞,故用冰醋酸。C、蘆薈大黃素的分離與精制余下苯液移置分液漏斗后,用5%Na2CO3:5%NaOH(9:1)堿水液88ml分兩次萃取或用0.5%KOH88ml分兩次振搖
51、萃取,分出堿水液加HCL酸化,析出的沉淀過(guò)濾干燥,用少量的乙酸乙酮結(jié)晶,得到黃色針晶的蘆薈大黃素純品,可供鑒定用。D、大黃酚和大黃素甲醚的分離磷酸氫鈣柱層析(1)裝柱:取115活化10小時(shí)的磷酸氫鈣5g放入100ml燒瓶中,加入一定體積的石油醚,攪拌均勻,取一潔凈的層析柱,底部放入一小塊脫脂紗布,松緊適宜,稍稍打開(kāi)底部的螺旋夾,將伴有溶劑的CaHP4,緩緩加入層析柱中,一面沉降,一面添加,直到加完為止,注意,加入速度不宜太快,以免帶入氣泡,破壞柱床。加完吸附劑后,有底部放出多余的溶劑,當(dāng)液面比吸附劑平面稍高時(shí),關(guān)緊螺旋夾,待樣品上柱。(2)樣品上柱:將萃取后余下的氯仿液,回收至2-3ml,左右
52、,過(guò)濾,濾液加適量的CaHP4拌勻,并于紅外燈下?lián)]散溶劑,然后加入層析柱的頂端,滴加石油醚,是樣品均勻濕潤(rùn),然后加少量CaHP4至柱頂,再加一小片濾紙至頂部,以防加入吸脫劑是將樣品沖起。(3)洗脫:由柱頂加入石油醚洗脫,先洗出的淺黃色流份為大黃酚,后流出的黃色流份為大黃素甲醚,分段手機(jī),交叉段棄去。將收集的兩組溶劑回收至小體積時(shí),可分別析出大黃酚,和大黃素甲醚,用乙酸乙酯結(jié)晶得到大黃酚的片狀結(jié)晶,供鑒定用。大黃素甲醚如混有大黃酚時(shí),可多次重結(jié)晶,即可得到大黃素甲醚純品。說(shuō)明 1.進(jìn)行洗脫操作時(shí),應(yīng)注意控制洗脫液的流速,如流速太快,難以建立平衡,太慢則譜帶容易擴(kuò)散,都影響分離效果。2.應(yīng)選用層析規(guī)格。四、蒽醌類(lèi)成分的鑒定本實(shí)驗(yàn)練習(xí)用PC的熔點(diǎn)及IR鑒定蒽醌類(lèi)成分。1.紙層析鑒定取樣品的氯仿溶液,用新華濾紙上行展開(kāi),用0.5%的甲醇溶液噴霧,并在100下加熱5分鐘。展開(kāi)劑:石油醚(60-70),以97%甲醇飽和。:石油醚,以水
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