細(xì)胞凍存的方法與步驟.doc

1、精品文檔細(xì)胞凍存、解凍方法與細(xì)胞計(jì)數(shù)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕科李晶返回主頁(yè)一、細(xì)胞冷凍保存1. 材料：生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO(Sigma D-2650) 、無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene5000-0020) 、 0.4 （ w/v ）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片、等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)2、冷凍保存方法：（ 1）傳統(tǒng)方法 :冷存管置于410 分鐘 -2030 分鐘 -8016 18 小時(shí) ( 或隔夜 )-液氮槽 vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。- 20不可超過(guò)1 小時(shí)，以防止胞內(nèi)冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦

2、可跳過(guò)此步驟直接放入- 80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（ 2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī) 以 -1 - 3/ 分鐘之速度由室溫降至（- 80以下） - 120，再放在液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。3、步驟：（ 1）冷凍前24-48 小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基，使細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。（ 2）配制冷凍保存溶液( 使用前配制 ) ：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至 20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。（ 3）離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液( 約 0.1ml)

3、 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。（ 4）取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，并晃動(dòng)試管，制成細(xì)胞凍存懸液（DMSO最后濃度為5 10），使細(xì)胞濃度為1510 6cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1 2ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。4、注意事項(xiàng)：（ 1）欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好 (logphase) 且存活率高之狀態(tài)，約為 8090致密度。冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如 hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。.精品文檔（ 2）細(xì)胞在液氮中可長(zhǎng)期凍存無(wú)限時(shí)間

4、，而不會(huì)影響細(xì)胞活力；在-70 度可保存數(shù)月。（ 3）注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色 ( 以 0.22micronFGLPTelflon過(guò)濾或是直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650) ，以 510ml 小體積分裝， 4避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí) ，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時(shí)釋放的熱量對(duì)細(xì)胞的損傷。緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲，可降低細(xì)胞受損。 DMSO可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化，可換用10%甘油凍存。（ 4）冷凍保存之

5、細(xì)胞濃度：normal human fibroblast:1310 6cells/mlhybridoma:1 310 6cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后死去。6adherenttumor lines:5710，依細(xì)胞種類(lèi)而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需 16310 cells/mlother suspensions:510106cells/ml，human lymphocyte須至少 5106cells/ml。（ 5）冷凍保護(hù)劑濃度為5 或 10 DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍

6、保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backupculture，以防止冷凍失敗。（ 6）凍存可用10% 90%的血清，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積（ 4 度時(shí)），復(fù)蘇存活率在80% 90%以上，對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞，以90%血清凍存更為有效。二、冷凍細(xì)胞活化1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。2、細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常( 例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。3、材料37恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無(wú)菌吸管/ 離心管 / 培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器4、步驟：（ 1）操作人員應(yīng)戴防護(hù)面

7、罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。（ 2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。（ 3）將新鮮培養(yǎng)基置于 37水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。（ 4）取出冷凍管，立即放入37水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存.精品文檔管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。（ 5）取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)( 稀釋比例為1:10 1:15) ，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。（ 6）解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑( 例如 DMSO或 glycerol)

8、，依細(xì)胞種類(lèi)而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1000rpm，5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（ 7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試1、原理：（ 1）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤(pán)或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。（ 2）血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)2chambers，每個(gè) chamber 中細(xì)刻 9 個(gè) 1mm大正方形，其中 4 個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16 個(gè)小格，深度均為 0.1mm。當(dāng) chamber 上方蓋

9、上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為2-4ml。使用1mm0.1mm=1.0x10時(shí)， 計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每 ml 中之細(xì)胞數(shù)目。（ 3）存活測(cè)試之步驟為 dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。 一般使用藍(lán)色之trypan blue 染料， 如果細(xì)胞不易吸收 trypan blue ，則用紅色之 Erythrosinbluish 。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù) / （活細(xì)胞數(shù) +死細(xì)胞數(shù)） 100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開(kāi)始攝取染料；因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的

10、親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)； Erythosin bluish stain；取 0.1gram Erythrosinbluish(SigmaE-9259)及 0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于 100mlCa+/Mg+freesaline；血球計(jì)數(shù)盤(pán)及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip)；計(jì)數(shù)器 (counter)；低倍倒立顯微鏡；粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterEle

11、ctronics)。白細(xì)胞稀釋液（4%乙酸溶液）。3、步驟：（ 1）取 50 l 細(xì)胞懸浮液與50l trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。（ 2）取少許混合液( 約 15l) 自血球計(jì)數(shù)盤(pán)chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色( 或紅色 -Erythrosin bluish)。（ 3）計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)( 至少乘以2，因與 trypanblue等體積混合 ) ，最后乘以 104，即為每ml 中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線(xiàn)上，只計(jì)上線(xiàn)與右線(xiàn)之細(xì)胞( 或計(jì)下線(xiàn)與左線(xiàn)之細(xì)胞) 。注： 4 大格細(xì)胞總數(shù)稀釋倍數(shù)10 4/4= 細(xì)胞數(shù) /ml ；每一大格的體積 =0.1cm0.1cm0.01cm=10-4 ml.精品文檔計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，最適濃度為51010 5 細(xì)胞 /ml ，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。5、范例：T75 monolayer culture制成 10ml 細(xì)胞懸浮液，取0.1ml 溶液與 0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤(pán)，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)