PKH26說明書(中文)

1、PKH26 紅色熒光細(xì)胞連接試劑盒普通細(xì)胞膜標(biāo)記產(chǎn)品編號(hào)：MINI26，MIDE26和 PKH26GL室溫保存TECHNICAL BULLETIN產(chǎn)品說明PKH26熒光細(xì)胞連接試劑盒采用擁有專 利的膜標(biāo)記技術(shù)， 能夠?qū)в休^長(zhǎng)脂質(zhì)尾巴 的黃色-橙色熒光染料PKH26結(jié)合到細(xì)胞 膜脂質(zhì)區(qū)域上。 試劑盒中提供染色過程中所 需的溶劑稀釋液C,該溶劑可以可以在染 色過程中， 增加染料溶解度和染色效率， 同 時(shí)維持細(xì)胞活力。稀釋液C與哺乳動(dòng)物細(xì)胞 等滲， 且不含去垢劑或有機(jī)溶劑， 也不含生 理鹽水和緩沖鹽。 根據(jù)細(xì)胞類型及標(biāo)記后細(xì) 胞膜內(nèi)在的變化， 標(biāo)記后的細(xì)胞外表會(huì)由均 一透亮變得有點(diǎn)狀凸起或補(bǔ)丁狀。

2、 但在生理 范圍內(nèi)，PKH26熒光不受pH的影響，每個(gè)細(xì) 胞的熒光強(qiáng)度與染料標(biāo)記位置無關(guān)。PKH26熒光在黃色-橙色區(qū)域圖一， 可用來標(biāo)記追蹤體內(nèi)外多種細(xì)胞。 在細(xì)胞毒 性分析，熒光蛋白、抗體或DNA染料在該區(qū) 域發(fā)出的紫色、綠色、紅色和遠(yuǎn)紅外等，不會(huì)與PKH26產(chǎn)生干擾。PKH26最常被用于基 于染料稀釋增殖的分析的染料稀釋應(yīng)用， 包 括建立抗原特異性前體 frequecies 和正常 或腫瘤組織中靜止或緩慢干細(xì)胞或祖細(xì)胞 的鑒定。同時(shí)PKH26也可用于監(jiān)測(cè)外來病毒、 血小板和其他納米顆粒的攝入； 干細(xì)胞分裂 過程中膜的分配； 細(xì)胞-細(xì)胞之間膜的轉(zhuǎn)移； 細(xì)胞吞噬作用；抗原呈遞；粘附；通過間隙

3、 連接的信號(hào)傳遞； 以及組織切片中的神經(jīng)元 遷移。由于其熒光穩(wěn)定性較強(qiáng)，PKH26被用于體內(nèi)細(xì)胞追蹤研究， 特別是在標(biāo)記的細(xì)胞 的研究周期超過一周時(shí)。圖1. PKH26激發(fā)和發(fā)射光譜-無CaT, Mg2和血清的培養(yǎng)基或者緩沖鹽女口 Dulbecco s PBS 或 Hank s BSS試劑組成PKH26染料*(P9691)稀釋液 C(G8278)MINI261X1X 10mLMIDI262X6X10mLPKH26GL1X6X10mL31X10 M (溶于乙醇)血清，白蛋白或其它組織兼容性蛋白離心管4-15mL溫控離心機(jī)1,000 X g熒光分析設(shè)備熒光讀板機(jī)，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細(xì)胞儀層流

4、罩血球計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)器載玻片和蓋玻片考前須知和免責(zé)說明MINI26試劑盒推薦用于小的或初步試驗(yàn)研究，PKH26GL用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究該產(chǎn)品僅用于科研，不用于制藥、家庭或其它用途。請(qǐng)遵照平安數(shù)據(jù)清單中關(guān)于有害及平安操作標(biāo)準(zhǔn)操作。所需設(shè)備和試劑試劑盒未提供充分分散的單個(gè)懸浮細(xì)胞含血清的組織培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基儲(chǔ)存/穩(wěn)定性PKH26乙醇溶液貨號(hào) P9691 可室溫或冷藏保存。減少蒸發(fā)以防止染料濃度升高。保證染料乙醇溶液瓶蓋蓋緊。該染料避光保存， 使用前觀察是否有結(jié)晶。 如出現(xiàn)結(jié)晶，37 C熱水浴加熱，然后超聲或震蕩直至General cellmembrane labeling溶解。稀釋液 C 可室溫或冷

5、藏保存。如果冷藏 保存，使用前復(fù)溫至室溫過程，步驟 A5 和A6。稀釋液C為無菌溶液，不含任何防 腐劑和抗生素， 其需保持無菌。 不要將染料 儲(chǔ)存于稀釋液 C中。溶于稀釋液C的工作液 需現(xiàn)配現(xiàn)用， 且配好后需立即使用 。操作過程A. 一般細(xì)胞膜標(biāo)記親脂性染料結(jié)合到細(xì)胞膜上完成標(biāo)記。 染色強(qiáng)度是染料濃度和細(xì)胞濃度的函數(shù)， 與 滲透性無關(guān)。 因此， 保證染料添加量不過量 非常關(guān)鍵。 過標(biāo)記的細(xì)胞將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜完 整性缺失和 reduced cell recovery 。以下過程可用于體內(nèi)體外細(xì)胞的標(biāo)記， 包括干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì) 胞、神經(jīng)細(xì)胞或者任何其他細(xì)胞。 體內(nèi)細(xì)胞 的標(biāo)記過程需

6、一定的改良，如血小板的染should be performed prior to monoclonal antibody staining. The membrane dyes will remain stable during the monoclonal staining at 4C； however, capping of the monoclonal antibodies is highly probable if the general cell membrane labeling is carried out at ambient temperature subsequent to

7、 antibody labeling.下述染色過程中細(xì)胞濃度和染料濃度代 表操作的起始濃度。 該濃度被證明適用于多 種細(xì)胞。 使用者需通過評(píng)估染色后細(xì)胞活率 如， PI 染色、熒光強(qiáng)度、染色均勻度及 是否對(duì)所研究細(xì)胞功能有影響等， 根據(jù)實(shí)驗(yàn) 目的，確定最優(yōu)的染料濃度和細(xì)胞濃度 。注意1: PKH26染色過程中，不能存在疊氮 化物或代謝毒性物。注意 2：雖然貼壁細(xì)胞也可以染色，但單個(gè) 懸浮細(xì)胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶 trypsin/EDTA 將貼壁細(xì)胞消化成單個(gè)懸色，或者選擇性標(biāo)記吞噬細(xì)胞。浮細(xì)胞后再染色效果更佳。液C重懸時(shí)，減少殘留培養(yǎng)基或緩沖液體積以下過程最終體積為2mL PKH26濃

8、度為672X 10- M 細(xì)胞濃度為 1X 10 cells/mL。非常重要。見參考文獻(xiàn) 9的注意28。養(yǎng)基洗遍。以下過程均在室溫下進(jìn)行(20-25C)1. 將2X 107個(gè)細(xì)胞于離心管中，用不含血清注意：血清蛋白和脂質(zhì)會(huì)與染料結(jié)合，降低與細(xì)胞膜結(jié)合的染料濃度。最好在用稀釋液 C重懸細(xì)胞染色前(第四步)用無血清培養(yǎng) 基或緩沖液洗細(xì)胞一次(第一步)。4. 參加 1mL稀釋液 C ( Catalog NumberG8278 ),用移液管輕輕吹打混勻，制備2X細(xì)胞懸液。不要用振蕩器震蕩，不要讓細(xì)胞在稀釋液C中保存太長(zhǎng)時(shí)間。注意：生理鹽(physiologic salts)的存在會(huì)使得染料結(jié)團(tuán)并大幅降

9、低染色效率。因此，需確保染色時(shí)細(xì)胞懸浮于稀釋液 C中， 不含培養(yǎng)基或緩沖鹽。2. 400 X g離心5分鐘。注意：PKH26染料不能直接加到離心沉淀中, 這樣會(huì)造成細(xì)胞染色不均一和細(xì)胞活力降 低。5臨染色之前，將4卩L PKH26乙醇溶液加 入1mL稀釋液C中，充分混勻，配制的62X染色液(4X 10 - M)。注意1 :為減少乙醇對(duì)細(xì)胞活率的影響，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇最終濃度不能超過1-2%。3. 離心后，小心吸棄上層清液，剩余上層細(xì)胞液體積不超過 25卩L。注意2:如果所需染料最終濃度V 2X10 -6M,需用100%醇將PKH26稀釋于另一單獨(dú)的容器中，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)

10、性。注意：為得到可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在用稀釋較慢，染色均一性較差。6快速將1mL 2X細(xì)胞懸液步驟 4參加1mL 2X染色液步驟5中，立即用移液管混勻。最終細(xì)胞濃度為1X 107/mL,-6PKH26 濃度為 2X 10- M注意 ：由于染色瞬間完成， 快速將細(xì)胞與染 料混勻 對(duì)得到明亮、 均勻和可重復(fù)的標(biāo)記結(jié) 果非常重要。 以下措施有助于得到較優(yōu)的結(jié) 果：a. 不要將PKH26染料直接參加含2X細(xì)胞的稀釋液 C 中。b. 將2 X細(xì)胞懸液步驟 4與2X染色 液步驟 5等體積混合。c. 調(diào)整2X細(xì)胞和2 X染料的濃度防止染 色體積太小V 100卩L或太大 5mL。d. 用電動(dòng)移液器快速將細(xì)胞和染

11、料混勻。血清移液管混勻速度太慢而使得染色不e. 分配體積盡量準(zhǔn)確，以保證樣品與樣品之間，實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的可重復(fù)性。7. 混勻后的染色的細(xì)胞孵育 1-5 min。由于染色速度較快， 延長(zhǎng)孵育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)沒有幫助。注意 ：讓細(xì)胞在染色液中停留盡量短的時(shí)間， 同時(shí)保證得到理想的染色強(qiáng)度。 因?yàn)橄?釋液 C 缺少生理性鹽， 過長(zhǎng)時(shí)間的暴露在稀 釋液C中會(huì)造成某些細(xì)胞活力降低。如果不 能確定其影響程度， 可增加僅作稀釋的對(duì)照 組和只用乙醇而不用染料染色的對(duì)照組。8. 參加等體積的血清2mL或其它適宜的蛋白溶液如1% BSA終止反響，孵育1min 以結(jié)合多 余的染料。注意 1： 血清或等效的蛋白濃度為最優(yōu)的

12、終止液 。如果用完全培養(yǎng)基替代，添加體積為 10mL。注意 2：不要通過加稀釋液 C 或離心來終止反響。均勻。 Racking 和旋渦震蕩混勻同樣混勻MC-38 TIL細(xì)胞用上述指定 PKH26濃度染色，最終圖2. PKH26染色優(yōu)化古話u 置 aougM詈 nu UB42iiU PKH29注意3:不要用無血清培養(yǎng)基或緩沖鹽 ，他們會(huì)使 染料產(chǎn)生聚集。染料聚集使清洗過程中無法洗凈， 使得分析過程中仍存在未標(biāo)記的細(xì)胞。9. 將細(xì)胞在20-25C條件下400X g離心10min，小心吸棄上清。用 10mL完全培養(yǎng)基重懸，將重懸液轉(zhuǎn)移至另一新的無菌離心管中，20-25C條件下 400X g離心 5 min。用10mL完全培養(yǎng)基再清洗兩遍以除去沒結(jié)合的染料。注意1:將重懸液轉(zhuǎn)移至新離心管中，減少了離心管壁殘留的染料對(duì)洗滌效率的影響；注意2:不要用稀釋液 C清洗。10. 最后一步清洗后，用 10mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞評(píng)估細(xì)胞回收率，細(xì)胞活