免疫熒光操作步驟(漂片,冰凍切片)

1、免疫熒光操作步驟（漂片，冰凍切片）免疫組化步驟：1. 將腦片放到， 6孔板（或 12孔板），按照二抗說明書， 加 3%雙氧水封閉 10min （如果是從切片保護(hù)液取出，則要用 PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步驟有差 別），本實(shí)驗(yàn)室使用的二抗試劑盒為中杉金橋超敏二步法試劑盒；2. 吸去雙氧水， PBS 洗兩遍，將腦片周圍的水用吸水紙或衛(wèi)生紙擦凈，注意不要 碰到腦片；3. 然后按照一抗說明書，將一抗按比例稀釋，加入稀釋后的一抗，一般，大鼠腦 片一張需 50 微升一抗稀釋液，小鼠腦片為 30微升；注意不要讓液體流到邊上； 如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體；4. 然后，4C,過

2、夜（18h或者24h）,不建議使用37C；5. 然后， PBS 洗凈兩遍；剩下步驟見二抗試劑盒說明書。6. DAB 配方為： 10mg DAB 固體加到 20ml 0.01MPBS ，臨用時(shí)加 1 00-200微升 30% 雙氧水，注意避光。7. 顯色 10min ，看片子染色深淺情況適當(dāng)調(diào)整顯色時(shí)間。一般 3 分鐘顯色就比較 明顯，如果 20 分鐘仍未顯色，則看下面的參考。8然后PBS洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片，自然晾干。干燥天氣 2-3h，潮濕天氣3-4h。9.脫水： 70%酒精 3min， 95%酒精 3min， 1 00%酒精 3min， 1 00%酒精 2min，二甲苯2min，二甲苯3-

3、5min。如果片子上鹽分較多，在 70%酒精前在雙蒸水1min 。免疫熒光步驟及注意事項(xiàng)：1，將腦片放到6空板的山羊血清封閉液中，封閉 20-40min ；（如果是從切片保 護(hù)液取出，則要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗兩遍，將腦片周圍的水用吸水紙或衛(wèi)生紙擦凈 ，注意 不要碰到腦片；3，然后按照一抗說明書，將一抗按比例稀釋，加入 PBS稀釋后的一抗，一般， 大鼠腦片一張需 50微升一抗稀釋液，小鼠腦片為 30 微升；注意不要讓液體 流到邊上；如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體 ；4，4C,過夜（18h或者24h），不建議使用37C，如果熒光亮度不強(qiáng)，可以延 長孵育時(shí)

4、間到 48 或 72小時(shí)；5，然后，PBS洗凈兩一一三遍，按照二抗說明書稀釋的熒光二抗，室溫孵育2小時(shí)。 注意避光操作。6， 0.01M PBS 洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片上，避光自然晾干；7， 滴加防淬滅劑后，蓋上蓋玻片鏡下觀察。常見問題：1 ， 熒光太暗：可能蛋白表達(dá)少；可能一抗孵育時(shí)間短；二抗孵育時(shí)間短；清洗 次數(shù)過多；溶液 pH 不合適；熒光萃滅；一抗?jié)舛冗^低或過高；二抗?jié)舛冗^ 低或過高；激發(fā)波長不在抗體適用波段。2， 背景熒光太深：一抗?jié)舛冗^高，清洗不徹底；二抗?jié)舛冗^高，清洗不徹底； 封閉時(shí)間過短，非特異性過強(qiáng)；一抗非特異性過強(qiáng)；二抗非特異性過強(qiáng)；顯 微鏡熒光強(qiáng)度過強(qiáng)。總之實(shí)驗(yàn)是喜歡強(qiáng)陽性

5、，不喜歡假陰性，呵呵。任何實(shí)驗(yàn)都需要花時(shí)間摸索才能找到其最佳的工作條件。熟能生巧，邊學(xué)習(xí)邊練習(xí)邊思考 方能學(xué)好。有不足之處，敬請各位老師同學(xué)批評 指正，以使該實(shí)驗(yàn)更加臻美。若有不解之處，請?jiān)凂T展波或者免 疫學(xué)技術(shù)交流群：85460640。QQ:929108912謝謝。祝實(shí)驗(yàn)順利！另附免疫組化常見問題解析。原理是相同的，只是最后的顯色方法不一樣，有 些問題有啟發(fā)作用。免疫組織化學(xué)1. 邊緣效應(yīng)？原因：1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米

6、，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范， 盡量避免選用壞死較多的組織。2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。 解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。2. 產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？1. 抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。解決辦法：這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。2. 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。3. 內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活

7、時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；4. 非特異性組分與抗體結(jié)合， 這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；5. DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高；6. PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；7. 標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。3. 免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國產(chǎn)的工作液，怎么這么高稀釋度也沒能做出陽性結(jié)果？另外，不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度。2、抗原修復(fù)不全，對于甲醛固定

8、的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火 4次*6min試試。有人做過實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和 次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。3、組織切片本身這種抗原含量低；4、血清封閉時(shí)間過長。5、DAB孵育時(shí)間過短。6、細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。7、 開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。4. 背景強(qiáng)的原因？1, 考慮一抗?jié)舛雀撸?, 然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間；3, 也要考慮血清封閉時(shí)間是否過短4, 適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時(shí)間等。5. DAB顯色真的需要3-10分鐘嗎？我之前做的顯色 40秒就夠了，再多本底

9、就太深，現(xiàn)在 做另一個(gè)顯色3分鐘也不出，真的有必要延長顯色時(shí)間嗎？1. DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即 可沖洗；2. DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗 體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；3此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需 要延長封閉時(shí)間；4. DAB顯色時(shí)間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體 濃度過低或孵育時(shí)間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過長。6. 石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？，1烤片

10、時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時(shí)間和提高烤片溫度二，用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做三，有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織，四，用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。7. 年前爬的細(xì)胞片在-20度放了半年（保鮮膜密封），現(xiàn)在取出來再作，做了兩次，步驟均是按以前的作的，但今天做時(shí)，原來顯色很強(qiáng)的片子現(xiàn)在顯色很弱了，問什么呢？ 是不是片子放的時(shí)間太長了？抗體在4度放的時(shí)間也不長而且這次濃度比以前做的還高？1. 首先，抗體濃度和孵育時(shí)間在免疫組化中至關(guān)重要。在抗原抗體反應(yīng)并非抗體濃度越高，反應(yīng)越強(qiáng)烈，這叫前帶現(xiàn)象。所以選擇

11、最佳的一抗?jié)舛群头跤龡l件也是十分重要的，其實(shí)抗體濃度過高或過低均會(huì)引起陰性。2. 我到認(rèn)為你這片子的影響可能更大。盡管在-20度保存，但是時(shí)間 一般超過3個(gè)月就不能保證其中抗原的丟失，建議可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。3. 你說抗體放在4度保存是指未稀釋還是稀釋后抗體，存放多長時(shí)間？ 一般稀釋后抗體不 能保存很長時(shí)間的。8. 為什么切片傾斜，抗體分布不均勻，就會(huì)造成一半陽性，一半陰性？我認(rèn)為，即使切片傾斜，抗體覆蓋少的那部分組織和其他部分抗體的濃度是一樣的，只是抗體體積的大小差異！如果說抗體傾斜沒覆蓋好的地方是陰性，那為什么不是干片所導(dǎo)致的非特異性高背景的染色呢？當(dāng)切片傾斜到有一半甚至

12、都沒液體時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)陰陽臉樣的著色。你認(rèn)為呢？9. 高溫抗原修復(fù)后就沒必要滅火內(nèi)源性過氧化物酶？經(jīng)過高溫POD已經(jīng)滅活了，不錯(cuò)POD是被被滅活了，但它仍有還原能力， 仍能跟DAB發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使 DAB顯色，我們用雙氧水是耗竭 POD的還原能力，使之不能在跟 DAB反應(yīng)。所以無論修復(fù)與否都應(yīng)該滅活POD，盡可能消除非特異性著色。10. 冰凍切片有時(shí)會(huì)有小洞 ？冰凍切片有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)切片上會(huì)有空洞，這是因?yàn)榻M織在冰凍過程中形成冰晶，形成冰晶 的原因一是組織冰凍時(shí)間太慢，或者冰凍的溫度不夠低，慢慢形成冰晶，二是有些組織在冰凍之前需要做適當(dāng)?shù)墓潭?，如腦組織，然后放入30%的蔗糖4度冰箱過夜以減少冰晶

13、形成，并且能最大程度保持組織細(xì)胞形態(tài)。另外在切片是組織塊復(fù)溫要在37度速融，否則易造成組織塊的破壞。11. 常用免疫組化結(jié)果分析方法 ？1. 陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在 40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的 10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì) 數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組 36張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。2. 灰密度分析法。通過在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用image j進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。3. 評分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進(jìn)行評分（14分為025%、2650%、5175%、 76100%

14、），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著 色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。12. DAB呈色后到底什么樣染色是特異性染色？陽性標(biāo)記可以從色度特征，陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征來進(jìn)行基本的判斷。色度特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，標(biāo)記方法越敏感，陽性結(jié)果顯色 則越強(qiáng)。根據(jù)陽性標(biāo)記的顯色程度分為：淡黃色，提示為弱抗原；棕黃色，提示為中等 度抗原；棕黑色，示為強(qiáng)抗原。在結(jié)果判斷中，后兩者較有意義，可作為判斷依據(jù)。細(xì)胞學(xué)特征：陽性表達(dá)必須在細(xì)胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的陽性表達(dá)即使陽性也不應(yīng)作為判斷依據(jù)。一般分為胞膜型，胞

15、核型，胞質(zhì)型，微絨毛型，復(fù)合型幾種。這是需要結(jié)合背景知識(shí)的。同樣，非特異性染色也有一定的特點(diǎn)：它首先是指抗原無明確定位，各種細(xì)胞累及一片，色度無深淺之分，這種標(biāo)記組織片不能作為免疫組織標(biāo)記結(jié)果判斷的依據(jù)，造成非選民性染色的原因常為組織標(biāo)本固定不佳，抗體質(zhì)量問題或稀釋度不合理及操作方法不規(guī)范等。因此，免疫組化特異性染色定位非常重要，一般情況下，陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞相互 交雜，陽性染色強(qiáng)度深淺不一。如果缺乏細(xì)胞音的不均一性染色，即或呈陽性染色，常 提示為非特異性染色。 另外，組織片邊緣反應(yīng)和出血壞死灶周圍陽笥反應(yīng)不能作為診斷 依據(jù)。13. 1.石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？我用組織芯片和普通切片

16、在多種條件下進(jìn)行了抗原修復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在熱修復(fù)后，組織脫片最主要原因是組織脫水不良，腫瘤組織黏附性差在小塊組織時(shí)也容易撕脫（減小熱修復(fù)加熱器功率，PBS沖洗時(shí)不要直對組織沖 洗、可以有效防范）。2. DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？這就是免疫組化染色的陰陽臉， 免疫組化實(shí)驗(yàn)是環(huán)環(huán)相扣的實(shí)驗(yàn)，任何一步試劑孵育不全 （沒有均勻的在組織上孵育）都可能導(dǎo)致這樣的結(jié)果。3. 免疫組化結(jié)果老是出現(xiàn)陰性結(jié)果？那就要考慮真陰性還是假陰性！假陰性是你操作 不當(dāng)或者試劑質(zhì)量的問題了。4. 切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？你的抗體是否特異，孵育 時(shí)間溫度濃度是否過長！

17、5. 一抗從 4 度拿出后，為什么有人說要 37 度復(fù)溫，目的是什么？我沒遇到這樣的說法， 是否是想加速復(fù)溫？還有我不知道國內(nèi)的院校為什么對37 C孵育如此感興趣，在你們買國外抗體時(shí)，他們的說明書上除了酶修復(fù)要37 C外，其他步驟中均沒有說要在 37 C中孵育。6. 免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么？尤其是微波修復(fù)?？乖迯?fù)沒有什么最佳 條件，只有可能管用的修復(fù)條件。7. 有人在一抗孵育前用 tritonX100 來通透細(xì)胞，對石蠟切片需要否？ tritonX100 是脂 質(zhì)溶解劑， 做免疫細(xì)胞化學(xué)時(shí)細(xì)胞膜是完整的半透膜， 孵育的抗體要自由的通過細(xì)胞膜 就要用 tritonX100 來破膜。石蠟切片細(xì)胞多數(shù)是切開狀態(tài)了。但是脂質(zhì)有時(shí)會(huì)吸附抗 體，含脂質(zhì)高的組織也可以用 triton 。8. 蘇木素復(fù)染的時(shí)間 應(yīng)該是多少？復(fù)染過度咋辦？要看你是用什么蘇木素，免疫組化 復(fù)染，不比我們平常的 HE,它只要一般的輕微染色就夠了，染過了就湊合著看，或者 試試 1 鹽酸酒精。9. 抗原修復(fù)應(yīng)在滅活 POD 之前還是之后？看過國外文獻(xiàn)說是要在抗原修復(fù)之前修復(fù)內(nèi) 源性過氧化物酶,還用 CD3 來說事,當(dāng)初