反硝化細菌項目說明書

1、二-逼 I KH2P041g、FeC12 6H200. 5g CaC12 7H200. 2g MgS04 7H201g、琥珀酸鈉 8. 5g.澳百里 酚 藍（BTB） （1%乙醇溶液）ImL,用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.07. 3, 121C滅菌20min）, LB 培養(yǎng)基（KN031g、KH2P041g、FeC12 6H200. 05g、CaC12 7H200. 02g、MgS04 7H201g、琥珀酸鈉 8. 5g, 121C 滅菌 20min）。格里 斯試劑A、B液，二苯胺試劑，其他試劑均分析純。2. 2. 2取樣南陽市污水處理廠曝氣池中活性污泥；南陽師院十二里河污泥；南陽師院

2、陽子湖湖水；南陽師院周圍麥田土樣。2. 2. 3實驗方法采用梯度稀釋法將污泥樣品稀釋至適當濃度，取0. ImL均勻涂布于BTB培養(yǎng)基 表 面，置入恒溫培養(yǎng)箱，3（TC下培養(yǎng)23d后，用接種環(huán)挑取使周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍色暈圈 的單菌落，進行分離純化即為初篩菌株。將初篩篩選出的好氧菌株接種到LB液體培養(yǎng)基的試管中，每支試管分裝培養(yǎng) 基的 高度約為45cm,每株重復3管，在3（TC恒溫下培養(yǎng)7d以上，每天觀察其生長情況， 檢查試管是否混濁。并用格里斯（Griess）試劑檢查培養(yǎng)液中是否已出現(xiàn)亞硝酸根。如果 呈桃紅或紅色反應，說明硝酸鹽已經(jīng)在反硝化菌作用下生成 亞硝酸鹽，即為正反應。如 為負反應，則就要檢

3、查培養(yǎng)液中是否還有硝酸根，即 置白瓷板凹窩中加濃硫酸和二苯胺 試液各2滴，然后滴入待測液廣2滴，如果有藍色出現(xiàn)，說明有硝酸根存在，即未進行 反硝化作用，受檢查管無反硝化細菌存在，如不出現(xiàn)藍色，則說明硝酸根已完全消失， 且作為硝化作用中間產(chǎn)物的亞硝酸根也完全消失，這證明受檢查管的反硝化作用很強烈， 有反硝化細菌存在，檢查時應與空白對照，將檢出具有反硝化作用的好氧菌作為復篩菌 91,并將其接種于3號培養(yǎng)基的試管斜面，作為備用菌。2. 3分析方法該方法是利用在培養(yǎng)液中滴加格里斯試劑、二苯胺試劑和奈氏試劑，通過顯色反 應指 示亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨態(tài)氮的變化31,從而篩選出對硝態(tài)氮有較強利用效 果的菌株

4、。 在培養(yǎng)液中加入12滴格里斯試劑，以檢測是否有亞硝酸鹽的存在，如 溶液立即呈粉 紅色或棕色等，則硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽，說明該溶液中具有好氧反硝化作用的細菌。如無紅色出現(xiàn)，再加入二苯胺試劑，若培養(yǎng)液呈藍色，則表示該培養(yǎng)液中硝酸鹽未被轉(zhuǎn)化，溶液中無反硝化細菌;若無色，則表示硝酸鹽和剛生成的亞硝酸鹽都已原成氮氧化物，說明該溶液中具有較強好氧反硝化功能的細菌。2. 3菌株的分離與鑒定從十二里河的污泥中篩選到20株生長比較旺盛，反硝化能力較強的好氧反硝化細菌，分別接入含有硝酸鉀的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)23d通過格里斯試劑檢測菌株的 反硝化速度，先有無色一一粉紅色一一玫瑰紅色一一棕色一一無色（滴入二苯胺仍為

5、無色）先完成這個過程的細菌反消化能力較強，每隔12個小時檢測一次，從中篩選8株菌做鑒定。菌株編號格里斯試劑檢測結(jié)果12h后24h后36h后48h后1粉紅色玫瑰紅色棕色無色2無色粉紅色玫瑰紅色棕色3粉紅色玫瑰紅色棕色無色4無色無色粉紅色玫瑰紅色5無色無色粉紅色玫瑰紅色6粉紅色玫瑰紅色棕色無色7無色粉紅色玫瑰紅色棕色8無色粉紅色玫瑰紅色棕色9粉紅色玫瑰紅色棕色無色10無色粉紅色玫瑰紅色棕色11粉紅色玫瑰紅色棕色無色12無色無色粉紅色玫瑰紅色13粉紅色玫瑰紅色棕色無色14無色粉紅色玫瑰紅色棕色15粉紅色玫瑰紅色棕色無色16無色粉紅色玫瑰紅色棕色17粉紅色玫瑰紅色棕色無色18無色粉紅色玫瑰紅色棕色19

6、無色無色粉紅色玫瑰紅色20無色無色無色粉紅色通過上表分析得1、3、6、9、11、13、15、17號菌株為反硝化能力強的優(yōu)勢菌株。將8株菌接種后第2天即產(chǎn)生大量氣泡，迅速降解亞硝態(tài)氮和總氮的菌株。6號菌株通過 革蘭氏染色法在顯微鏡下觀察鑒定該菌株為革蘭式陽性菌株，同時進行顯微拍照觀察該菌 的外形為球形。24菌株反硝化特性靜置培養(yǎng)條件下，菌株在接種后的3h進入了對數(shù)生長期，在10h菌體濃度達到最 高，隨后進入生長穩(wěn)定期，在23h左右進入衰亡期。在對數(shù)生長期，由于培養(yǎng)基中含有 豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，此時用于菌體增殖的氮源主要是培養(yǎng)基中的有機氮，而在生長穩(wěn)定末期 及衰亡期，菌體基本不再增殖，此時培養(yǎng)基中的亞

7、硝態(tài)氮 濃度的變化應該是由于反硝化作 用引起的。反硝化碳源通常分為三種類型：第一類是易于生物降解的有機物，如實驗中采用的 甲醇、乙醇、蔗糖、葡萄糖等;第二類為可慢速生物降解的有機物，如實驗中的可溶f生淀 粉等;第三類為細胞物質(zhì)，細菌會利用細胞成分進行內(nèi)源反硝化。碳源的種類對菌株的反 硝化活性有很大影響。一般來說，在反硝化過程中，易于生物 降解的有機物是最好的電子 供體，不僅反硝化速率快，還能夠提高生物處理裝置 的能力和效率，使反硝化過程穩(wěn)定可 靠2. 5反硝化碳源試驗以 LB 培養(yǎng)基（KNO31g、KH2PO41g、FeC12 6H200. 05g、CaC12 7H200. 02g MgSO4

8、 - 7H2Olg、蒸飾水1000ml、PH7. 07. 3為基礎培養(yǎng)基，分別加入不同碳源 檸檬酸鈉10,乙醇10g、醋酸鈉10g、葡萄糖10g、可溶性淀粉10甲醇10g作為唯一碳源 配制培養(yǎng)基。按1 %接種量接入活化并用無菌水洗滌干凈的菌液，30oc靜置培養(yǎng)60h后檢 測培養(yǎng)基中亞硝態(tài)氮的降解率。2.5.1. BTB平板篩選法該方法適用于對培養(yǎng)條件有特殊營養(yǎng)要求的某種好氧反硝化菌的定向篩選。運用此 方法在好氧條件下，利用平板的抑菌圈大小，篩選到對不同碳源適應能力不同的20株好 氧反硝化細菌菌株。2.6菌株在天然養(yǎng)殖水體中的反硝化特性取回的陽子湖水樣經(jīng)處理后，分為兩部分，一份加入硝酸鉀（氮源）

9、和葡萄糖（碳源），分別取50ml分裝于四個錐形瓶中，一組只加入硝酸鉀，取50ml裝入一個錐形瓶 中，121C,30min滅菌處理后，將不同濃度的菌種（lml）接入錐形瓶中2/C恒溫培養(yǎng)。用格里斯試劑定時檢測顏色變化。加N、c只加N無c加、c加N、C加N、C、投菌濃度檢測不投菌3X1073X1073X1083X109時渝、12h無色無色無色粉紅色玫瑰紅色16h無色無色無色玫瑰紅色棕色20h24h30h36h2. 7投菌濃度試驗將不同濃度的菌種投入陽子湖水中，用格里斯試劑定時檢測降解天然水中氮的速度。加、C加N、C加、C加N、C菌濃度檢測時渝、不投菌3X1073X1033X10912h16h20h

10、24h30h36h天然水體中存在著相當數(shù)量的土著微生物，它們和實驗中人工投加的菌體存在著相 互競爭的尖系。從工程實際應用出發(fā)，為了確保所投加的微生物能在天然水體中發(fā)揮應 有的反硝化作用，有必要從實際應用的可操作性出發(fā)，確定合適的投菌量。隨著投菌量的增加，亞硝態(tài)氮的降解率逐漸升高；當投菌濃度達到10個/L時，菌株 即可在水體中發(fā)揮高效的反硝化作用。說明該菌株具有較強的生存能力和環(huán)境適應能 力，在天然水體中具有較強的競爭力。3產(chǎn)品性能分析生物脫氮以其無污染、脫氮徹底等優(yōu)點被認為是目前最經(jīng)濟、有效、可行性高的水體 除氮方法。但由于種種原因，目前國內(nèi)外市場尚無可有效治理水體亞硝態(tài) 氮污染的微 生態(tài)制劑

11、產(chǎn)品。分離得到的微生物菌劑已在國內(nèi)多個水塘進行了中試試驗，均取得了 良好的脫氮效果。加之芽抱桿菌具有很強的生命力和旺盛的繁殖能力，能適應各種不 良的環(huán)境條件，受水體酸堿度、鹽度等影響較小，因此該菌株具有開發(fā)成微生態(tài)制劑 應用于受污染水體脫氮的巨大潛力。4研制結(jié)論及應用本研究采用定向富集（反復篩選）的方法，從污水處理池活性污泥中篩選出TIN去除率較高的好氧反硝化細菌。該方法操作簡便、可行，反復篩選具有成本低、易操作、達標排放可靠性強且無二次污染等優(yōu)點。具有較好的科學性和先進行。不僅降低了工業(yè)廢水對水體環(huán)境的危害，還可制得環(huán)保、高效去除水體富營養(yǎng)化的微生物菌劑，由此帶來的環(huán)境效益和社會經(jīng)濟效益是非

12、常顯著的。該制備技術具有如下特:方法操作簡便、可行，反復篩選具有成本低、易操作、達標排放可靠性強且無 二次污染等優(yōu)點。使硝化/反硝化反應在同一個反應器中進行，可以大大減少占地面積和建設資金；可以減少處理過程中加入調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH值的化學物質(zhì)，降低成本;好氧反硝化細菌在處理過程中更容易控制。它的發(fā)現(xiàn)打破了反硝化只能在缺氧或厭氧條件下進行的傳統(tǒng)觀點，為新型生物 脫氮提供了新思路.應用按本方法篩選到的好氧反硝化細菌市場潛力大，推廣應用前景廣闊，具有顯 著的經(jīng) 濟效益我國每年用于環(huán)境污染投資約為830億元，約占當年GDP的1%。盡管如此，水 環(huán)境污染趨勢仍然沒有得到有效控制，每年由于水質(zhì)污染引起的損失共約

13、為500億元。 同時，項目實施后可安排社會閑散人員就業(yè)，減輕就業(yè)壓力，產(chǎn)生 較好的社會效益。利用 活性污泥篩選出TIN去除率較高的好氧反硝化細菌，不僅能減少工業(yè)廢水對環(huán)境的污 染，而且能充分利用資源，變廢為寶，具有顯著的環(huán)境效益。附錄：BTB培養(yǎng)基平板初篩復篩過程中抑菌圈篩選的好氧反硝化菌斜面保存的形態(tài)特征圖格里斯試劑染色后六號好氧反硝化菌株油鏡下顯微觀察照片（10X100）格里斯試劑的顯色反應圖示參考文獻1沈萍微生物學MJ 北京:高等教育出版社,2000, 1542翟茜，汪蘋，李秀婷，等活性污泥中好氧反硝化菌的富集篩選及鑒別刀環(huán)境科學 與技術,2007, 30（1）: 11-14 3國家環(huán)保

14、局編委會水和廢水監(jiān)測分析方法（第3版）M.北京：中國環(huán)境科學出版 社，19894黃運紅，馮香玲，龍中兒，等好氧反硝化有效微生物群的篩選及特性研究卩安徽農(nóng) 業(yè)科學,2007, 35 (36): 11977-11979 王弘宇，馬放，蘇俊峰，等不同碳源和碳氮比對一株好氧反硝化細菌脫氮性能的影 響J環(huán)境科學學報,2007, 27(6) :968-972 李平，張山，劉徳立細菌好氧反硝化研究進展微生物學雜志,2005, 25:60647項慕飛，汪蘋，李秀婷，等廢水脫氮系統(tǒng)中好氧反硝化菌的篩選與鑒定食品科技， 2006,7:1531568J孔慶鑫，李君文，王新為，等一種新的好氧反硝化菌篩選方法的建立及新菌株的發(fā) 現(xiàn)