重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1、重組質(zhì)粒構(gòu)建生物學(xué)屠仁軍(新浪)一、載體與外源片段（PCR產(chǎn)物）的雙酶切為了保證做連接反應(yīng)時(shí)有足夠的外源DNA片段，應(yīng)該加入1ug的DNA進(jìn)行酶切反應(yīng)；兩種酶分別加1ul，10buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑膠分析DNA以及載體的濃度，取1-2ul，電泳檢測(cè)其含量。1ul體積太少，可以將其稀釋在9ul水中，再加loading buffer。6ul 15000bp的marker，2500bp條帶的亮度約是100ng DNA?？蓪?duì)比marker的亮度算出酶切回收的DNA的濃度，以便于確定連接反應(yīng)時(shí)的用量。Image J軟件可以做灰度分析。）雙酶切反應(yīng)結(jié)束后，使用PC

2、R cleanup試劑盒回收DNA與載體?；厥胀曛笥猛瑯拥姆椒ǚ治銎錆舛?。（也可以用分光光度計(jì)直接測(cè)量DNA的濃度，但是，一般酶切反應(yīng)之后其濃度會(huì)比較小，取1ul稀釋100倍之后濃度很低，可能已經(jīng)低于儀器的測(cè)量范圍，而電泳靈敏度很高，還可一排除雜帶、RNA、蛋白質(zhì)等對(duì)濃度的干擾。）二、連接反應(yīng)載體100ng，DNA片段根據(jù)大小，1ul buffer，1ul T4連接酶，加水至10ul；16連接12-16h。載體（約0.03pmol）與外源DNA的摩爾比大約1：3-1：10之間，根據(jù)載體與DNA片段的長(zhǎng)度，可算出需要的量。因?yàn)檩d體的大小一般在5kb-10kb，因此，嚴(yán)格的算出0.03pmol的

3、載體的質(zhì)量意義不大，大約100ng即可。如果時(shí)間比較緊張，可以25連接15min，之后可取5ul進(jìn)行轉(zhuǎn)化，剩余5ul于16繼續(xù)連接。三、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中從-70中取出感受態(tài)，指尖輕轉(zhuǎn)融化后立即插入冰上，5ul連接產(chǎn)物+100ul感受態(tài)大腸桿菌，充分混勻后冰浴30min，然后42熱激90s，熱激時(shí)不要晃動(dòng)EP管。然后立即插入冰上，靜置2min。（連接產(chǎn)物的量盡量不超過(guò)感受態(tài)體積的5%，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，從而得不償失。）在超凈臺(tái)中向EP管中加入700ul 無(wú)抗性LB培養(yǎng)基，然后37搖床培養(yǎng)45min-1h；4000rpm離心3min，在超凈臺(tái)中棄去700ul上清，然后輕輕吹打殘留的菌液

4、沉淀，涂平板；（涂平板的玻璃棒要在酒精燈上燒熱滅菌，后冷卻）37培養(yǎng)箱先正放15min，之后倒置培養(yǎng)12-16h。（超過(guò)16h，則陽(yáng)性克隆周圍會(huì)生出衛(wèi)星菌落，原因是陽(yáng)性克隆會(huì)分泌水解氨芐的酶到培養(yǎng)基中，水解其周圍的氨芐，因此，平板上的DH5、雜菌等會(huì)生長(zhǎng)。）四、重組子的挑取培養(yǎng)挑選單克隆到2ml LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)8-16h，可提質(zhì)粒。（要在管壁上部用注射器的針頭燒熱，戳個(gè)小洞，因?yàn)榇竽c桿菌是好氧的，無(wú)菌會(huì)生長(zhǎng)緩慢）其實(shí)在挑克隆培養(yǎng)的時(shí)候就可以PCR鑒定，先配好PCR反應(yīng)體系，在超凈臺(tái)中，同一個(gè)克隆，一半用于搖菌培養(yǎng)，一半用小的槍頭挑取在對(duì)應(yīng)的PCR體系里涮一下，即可作為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)

5、。PCR時(shí)要做陰性、陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照，用槍頭在沒(méi)有菌落的培養(yǎng)基上沾一下做模版（PCR靈敏度很高，要排除連接體系中的殘留的DNA對(duì)結(jié)果影響的可能），陽(yáng)性對(duì)照用最初PCR擴(kuò)增DNA片段時(shí)的模版。也可以等37培養(yǎng)8-16h之后取1ul菌液做模版鑒定，或者提質(zhì)粒之后，用質(zhì)粒做模版進(jìn)行鑒定，均可。五、質(zhì)粒的提取與電泳檢測(cè)1.在超凈臺(tái)中取300ul菌液與無(wú)菌EP管中，4保存，待鑒定是否成功后取100ul菌液+100ul 50%甘油保種，送200ul菌液到公司測(cè)序，不正確的丟掉即可。（如果質(zhì)粒量很多，也可以送5-10ul質(zhì)粒測(cè)序）2.取1ml菌液到新的EP管,12000 rpm離心30s，棄上清，再將70

6、0ul剩余菌液于同一EP管，12000 rpm離心30s，棄上清。然后瞬時(shí)離心，將殘留液體吸干。（槍頭不能重復(fù)使用）3.加入預(yù)冷的200ul溶液I(4低溫保存)。反復(fù)吹打混勻。（一定要混勻，不然會(huì)影響裂解效果，可以用渦旋混合器震蕩混勻）4.加入200ul溶液II，蓋緊管口，輕輕快速顛倒離心管3-5次。（不要?jiǎng)×艺鹗?，防止基因組DNA、質(zhì)粒斷裂，可以懸空加試劑，這樣不用換槍頭，而且比較快，下同）5.觀察到溶液變清后，立即加入預(yù)冷的200ul溶液III。顛倒3-5次，顛倒時(shí)用手指輕彈離心管底部，混勻。冰浴5min。12000rpm離心10min。6.取400ul上清至另一干凈的離心管中（盡量不要吸

7、到白色的沉淀物質(zhì)，如果效果不理想，可以轉(zhuǎn)移400ul上清至新離心管，12000rpm，5min，之后在轉(zhuǎn)移上清），加入500ul異丙醇，充分混勻。室溫放置2min，12000rpm離心10min。7.棄上清，加入700ul 75%的乙醇，輕輕顛倒兩次，12000rpm離心5min，重復(fù)操作一次。8.棄上清，然后瞬時(shí)離心，用Tip頭將殘留酒精吸干?？諝庵懈稍?0min。9.加入50-100ul Elution Solution(65預(yù)熱)溶解質(zhì)粒。10.取1ul質(zhì)粒，加9ul DDW，2ul 6*loading buffer，混勻電泳檢測(cè)質(zhì)粒濃度。六、酶切鑒定或者PCR檢測(cè)大約酶切1ug質(zhì)粒進(jìn)行

8、鑒定。如果質(zhì)粒含量太少，即便能夠切下目的條帶，也有可能看不到。（為了節(jié)約，鑒定時(shí)取0.25-0.5ul的酶，20ul體系，酶切30min-1h，即可電泳跑膠）PCR檢測(cè)，則將提取的質(zhì)粒稀釋10-100倍到適合做模版的濃度（taq酶的說(shuō)明書(shū)上有說(shuō)明），利用目的片段的引物，使用普通的taq酶PCR即可。注意事項(xiàng)：1.移液器使用結(jié)束后調(diào)回最大量程放歸遠(yuǎn)處。2.本實(shí)驗(yàn)屬于微量操作，用量極少的步驟必須嚴(yán)格注意吸取量的準(zhǔn)確性并確保樣品全部加入反應(yīng)體系中。3.不論是酶切還是連接反應(yīng)，加樣的順序應(yīng)該是，先加雙蒸水，其次是緩沖液和DNA，最后加酶。而酶液要在加入前從-20的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液時(shí)吸頭應(yīng)

9、從表面吸取，防止由于插入過(guò)深而使吸頭外壁沾染過(guò)多的酶液。取出的酶液應(yīng)立即加入反應(yīng)混合液的液面以下，并充分混勻。4.Ep管的蓋子應(yīng)蓋緊，防止水浴過(guò)程中水汽進(jìn)入管內(nèi)，并做好標(biāo)記以防樣品混淆。5.制備凝膠時(shí)，應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則溶液將會(huì)暴沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度。制膠時(shí)要除去氣泡。拔梳子時(shí)要特別小心，以防凝膠與支持物脫離。6.上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也不要快速擠出吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。7.紫外線對(duì)眼睛和皮膚均有傷害，對(duì)眼睛尤甚。觀察電泳條帶時(shí)要確保紫外光源得到適當(dāng)遮蔽，并應(yīng)戴好目鏡或眼罩，避免皮膚直接暴露在紫外線下。割膠回

10、收動(dòng)作要快，避免紫外照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使得DNA突變。8.實(shí)驗(yàn)中注意更換槍頭，以避免試劑的污染，懸空滴加試劑的話，可以連續(xù)使用。堿裂解法質(zhì)粒提取的原理溶液I，50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH/1% SDS；溶液III，3 M醋酸鉀/2 M醋酸。溶液I的作用葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒(méi)有任何影響。所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的

11、活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA，無(wú)非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒(méi)什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來(lái)懸浮菌體就可以了。有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。溶液II的作用這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無(wú)非是為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的

12、CO2而減弱了堿性。其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)镾DS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH

13、溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪MDNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩。溶液III的作用溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇

14、酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)

15、合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無(wú)法快速?gòu)?fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來(lái)是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來(lái)其實(shí)沒(méi)有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。質(zhì)粒檢測(cè)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬(wàn)不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開(kāi)環(huán)這三條帶。堿法抽提