生化分離技術復習

1、緒論.生化分離技術：是指從含有目標產物的發(fā)酵液、 酶反應液或動植物細胞培養(yǎng)液中， 提取、精制并加工制成高純度的、 符合規(guī)定要求的各種生物技術產品的技術， 又 稱為下游加工技術。生物技術產品： 是指在生產過程應用微生物發(fā)酵技術、 酶反應技術、 動植物細胞 培養(yǎng)技術等生化反應技術制得的產品。生物技術產品有哪些特點：生物技術產品有些是胞內產品，有些是胞外產物 ; 通 常是由產物濃度很低的發(fā)酵液或培養(yǎng)液中提取的 ; 生物技術產品的穩(wěn)定性差， 易 隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白質水解、自身水解等 ; 生物技 術產品的生產多為分批操作，生物變異性大，各批發(fā)酵液或培養(yǎng)液不盡相同。 生化分離技術

2、按其分離原理可分為機械分離與傳質分離兩大類。生化分離過程主要包括哪幾個方面？生化分離過程主要包括四個方面： 原料液 的預處理和固液分離；初步純化（提?。?；高度純化（精制）；產品加工這 四個步驟。第一章 固液分離技術 排斥電位和產生吸附架橋作用的雙重機制是絮凝的主要原因。 發(fā)酵液的相對純化方法有哪些？ 固液分離的目的：除去固體雜質，得到溶液；分離掉溶液獲得固體。 固液分離方法：過濾、沉降改善過濾性能的方法 工藝上一般采用如下方法： 降低混合液粘度、 增大被分離顆粒的粒度、 加入助濾劑、 提高離心機的轉速或提 高操作壓力、增大真空度、降低濾餅層厚度、除去濾餅 第二章 細胞破碎細胞破碎是指選用物理

3、、 化學、酶或機械的方法來破壞微生物菌體的細胞壁或細 胞膜，釋放其中的目標產物。細胞破碎的方法有哪些？各有何特點？一、球磨破碎 特點： 適用范圍較廣； 但有效能量利用率很低，設計操作時應 充分考慮冷卻系統(tǒng)的熱交換能力； 影響破碎率的操作參數(shù)較多， 過程優(yōu)化設計較 復雜。二、高壓勻漿法 特點：適用于酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎， 不宜用于團狀或 絲狀菌的破碎，易堵塞；由于操作中溫度會升高，需對料液作冷卻處理，保護目 的產物活性。三、超聲破碎法 特點：是很強烈的破碎方法；適用范圍廣；但有效能量利用率 極低，對冷卻要求相當苛刻，不易放大，多在實驗室使用。四、酶溶法 特點：不同的菌體細胞由于細胞壁化學組

4、成不同應選用不同的酶處 理。優(yōu)點：對設備的要求低，能耗?。怀樘岬乃俾屎褪章矢?；產品的完整 性好；對 pH 值和溫度等外界條件要求低； 由于細胞壁被溶解， 不殘留碎片， 有利于提純。但是酶溶法受酶的費用限制。酶溶法的缺點：溶酶價格高，溶酶法 通用性差，產物抑制的存在。五、化學破碎對產物釋放有一定的選擇性， 可使一些較小分子量的溶質如多肽和小分子 的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質仍滯留在胞內； 細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。通用性差；時間長，效率低；有些化學試劑有毒 。形成包含體的因素主要有以下幾個方面： 重組蛋白的表達率過高，超過了細菌的正常代謝，由于細菌的蛋白

5、水解 能力達到飽和，導致重組蛋白在細胞內沉淀下來；由于合成速度太快， 以致沒有足夠時間進行肽鏈折疊， 二硫鍵不能正確配 對，導致重組蛋白溶解度變?。坏鞍踪|的復性 復性是指變性的包涵體蛋白質在適當條件下使伸展的肽鍵形成特定三維 結構，使無活性的分子成為具有特定生物學功能的蛋白質。復性的方法： 稀釋復性、透析復性、超濾復性、層析柱復性、膨脹床吸附復性、溫度跳躍 式復性、雙水相法、反膠團法第 3 章 萃取和浸取技術 .用溶劑從溶液中抽提物質叫液 -液萃取，也稱溶劑萃取。經典的液 -液萃取指的是 有機溶劑萃取 .液-液萃取過程機理主要有以下四種類型：(1) 簡單分子萃取 (物理萃取 )(2) 中性溶劑

6、絡合萃取(3) 酸性陽離子交換萃取(4) 離子絡合萃取影響萃取操作的因素：a. 溫度 溫度互溶性增大；溫度產物穩(wěn)定性提高， 粘度增加，擴散性能減 小。b. pH 值 影響分配系數(shù)，影響物質解離情況c. 溶媒比 溶媒比溶媒體積 /萃取體積 溶媒比萃取效果溶媒回收費用 d. 鹽分 無機鹽類如硫酸銨、氯化鈉等一般可降低產物在水中的溶解度而 使其更易于轉入有機溶劑相中， 另一方面還能減小有機溶劑在水相中的溶 解度。鹽分 分配系數(shù) 帶溶劑是指能和產物形成復合物， 促使產物更易溶于有機溶劑相中， 在一定條件 下又要容易分解的物質。有機溶劑萃取的不足： 許多蛋白質都有極強的親水性，不溶于有機溶劑 ； 蛋白質

7、在有機溶劑相中易變性失活。雙水相萃取的優(yōu)點： 使固液分離和純化兩個步驟同時進行，一步完成； 適合熱敏物質的提取，主要是胞內酶； 親水性聚合物加入水中，形成兩相，在這兩相中，水分都占大比例( 85 95)，這樣生物活性蛋白質在兩相中不會失活，且以一定比例分配于兩 相中。影響雙水相萃取的因素1、聚合物及其相對的分子量同一聚合物的疏水性隨分子量增加而增加。32. pH 的影響3. 離子環(huán)境對蛋白質在兩相體系分配的影響4. 溫度的影響超臨界流體 （SCF）萃取是利用超臨界流體作為萃取劑， 對物質進行溶解和分離的過程。 超臨界流 體（SCF）是處于臨界溫度和臨界壓力以上的非凝聚性的高密度流體。什么是反膠

8、團？反膠團萃取的特點是什么？反膠團（reversed micelles）是表面活性劑在非極性有機溶劑中親水性基團自發(fā)地 向內聚集而成的，內含微小水滴的，空間尺度僅為納米級的集合型膠體。反膠團的微小界面和微小水相具有兩個特異性功能： 具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜的功能； 在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質等保持活性的功能。反膠團萃取技術的突出優(yōu)點 有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性； 分離、濃縮可同時進行，過程簡便； 能解決蛋白質（如胞內酶）在非細胞環(huán)境中迅速失活的問題； 表面活性劑往往具有細胞破壁功效， 可直接從完整細胞中提取具有活性的蛋白 質和酶； 成本低，溶劑可反復使用等。

9、第四章 沉淀技術影響蛋白質溶解度的外部因素主要有溫度、 pH、介電常數(shù)和離子強度。 影響蛋白質溶解度的主要因素分成蛋白質性質和溶液性質兩類。球狀蛋白質的表面多親水基團由于水化層和雙電層這兩種穩(wěn)定的因素， 使蛋白質溶液成為親水的膠體溶液。 由 于水化膜和雙電子層的存在， 蛋白質顆粒彼此不能接近， 因而增加了蛋白質溶液 的穩(wěn)定性，阻礙蛋白質膠粒從溶液中沉淀出來。生化分離純化中最常用的幾種蛋白質的沉淀方法是：鹽析法（中性鹽沉淀） 、有 機溶劑沉淀、選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀） 、等電點沉淀、有機聚 合物沉淀、聚電解質沉淀法、金屬離子沉淀法。 （任選三種）影響蛋白質鹽析沉淀的因素有哪些： 蛋

10、白質的濃度 中性鹽沉淀蛋白質時， 溶液中蛋白質的實際濃度對分離 的效果有較大的影響。 通常高濃度的蛋白質用稍低的硫酸銨飽和度即可將其沉淀 下來，但若蛋白質濃度過高， 則易產生各種蛋白質的共沉淀作用， 除雜蛋白的效 果會明顯下降。 對低濃度的蛋白質， 要使用更大的硫酸銨飽和度， 但共沉淀作用 小，分離純化效果較好，但回收率會降低。 pH 值對鹽析的影響 蛋白質所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。改變 pH 值可改變蛋白質的帶電性質，因而就改變了蛋白質的溶解度。遠離等電點處 溶解度大，在等電點處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質時， pH 值常選在該 蛋白質的等電點附近。 溫度的影響 溫度是影響溶解度

11、的重要因素， 對于多數(shù)無機鹽和小分子 有機物，溫度升高溶解度加大，但對于蛋白質、酶和多肽等生物大分子，在高離 子強度溶液中， 溫度升高， 它們的溶解度反而減小。 在低離子強度溶液或純水中 蛋白質的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的。多數(shù)蛋白質在有機溶劑與水的混合液中，溶解度隨溫度降低而下降。 低濃度樣品要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀， 且樣品的損失較大， 即回收率 低，具有生物活性的樣品易產生稀釋變性。有機溶劑沉淀法基本原理是什么？分析影響沉淀效果的因素。 主要是降低水 溶液的介電常數(shù)， 溶劑的極性與其介電常數(shù)密切相關， 極性越大，介電常數(shù)越大， 如 20時水的介電常數(shù)為 80 ，而乙醇和丙

12、酮的介電常數(shù)分別是 24 和 21.4，因而 向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)， 減小溶劑的極性， 從而削弱了溶 劑分子與蛋白質分子間的相互作用力， 增加了蛋白質分子間的相互作用， 導致蛋 白質溶解度降低而沉淀。 另一方面， 由于使用的有機溶劑與水互溶， 它們在溶解 于水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子， 破壞了蛋白質分子的水 膜，因而發(fā)生沉淀作用。溫度 多數(shù)蛋白質在有機溶劑與水的混合液中，溶解度隨溫度降低而下降。 樣品濃度 低濃度樣品要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀， 且樣品的損失較 大，即回收率低，具有生物活性的樣品易產生稀釋變性。但對于低濃度的樣品， 雜蛋白與樣品共沉

13、淀的作用小， 有利于提高分離效果。 高濃度的樣品， 可以節(jié)省 有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉淀作用大，分離效果下降。 pH 值 有機溶劑沉淀適宜的 pH 值，要選擇在樣品穩(wěn)定的 pH 值范圍內，而 且盡可能選擇樣品溶解度最低的 pH 值，通常是選在等電點附近，從而提高此沉 淀法的分辨能力。 離子強度 離子強度是影響有機溶劑沉淀生物大分子的重要因素。鹽濃度太 大或太小都有不利影響，通常溶液中鹽濃度以不超過 5為宜，少量的中性鹽對 蛋白質變性有良好的保護作用， 但鹽濃度過高會增加蛋白質在水中的溶解度， 降 低了有機溶劑沉淀蛋白質的效果，通常是在低鹽或低濃度緩沖液中沉淀蛋白質。 有機溶劑沉

14、淀法有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。第五章 吸附及離子交換什么是吸附？吸附的種類有哪些？ 利用吸附劑對液體或氣體中某一 （些 ）組分具有選擇性吸附的能力，使其富集 在吸附劑表面。實質是溶質從液相或氣相轉移到吸附劑表面的過程。物理吸附 吸附劑和吸附質之間的作用力是分子間引力（范德華力） 。 化學吸附 利用吸附劑與吸附質之間的電子轉移，生成化學鍵而實現(xiàn)物 質的吸附。交換吸附 吸附表面如為極性分子或離子所組成，則它會吸引溶液中帶 相反電荷的離子而形成雙電層，這種吸附稱為極性吸附。影響吸附的主要因素吸附劑的性質吸附質的性質溫度溶液 pH 值鹽濃度吸附物質的濃度與吸附劑量溶劑活性炭吸附溶質的量在未達到

15、平衡前一般隨溫度提高而增加， 對相對分子質量大 的化合物的吸附力大于相對分子質量小的化合物6 活性炭纖維與顆粒狀活性炭相比， 吸附與解吸速度快， 工作吸附容量較大， 外表 面積大； 固定床優(yōu)點：流體在介質層中基本上呈平推流，返混小，柱效率高。 缺點：無 法處理含顆粒的料液，因會堵塞床層，造成壓力降增大而最終使操作無法進行。 流化床優(yōu)點：壓降小，可處理高黏度或固體顆粒的粗料液；不需要特殊吸附劑， 設備操作簡單。缺點：存在嚴重的返混，特別是高徑比很小的流化床，使床層理 論塔板數(shù)降低，吸附劑的利用率低。吸附操作中引起固定床過早出現(xiàn) “穿透 ”現(xiàn)象的因素有哪些？如何處理？ 床層裝填不合理， 顆粒不均勻

16、等， 導致出現(xiàn)偏流現(xiàn)象， 需重新對吸附劑床 層進行裝填。操作過程不規(guī)范（如流速或壓力突然變化） ，使床層均勻程度受到破壞， 重新裝填吸附劑后，嚴格按操作規(guī)程進行操作。系統(tǒng)密閉性差， 或操作不合理床層內出現(xiàn)氣泡或分層現(xiàn)象。 進行密閉性檢 查，消除漏氣，消除氣泡及分層后，再進行正常工藝操作。料液濃度過高， 操作流速過大等。 對待處理料液進行適當稀釋， 合理確定 操作流速。離子交換技術： 是根據(jù)某些溶質能解離為陽離子或陰離子的特性， 利用離子交換 劑與不同離子結合力強弱的差異， 將溶質暫時交換到離子交換劑上， 然后用合適 的洗脫或再生劑將溶質離子交換下來， 使溶質從原溶液中得到分離、 濃縮或提純 的

17、操作技術。利用離子交換技術進行分離的關鍵是離子交換劑。在生物產品中， 分子通常較大， 在樹脂內部的擴散速度相對較慢， 其離子交換速 度常由內部擴散速度所控制。影響交換速度的因素顆粒大?。河≡娇?交聯(lián)度：交聯(lián)度小，交換速度快 溫度：越高越快離子化合價：化合價越高，交換越慢 離子大小：越小越快攪拌速度：在一定程度上，越大越快 溶液濃度：當交換速度為外擴散控制時，濃度越大，交換速度越快 被分離組分料液的性質： 溶液粘度越大，交換速度越小 樹脂被污染的情況： 不可逆吸附、 不溶性的物質堵塞， 離子交換容量下降， 交換速度會下降；水合離子半徑：半徑越小，親和力越大； 離子化合價：高價離子易于被吸附；

18、溶液 pH：影響交換基團和交換離子的解離程度，但不影響交換容量； 離子強度：越低越好； 交聯(lián)度、膨脹度、分子篩：交聯(lián)度大，膨脹度小，篩分能力增大；交聯(lián)度 小，膨脹度大，吸附量減少； 有機溶劑：使樹脂對有機離子的選擇性吸附降低，而容易吸附無機離子。 樹脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力； 強酸性陽離子樹脂含有大量的強酸性基團 解離能力強，不受溶液 pH 變化的影響，用強 酸進行再生處理弱酸性陽離子樹脂 比強酸性樹脂較易再生 洗脫：離子交換完成后， 將樹脂吸附的物質釋放出來重新轉入溶液的過程稱作洗 脫。洗脫是用親和力更強的同性離子取代樹脂上吸附的目的產物。 （a）改變溶液

19、 pH 值（酸、堿）（b）改變溶液離子強度（鹽 ） 洗脫劑應根據(jù)樹脂和目的產物的性質來選擇。洗脫過程是交換的逆過程， 洗脫條件應與交換條件相反， 如吸附在酸性條 件下進行， 洗脫應在堿性條件下進行； 洗脫流速應低于交換時的流速。 注 意洗脫過程 pH 對產物穩(wěn)定性的影響。 洗脫方式分為靜態(tài)洗脫和動態(tài)洗脫。什么是樹脂的毒化？樹脂毒化的主要因素有哪些？樹脂失去交換性能后不能用 一般的再生手段重獲交換能力的現(xiàn)象稱為樹脂的毒化。毒化的因素主要有大分子有機物或沉淀物嚴重堵塞孔隙、活性基團脫落、 生成不可逆化合物等， 重金屬離子也會對樹脂毒化。 對已毒化的樹脂用常規(guī)方法 處理后，再用酸、堿加熱到 4050

20、浸泡，以溶出難溶雜質；也可用有機溶劑 加熱浸泡處理。中毒的原因： 主要有大分子有機物或沉淀物嚴重堵塞孔隙， 中毒樹脂往往顏色 加深，甚至呈現(xiàn)棕色，乃至黑色；樹脂的活性基團脫落；生成不可逆化合物 或樹脂與氧長期接觸發(fā)生氧化等； 負載離子的交換勢極高， 通常的洗脫劑或再 生劑難以使其從活性基團上交換下來， 使其不能與其它離子交換而失效； 負載 離子發(fā)生了變化。如交換了 Fe3+的樹脂，當用堿性溶液處理時， Fe3+發(fā)生水解， 產生氫氧化鐵凝膠，沉積于樹脂孔隙中，造成堵塞。第六章 膜分離技術? 膜的分類按膜分離過程分 微濾、超濾、納濾、反滲透，按膜的材質分類 無機膜、有機膜不宜采用膜技術的分離過程具

21、有相似分子量的化合物的分離高滲透壓料液的高倍濃縮適宜考慮膜技術的分離過程有機物與無機鹽的分離、多糖低聚糖與單糖等的分離 稀溶液的濃縮，熱敏性料液的濃縮分子量相差 10 倍以上物質的分離（超濾） 料液的澄清過濾、冷除菌、除熱原 膜的劣化是由于膜本身的不可逆轉的質量變化而引起的膜性能的變化， 造成的原 因有如下三種：化學劣化、物理劣化、生物劣化。引起壓密的主要因素是操作壓力和溫度。壓力越高，壓密作用越大。 什么是濃差極化？簡述濃差極化的危害及預防措施。? 在膜分離過程中， 由于水和小分子溶質透過膜， 大分子溶質被截留而在膜 表面處聚積， 使得膜表面上被截留的大分子溶質濃度增大， 高于主體中大 分子溶質的濃度， 這種現(xiàn)象稱為濃差極化。 濃差極化可使膜的傳遞性能及 膜的處理能力迅速降低， 還可縮短膜的使用壽命。 主要表現(xiàn)為： 滲透壓 升高，滲透通量降低；截留率降低；膜面上結垢，使膜孔阻塞，逐漸喪失透過能力。在生產實際中，要盡可能消除或減少濃差極化現(xiàn)象的發(fā)生。? 濃差極化造成的滲透通量降低是可逆的， 通過改變膜分離操作方式， 提高 料液流速來減輕濃差極化現(xiàn)象。 錯流操作時， 料液與膜面平行流動， 料液 的流動可有效防止和減少被截留物質在膜面上的沉積。 流速增大， 靠近膜 面的濃度邊界層厚度減小， 將減輕濃差極化的影響， 有利于維持較高的滲 透