產(chǎn)品內(nèi)毒素檢查

1、浙江*藥業(yè)股份有限公司 SOP-QC-*內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1. 目 的：建立樣品中細菌內(nèi)毒素檢查方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范操作。2. 適用范圍：化驗室3. 有關(guān)責(zé)任：化驗室化驗員對本規(guī)程的實施負責(zé)，化驗室主任對本規(guī)程的有效執(zhí)行承擔(dān)監(jiān)督檢查責(zé)任。4. 程 序：本法系利用鱟試劑與細菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的機理，以判斷樣品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位EU表示。4.1試驗材料及工具4.1.1 分析天平4.1.2 電熱干燥箱（250）4.1.3 恒溫培養(yǎng)箱型號4.1.4 旋渦混合器4.1.5 微量移液器 2001000l 50200l4.1.6 無熱源吸頭 大號、小號、試管

2、架、封口膜4.1.7 鱟試劑 （應(yīng)具有國家主管部門的批準(zhǔn)文號，我公司常用湛江安度斯）4.1.8 細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）4.1.9 細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品4.1.10 無熱源的小試管1075mm或無熱源安瓿4.1.11 無熱源的小試管15100mm及無熱源的藥匙4.2 操作方法4.2.1 實驗準(zhǔn)備將所有玻璃器皿及藥匙用洗液（包括三效滅活劑）浸泡4小時以上，用清水及純化水沖洗后，置250電熱干燥箱中干熱滅菌30分鐘以上。試驗過程中應(yīng)防止微生物的污染。4.2.2供試品溶液制備精密稱定樣品20mg于無熱源的15100mm小試管中，加混合液（280mg 96%乙醇溶液+650mg 聚氧乙烯蓖麻油）

3、2ml，置自動旋渦混合器中30秒使樣品溶解后，再用BET水稀釋成1mg/ml樣品原液（C），置自動旋渦混合器中混和30秒。根據(jù)L值（限值），確定樣品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）：MVD= c L / 式中： L 為供試品的細菌內(nèi)毒素限值；c 為供試品溶液濃度； 為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml).例：L值為2EU/mg，鱟試劑的靈敏度為0.125EU/ml。 2EU/mgC 2EU/mg1mg/mlMVD= = = 16倍 0.125EU/ml吸取樣品原液（濃度為1mg/ml）按如下表1稀釋制得供試品溶液：表1L值MVD原液體積加BET水量（=總體積吸原液體積）供試品溶液總體積2 E

4、U/g160.1 ml1.5 ml1.6 ml4.2.2 內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值，取細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，加入1ml BET水，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘，然后制成所需濃度的細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（2）每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒。例：細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為50EU/支，加BET水1ml即50EU/ml，如鱟試劑靈敏度為0.125，那么細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)當(dāng)為20.125=0.25 即0.25EU/ml。應(yīng)按以下方式進行稀釋： 0.3ml 0.5ml 1ml 1ml 1ml50EU/ml 5EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.

5、25EU/ml 0.125EU/ml2.7ml 2.0ml 1ml 1ml 1ml 4 2 4.2.4 凝膠限度試驗在制備內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的同時，取鱟試劑8支，按表2制備溶液A、B、C、D。編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)備注A無/供試品溶液2供試品溶液B2/供試品溶液2供試品溶液陽性對照C2/ BET水2陽性對照D無/ BET水2陰性對照A: 鱟試劑加0.1mlBET水復(fù)溶，再加入0.1ml供試品溶液，為供試品管； B: 鱟試劑加入0.1ml供試品溶液復(fù)溶，再加2內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，為供試品陽性對照管，即（PPC管）；C: 鱟試劑加0.1mlBET水復(fù)溶，再加入0.1ml 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶

6、液，為陽性對照管；D: 鱟試劑加0.1mlBET水復(fù)溶，再加入0.1ml BET水，為陰性對照管。加樣結(jié)束后，封口，放入371的恒溫裝置內(nèi)保溫602分鐘后觀察結(jié)果。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180時，管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（-）。結(jié)果判斷：若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定（小于L值）。若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，

7、需進行復(fù)試。復(fù)試時溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。5. 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗5.1實驗準(zhǔn)備 玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用純化水反復(fù)沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放入250電熱干燥箱干熱滅菌30分鐘以上。達到規(guī)定時間后，關(guān)斷電源，待干燥箱溫度自然降至室溫。在不打開金屬容器的情況下，可在兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則須再次干熱滅菌30分鐘以上除去可能存

8、在的外源性內(nèi)毒素。5.2鱟試劑靈敏度復(fù)核5.2.1細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按照標(biāo)準(zhǔn)品說明書，加入規(guī)定量的細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即2、0.5、0.25（為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。5.2.2.待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精

9、棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。5.2.3.加樣將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分別加入0.1ml的2、0.5、和0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水。5.2.4.反應(yīng)：加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入371水浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫602分鐘。5.2.5.觀察并記錄結(jié)果：將試管架從水浴中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180觀察，

10、管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；未形成凝膠或形成凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（）。5.2.6 判斷依據(jù)：如最大濃度2,4管均為陽性，最低濃度0.25,4管均為陰性，陰性對照為陰性時實驗為有效，按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（c）。c= antilg(X/4) 式中X - 反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。當(dāng)c在0.52（包括0.5和2）時判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，可用于干擾實驗和供試品細菌內(nèi)毒素檢查，并以（標(biāo)示靈敏度）為該批鱟試劑的靈敏度。5.3.

11、再試驗：當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。5.4 注意事項：新購入鱟試劑，BET水，細菌內(nèi)毒素工作對照品都需做鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。6. 干擾試驗6.1目的：通過比較鱟試劑在內(nèi)毒素水溶液和內(nèi)毒素供試品溶液中反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對細菌內(nèi)毒素檢查有干擾。6.2. 試驗程序6.2.1. 內(nèi)毒素限值L值例：內(nèi)毒素的限值L值為2EU/g。6.2.2. 選擇：鱟試劑靈敏度 = 0.125 EU/ml6.2.3.確定供試品的最大有效稀釋倍數(shù) MVD=2/0.125=16 6.2.4.制備：6.2.4.1 鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照

12、系列：2、0.5、0.25內(nèi)毒素水溶液Es系列取1支細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后稀釋制成4個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2、0.5、0.25，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒。6.2.4.2 干擾試驗系列：2、0.5、0.25內(nèi)毒素供試品溶液Et系列（用供試品稀釋液代替BET水對內(nèi)毒素進行稀釋）將供試品稀釋初篩試驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液另取1支細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個濃度即2、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。稀釋方法同上。6.2.5 操作 取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑30支，輕彈壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒

13、精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。l TAL+BET水（NC），平行2管將準(zhǔn)備好的鱟試劑取其中2支（管）放在試管架上，排成1列，1列2支（管），每支分別加入0.1ml檢查用水作為陰性對照；l TAL+Es系列，平行2管將準(zhǔn)備好的鱟試劑取其中8支（管）放在試管架上，排成4列，每列2支（管），每支分別加入0.1ml的2、0.5、0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列；l TAL+供試品溶液（NPC），平行4管將準(zhǔn)備好的鱟試劑取4支（管）鱟試劑放在試管架上，排成1列4支（管），每支（管）分別加入0.1ml供試品溶液作為供試品溶液；l TAL+Et系列，平行4管將準(zhǔn)備好的鱟試劑另取16支（管）鱟試劑放在試管架上，排成4列，每列4支（管），每支分別加入0.1ml的含2、0.5、0.25的內(nèi)毒素的供試品溶液，為干擾試驗系列。反應(yīng)：加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。6.2.7.結(jié)果判斷：試驗有效：NC管全部陰性（- -），NPC管全部陰性（- - - -）TAL+Es系列：2管全部陽性（+ + ），0.25管全部陰性（- -）TAL+Et系列：2管全部陽性（+ + + +），0.25管全部陰性（-